E. Giordano 16/09/2010

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1 GRUPPO NAZIONALE DI BIOINGEGNERIA XXIX Scuola Annuale BIOLOGIA SINTETICA Bressanone settembre /41 COSTITUENTI MOLECOLARI DELLO CHASSIS CELLULARE Emanuele GIORDANO II Facoltà di Ingegneria Dipartimento di Biochimica G. Moruzzi Laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare Università di Bologna Campus di Cesena 2/41 Bressanone GNB

2 Espressione genica nei batteri e negli eucarioti 3/41 Batterio Eucariote DNA Nucleo RNA polimerasi RNA precursore RNA polimerasi Maturazione* mrna polipeptide ribosoma citoplasma Nei batteri, l mrna sintetizzato dalla RNA polimerasi non deve subire una maturazione prima di essere tradotto dai ribosomi. Inoltre, dato che non c è una membrana nucleare, la traduzione dell mrna può avere inizio mentre la trascrizione è ancora in corso, determinando l accoppiamento della trascrizione e della traduzione. Negli eucarioti, il trascritto primario di RNA è una molecola di mrna precursore (premrna), che viene processato nel nucleo attraverso (*) l aggiunta di un cappuccio all estremità 5 e di una coda di poli(a) all estremità 3, e la rimozione degli introni. La traduzione può avvenire solo quando l mrna maturo sia stato trasportato nel citoplasma. 4/41 Bressanone GNB

3 5/41 Il flusso dell informazione contenuta nel DNA 6/41 Il flusso dell informazione contenuta nel DNA Bressanone GNB

4 7/41 La trascrizione è il processo di copia in forma di RNA di una specifica sequenza di interesse (gene) in un filamento del duplex di DNA. 8/41 In breve, le caratteristiche della molecola di RNA sono: singolo filamento; ribosio (non desossiribosio); uracile (non timina). Bressanone GNB

5 9/41 Esistono quattro tipi principali di molecole di RNA, ciascuna codificata da un gene specifico, ma solo uno di essi viene tradotto: mrna (RNA messaggero), che codifica per la sequenza di amminoacidi di un polipeptide. Gli mrna sono i trascritti dei geni che codificano per proteine. La traduzione di un mrna produce un polipeptide. rrna (RNA ribosomiale) che, insieme alle proteine ribosomiali, costituisce i ribosomi le strutture nelle quali viene tradotto l mrna. trna (RNA di transferimento), che porta gli amminoacidi al ribosoma durante la traduzione. snrna (small nuclear RNA; piccolo RNA nucleare) che, insieme a proteine, forma complessi che vengono usati nella maturazione degli RNA eucariotici per produrre mrna funzionali. 10/41 Diversamente dal DNA, l mrna è una molecola instabile, destinata a un utilizzo temporaneo. Le dinamiche della sua sintesi/degradazione determinano la presenza/assenza nella cellula del prodotto attivo di ogni specifico gene. Il numero di copie di mrna trascritte (e l efficienza della loro successiva traduzione) determina l abbondanza di tale prodotto. La regolazione della trascrizione del DNA è una fase dell espressione genica. Bressanone GNB

6 L espressione genica 11/41 12/41 Promotore, sequenza che codifica per l RNA e regione del terminatore di un gene. Il promotore si trova a monte della sequenza codificante, il terminatore a valle. La sequenza codificante inizia con il nucleotide +1. Gene Promotore Sequenza codificante per l RNA Terminatore DNA Filamento non-stampo Filamento stampo Sito di inizio della trascrizione Sito di terminazione della trascrizione A monte del gene A valle del gene Bressanone GNB

7 13/41 RNA polimerasi Promotore Sito di inizio della trascrizione Ibrido DNA-RNA Direzione della trascrizione Filamento non-stampo Filamento stampo Il processo di trascrizione. La doppia elica del DNA viene denaturata dall RNA polimerasi nei procarioti, (e da altre proteine negli eucarioti). L RNA polimerasi catalizza quindi la sintesi di una catena di RNA a singolo filamento, a partire dal punto di inizio della trascrizione. La catena di RNA viene sintetizzata in direzione 5-3, utilizzando solo un filamento del DNA come stampo che ne stabilisce la sequenza di basi. 14/41 Il flusso dell informazione contenuta nel DNA Bressanone GNB

8 Nei batteri è presente solo un tipo di RNA polimerasi (DNAdipendente), quindi tutte le classi di geni (geni che codificano per proteine, geni per i trna, e geni per gli rrna) vengono trascritte da questo enzima. L inizio della trascrizione di un gene richiede una forma di RNA polimerasi chiamata oloenzima (o enzima completo). L oloenzima è formato dal nucleo enzimatico dell RNA polimerasi, costituito da due polipeptidi a, un polipeptide b e uno b, legato a un altro polipeptide chiamato fattore sigma (σ). Il fattore sigma assicura che l RNA polimerasi si leghi in maniera stabile solo ai promotori. 15/41 Direzione della trascrizione 16/41 Direzione della trascrizione Nella maggior parte dei promotori dei geni di E. coli sono presenti due sequenze di DNA fondamentali per specificare l inizio della trascrizione. Queste sequenze si trovano generalmente in posizione 35 e 10, cioè 35 e 10 coppie di basi a monte rispetto al punto di inizio della trascrizione, indicato con +1. La sequenza di consenso (cioè la sequenza che si trova con frequenza maggiore in ciascuna posizione) per la regione 35 (la box 35) è 5 -TTGACA-3. La sequenza consenso per la regione 10 (chiamata anche Pribnow box) è 5 -TATAAT-3. Bressanone GNB

