Chlamydia trachomatis IgM

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1 DCM016i-1 Ed. 02/2013 Chlamydia trachomatis IgM per solo uso di ricerca Test immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgM diretti contro Chlamydia trachomatis nel siero e plasma umano RUO LOT Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKI016 DESTINAZIONE D USO Il kit ELISA Diametra Chlamydia trachomatis IgM è un metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgM diretti contro Chlamydia trachomatis nel siero o plasma umano. Il kit Chlamydia trachomatis IgM è destinato al solo uso di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO Le Clamidie sono batteri non mobili, Gram-negativi e a crescita intracellulare obbligatoria che formano caratteristiche inclusioni all'interno del citoplasma delle cellule parassitate. Sono facilmente visibili al microscopio ottico. Sono note tre specie di Clamidie diverse come patogeni per l'uomo: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae e Chlamydia psittaci, e solo una specie è patogena per gli animali (C. pecorum). Chlamydia trachomatis è l'agente causante principale delle malattie a trasmissione sessuale in tutto il mondo ( milioni di casi) e il numero di infezioni è in costante crescita. Le donne in gravidanza con infezione da Chlamydia trachomatis possono trasmettere questi batteri durante il parto, causando nei neonati congiuntivite o polmonite. I casi non trattati di infezione da Clamidia possono portare a salpingite cronica, con possibile conseguenza di gravidanza ectopica o infertilità. Nei maschi, C. trachomatis è la principale causa di uretriti non gonococciche. Un problema grave nelle infezioni da Clamidia è il frequente e insidioso decorso asintomatico che può comportare l'avvio di malattie croniche. In molti casi le infezioni primarie non vengono riconosciute e solo le sequele causate da agenti ascesi persistenti vengono diagnosticate. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il kit Diametra Chlamydia trachomatis IgM è un metodo immunoenzimatico (ELISA). I campioni dei pazienti sono diluiti con il diluente per campioni e inoltre incubati con IgG-RF-Sorbent, contenente anticorpi di classe IgG iper-immuni per eliminare l'inibizione competitiva da IgG specifiche e per eliminare i fattori reumatoidi. Questo pretrattamento evita risultati falsi negativi o falsi positivi. I micropozzetti della fase solida sono rivestiti con antigeni di Clamidia. I campioni diluiti dei pazienti e i controlli pronti per l'uso sono pipettati in questi pozzetti. Durante l'incubazione, gli anticorpi specifici contro Clamidia dei campioni positivi e dei controlli si legano agli antigeni immobilizzati. Dopo la fase di lavaggio che rimuove il campione e il materiale di controllo non legato, vengono dispensati nei pozzetti anticorpi umani anti IgM coniugati a perossidasi di rafano. Durante una seconda incubazione questi anticorpi si legano specificamente agli anticorpi IgM con conseguente formazione di immunocomplessi enzimatici. Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, gli immunocomplessi formati (in caso di risultato positivo) vengono individuati mediante incubazione con il substrato TMB e lo sviluppo di un colore blu. Il colore blu si trasforma in giallo dopo aver stoppato la reazione enzimatica con acido solforico. L'intensità di questo colore è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi IgM specifici per Chlamydia trachomatis nel campione del paziente. L'assorbanza a 450 nm viene letta con un lettore di piastre ELISA. 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit 1. Controls (3 flaconi, pronti all'uso) Negative Control (2 ml) REF DCE045/01601i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/01602i-0 Cut-off Control (2 ml) REF DCE045/01603i-0 2. Conjugate (1 flacone, 20 ml) Anticorpi anti IgM umane coniugati con perossidasi REF DCE002/01602i-0 3. Coated Microplate (1 micropiastra breakable coattata con antigeni di Chlamydia trachomatis) REF DCE002/01603i-0 4. TMB Substrate (1 flacone, 14 ml) H 2 O 2 -Tetrametilbenzidina (TMB) (evitare il contatto con la pelle) REF DCE004/01604i-0 5. Stop Solution (1 flacone, 14 ml) Acido Solforico 0,2 mol/l (evitare il contatto con la pelle) REF DCE005/01605i-0