9 17/41 L RNA polimerasi inizia direttamente la trascrizione [non necessita della presenza di un innesco (primer)] e polimerizza i nucleotidi in direzione 5 3. Ciò vale qualsiasi sia il filamento stampo nel duplex a DNA: l RNA polimerasi puo adoperare come stampo l uno o l altro dei filamenti. 18/41 La reazione chimica catalizzata dall RNA polimerasi e coinvolta nella sintesi di RNA utilizzando come stampo il filamento di DNA. Catena di RNA in allungamento Filamento di DNA stampo Formazione del legame fosfodiesterico RNA polimerasi Ribonucleoside trifosfato in ingresso Direzione di allungamento (5-3 ) della catena Allungamento della catena Bressanone GNB

10 19/41 L azione dell RNA polimerasi di E. coli nelle fasi di inizio della trascrizione. Nella fase di inizio, l oloenzima dell RNA polimerasi riconosce dapprima la regione 35 del promotore e quindi lo lega interamente. RNA polimerasi Promotore Complesso del promotore chiuso Sequenza codificante Fattore σ Mentre la fase di inizio procede, l RNA polimerasi si lega più strettamente al promotore a livello della regione 10; lo srotolamento localizzato del DNA in quella regione accompagna l evento. A questo punto, l RNA polimerasi è orientata nel modo corretto per iniziare la trascrizione in posizione Nucleotide d inizio Complesso del promotore aperto 20/41 L azione dell RNA polimerasi di E. coli nella fase di allungamento della trascrizione. Dopo la polimerizzazione di otto/nove nucleotidi, il fattore sigma si dissocia dal nucleo enzimatico. Direzione della trascrizione Mentre l RNA polimerasi allunga la nuova catena di RNA, l enzima srotola il DNA a valle, mantenendo una bolla di trascrizione a singolo filamento che comprende circa 25 paia di basi. Circa 9 basi del nuovo RNA sono legate al DNA a singolo filamento nella bolla di trascrizione, e il rimanente esce dall enzima sotto forma di filamento singolo. Ibrido DNA-RNA Filamento stampo Fattore σ rilasciato RNA in allungamento Promotore Sequenza codificante Bressanone GNB

11 21/41 Promotore, sequenza che codifica per l RNA e regione del terminatore di un gene. Il promotore si trova a monte della sequenza codificante, il terminatore a valle. La sequenza codificante inizia con il nucleotide +1. Gene Promotore Sequenza codificante per l RNA Terminatore DNA Filamento non-stampo Filamento stampo Sito di inizio della trascrizione Sito di terminazione della trascrizione A monte del gene A valle del gene Sequenza di un terminatore (tipo I) 22/41 Simmetria bipartita Stampo (DNA) Trascritto (RNA) Il trascritto si ripiega formando la forcina di terminazione Bressanone GNB

12 23/41 Negli eucarioti, la trascrizione dei geni per i quattro tipi principali di RNA è effettuata da tre RNA polimerasi differenti. L RNA polimerasi I, localizzata nel nucleolo, catalizza la sintesi di tre degli RNA che si trovano nei ribosomi: le molecole di rrna 28S, 18S, e 5,8S. (I valori S indicano il coefficiente di sedimentazione delle molecole di rrna durante la centrifugazione, e danno un indicazione molto approssimativa del peso molecolare.) L RNA polimerasi II, localizzata nel nucleoplasma, sintetizza gli RNA messaggeri (mrna) e alcuni piccoli RNA nucleari (snrna). L RNA polimerasi III, che si trova anch essa nel nucleoplasma, sintetizza: (1) gli RNA di trasferimento (trna); (2) l rrna 5S, una piccola molecola di rrna presente in tutti i ribosomi; e (3) gli snrna non sintetizzati dall RNA polimerasi II. Tutte le RNA polimerasi eucariotiche sono costituite da più subunità. Per esempio, l RNA polimerasi II del lievito è formata da 12 subunità 24/41 Negli eucarioti inoltre, il reclutamento dell RNA polimerasi richiede l assemblaggio coordinato e sequenziale di numerosi fattori trascrizionali. Bressanone GNB

13 25/41 A seguito dell interazione tra un fattore di trascrizione (TF) e la sua sequenza di consenso, il TF determina una distorsione della topologia del duplex che lo renderà accessibile al complesso trascrizionale. 26/41 Negli eucarioti l inizio della trascrizione richiede la presenza di ulteriori, spesso numerose, proteine attivatrici. Bressanone GNB