2 6. 20X Conc Wash Solution (1 vial, 30 ml) Contiene preservante privo di mercurio REF DCE007/01607i-0 7. Sample diluent (1 vial, 100 ml) Soluzione tampone a ph 7.2 REF DCE053/01653i-0 8. IgG-RF-Sorbent (1 vial, 6,5 ml) Contiene anticorpi anti IgG umane REF DCE033/01633i Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata Materiale e strumentazione ausiliari Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm). Note Conservare tutti i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Una volta aperto, il kit mantiene la sua funzionalità per 2 mesi se conservato a 2-8 C. Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare. 4. AVVERTENZE Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri Umani o Animali. Usare i previsti dispositivi di protezione individuale mentre si lavora con i reagenti forniti. Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per la manipolazione di prodotti derivati da sangue. Tutti i reattivi di origine umana usati nella preparazione dei reagenti sono stati testati e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi anti- HIV 1&2, per HbsAg e per anticorpi anti-hcv. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Calibratori ed i Controlli devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Sodio Azide (NaN 3 ) o di Proclin 300 R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. La Sodio Azide può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi; inoltre, può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, lasciar scorrere grandi quantità di acqua per prevenire la formazione di azidi. Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la soluzione. 5. PRECAUZIONI Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati presentati qui sono stati ottenuti usando specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per l Uso. Tutti i reattivi devono essere conservati a temperatura controllata di 2-8 C nei loro contenitori originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Prima dell uso lasciare tutti i componenti dei kit e i campioni a temperatura ambiente (22-28 C) e mescolare accuratamente. Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi. Devono essere osservate le date di scadenza riportate sulle etichette della scatola e di tutte le fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di scadenza. Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso. Per evitare il time shifting durante la dispensazione degli reagenti, il tempo di dispensazione dei pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in ogni piastra. L addizione del TMB Substrato dà inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l addizione della Stop Solution. L addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per evitare tempi di reazione differenti. Osservare le linee guida per l esecuzione del controllo di qualità nei laboratori clinici testando controlli e/o pool di sieri. Osservare la massima precisione nella ricostituzione e dispensazione dei reagenti. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, altamente lipemici o emolizzati. I lettori di micropiastre leggono l assorbanza verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparazione della Wash Solution Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 20X con acqua distillata; ad esempio per preparare 600 ml di soluzione di lavaggio diluita aggiungere 30 ml di

3 soluzione di lavaggio 20X a 570 ml di acqua distillata. Se la "20X Wash Solution" presenta i cristalli, scioglierli scaldando il flacone in acqua calda a 37 C prima dell'uso. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 mese a 2-8 C Preparazione del Campione Il kit ELISA Diametra Chlamydia trachomatis IgM può essere utilizzato con siero o plasma (EDTA-, eparina e citrato-plasma) umano. Prima di essere analizzato, ogni campione deve essere diluito con il Sample Diluent e successivamente incubato con IgG-RF-Sorbent per l'assorbimento dei Fattori Reumatoidi, secondo la seguente procedura: 1. Diluire ogni campione 1:51 con il Sample Diluent e mescolare bene (per esempio, aggiungere 10 µl di campione a 0,5 ml di Sample Diluent). 2. Diluire il campione prediluito 1:2 con l'igg-rf- Sorbent e mescolare bene (per esempio, aggiungere 60 µl di campione prediluito a 60 µl di IgG-RF-Sorbent). 3. Lasciare riposare per almeno 15 minuti a temperatura ambiente o per tutta la notte a 2-8 C e mescolare bene di nuovo. 