14 Struttura generale dell mrna batterico e delle cellule eucariotiche. 27/41 Regione nontradotta in 5 Sequenza codificante Regione nontradotta in 3 Sito di inizio della traduzione Sito di fine della traduzione 28/41 Successione delle fasi di maturazione dell mrna eucariotico (non tutte le fasi sono necessarie per tutti gli mrna) Sequenza codificante DNA Promotore Trascrizione da parte dell RNA polimerasi II. Il cappuccio in 5 viene aggiunto quando sono stati sintetizzati nucleotidi del pre-mrna. Aggiunta della coda di poli(a) in 3. CAP Esone Introne Esone Introne Esone Coda di poli(a) Pre-mRNA Splicing: rimozione degli introni mrna Traduzione (sintesi proteica) Polipeptide Bressanone GNB

15 29/41 Successione delle fasi di maturazione dell mrna eucariotico (non tutte le fasi sono necessarie per tutti gli mrna) Sequenza codificante DNA Promotore Trascrizione da parte dell RNA polimerasi II. Il cappuccio in 5 viene aggiunto quando sono stati sintetizzati nucleotidi del pre-mrna. Aggiunta della coda di poli(a) in 3. CAP Esone Introne Esone Introne Esone Coda di poli(a) Pre-mRNA Splicing: rimozione degli introni mrna Traduzione (sintesi proteica) Polipeptide 30/41 Successione delle fasi di maturazione dell mrna eucariotico (non tutte le fasi sono necessarie per tutti gli mrna) Sequenza codificante DNA Promotore Trascrizione da parte dell RNA polimerasi II. Il cappuccio in 5 viene aggiunto quando sono stati sintetizzati nucleotidi del pre-mrna. Aggiunta della coda di poli(a) in 3. CAP Esone Introne Esone Introne Esone Coda di poli(a) Pre-mRNA Splicing: rimozione degli introni mrna Traduzione (sintesi proteica) Polipeptide Bressanone GNB

16 31/41 Successione delle fasi di maturazione dell mrna eucariotico (non tutte le fasi sono necessarie per tutti gli mrna) Sequenza codificante DNA Promotore Trascrizione da parte dell RNA polimerasi II. Il cappuccio in 5 viene aggiunto quando sono stati sintetizzati nucleotidi del pre-mrna. Aggiunta della coda di poli(a) in 3. CAP Esone Introne Esone Introne Esone Coda di poli(a) Pre-mRNA Splicing: rimozione degli introni mrna Traduzione (sintesi proteica) Polipeptide 32/41 Alanina Ala A Cisteina Cys C Acido aspartico Asp D Acido glutammico Glu E Fenilalanina Phe F Glicina Gly G Istidina His H Isoleucina Ile I Lisina Lys K Leucina Leu L Metionina Met M Asparagina Asn N Prolina Pro P Glutammina Gln Q Arginina Arg R Serina Ser S Treonina Thr T Valina Val V Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Elenco dei 20 amminoacidi che vengono utilizzati durante la sintesi proteica. A sinistra il loro nome, a destra la simbologia corrispondente a 3 e 1 lettera. Bressanone GNB

17 33/41 Il codice genetico è costituito da 64 codoni. Una tripletta, codificante per Met, è il segnale che indica l inizio del quadro di lettura della sequenza di mrna. Tre triplette che non codificano per alcun amminoacido rappresentano il segnale di arresto. 60 rimanenti triplette completano la codifica dei restanti 19 amminoacidi. Come si nota quindi, alcuni di essi vengono specificati da numerose (fino a 6) triplette distinte. Il codice è universale, cioè condiviso da tutte le specie viventi. Tuttavia non è affatto detto che tutti i codoni per uno specifico amminoacido vengano utilizzati con la stessa probabilità di occorrenza in ogni specie. 34/41 I trna hanno il ruolo di far corrispondere alle triplette (codoni) dell mrna il corretto amminoacido, mediante la corrispondenza con il loro anticodone. Bressanone GNB

18 35/41 La sintesi dei polipeptidi avviene nel ribosoma, un organello che ogni cellula possiede a migliaia. Il ribosoma lega gli mrna e ne facilita l interazione con i trna per consentire la sintesi di una catena polipeptidica. 36/41 Una caratteristica sequenza della regione non-tradotta in 5 dell mrna (Shine-Dalgarno, RBS = ribosome binding site), posizionata 8-12 nucleotidi prima della tripletta (codone) di inizio AUG, indirizza il corretto legame della subunità minore del ribosoma all mrna. Bressanone GNB

19 37/41 38/41 Bressanone GNB

20 39/41 La formazione del legame peptidico tra due amminoacidi viene catalizzata dall attività peptidiltransferasica ribosomiale 40/41 Bressanone GNB

21 41/41 Bressanone GNB