4. Prelevare 100 µl di questo campione pretrattato per il test. I controlli sono pronti all'uso e non devono essere diluiti! Per ottenere il siero, raccogliere il sangue venoso, far coagulare e separare il siero centrifugando a temperatura ambiente. Non centrifugare prima che la coagulazione sia completata. I pazienti trattati con terapia anticoagulante possono richiedere un tempo di coagulazione più lungo. Per ottenere il plasma, il sangue intero deve essere raccolto in provette contenenti anti-coagulante e centrifugati subito dopo la raccolta. Non usare campioni emolitici, itterici o lipemici. I campioni devono essere chiusi e possono essere conservati per un massimo di 3 giorni a 2-8 C prima di essere analizzati. Per conservazioni più lunghe, tenere i campioni congelati a -20 C prima del dosaggio; congelare una sola volta. I campioni scongelati devono essere miscelati bene prima della prova Procedura Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28 C). Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate a 2-8 C. Per evitare potenziali contaminazioni microbiche e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei flaconi originali. Al fine di aumentare l accuratezza dei risultati del test è necessario operare in doppio, allestendo due pozzetti per ogni Controllo, due per ogni Campione ed uno per il Bianco. Reagente Controlli Campione Bianco Controlli (Neg, Pos, 100 µl Cut-Off) Campione diluito 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 1 ora a 37 C. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. Nota importante: la sensibilità e la precisione di questo kit sono fortemente influenzate dal corretto svolgimento della procedura di lavaggio! Conjugate 100 µl 100 µl Incubare 30 minuti a temperatura ambiente (22-28 C). Non esporre alla luce solare diretta. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubare 15 minuti al buio a temperature ambiente (22-28 C). Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Agitare delicatamente la micropiastra. (Nota: campioni altamente positivi possono causare precipitati scuri del cromogeno!) Leggere l'assorbanza (E) a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm o contro il Bianco entro 30 minuti dopo l'aggiunta della Stop Solution. Misurazione: Settare il lettore di micropiastra ELISA a zero usando il bianco. Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può essere regolato a zero usando il bianco, sottrarre il valore di assorbanza del bianco a tutti i valori delle altre assorbanze misurate in modo da ottenere risultati attendibili! Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e registrare tutti i valori di assorbanza di ogni controllo e campione. Si raccomanda una lettura a doppia lunghezza d'onda utilizzando 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile calcolare la media delle assorbanze di tutti i duplicati.

4 7. CONTROLLO QUALITA Si raccomanda di utilizzare i controlli secondo le norme statali e federali. L'uso di controlli è consigliato per assicurare la validità dei risultati durante i test. Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico. Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi per la valutazione della qualità nazionali o internazionali, al fine di assicurare l'accuratezza dei risultati. Se i risultati del test non rientrano nei range di accettazione dei controlli, i risultati devono essere considerati non validi. In questo caso, si prega di consultare i seguenti parametri tecnici: pipettaggio e apparecchiature di cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei reagenti, metodi di conservazione e condizioni di incubazione, aspirazione e lavaggio. Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile alcun errore, contattare il proprio distributore o Diametra direttamente. 8. RISULTATI 8.1. Validazione del dosaggio Il dosaggio può essere considerato valido se sono soddisfatti i seguenti criteri: Assorbanza (OD) Bianco minore di 0,100 Controllo Negativo minore di 0,200 Controllo Cut-off compresa tra 0,350-0,850 Controllo Positivo compresa tra 0,650-3, Calcolo dei risultati Valore medio di assorbanza del Controllo Cut-off (CO) Calcolare il valore medio di assorbanza dei due valori del controllo Cut-off ottenuti. Esempio: (0,49 + 0,51): 2 = 0,50 = CO 8.3. Interpretazione dei risultati POSITIVO Assorbanza media del paziente oltre il 10% al di sopra del CO (Media OD paziente > 1.1 x CO) ZONA INCERTA Assorbanza media del paziente dal 10% sopra al 10% sotto il CO: ripetere il test 2-4 settimane dopo con un campione fresco del paziente (0.9 x CO Media OD paziente 1.1 x CO) Risultato nel second test ancora nella zona incerta NEGATIVO NEGATIVO Assorbanza media del paziente oltre il 10% al di sotto del CO (Media OD paziente < 0.9 x CO) Risultati in unità arbitrarie Assorbanza media del paziente x 10 = AU CO Esempio: x 10 = 34 AU 0.50 Interpretazione dei risultati in AU Valore di Cut-off Zona Incerta Negativo Positivo 10 AU 9-11 AU < 9 AU > 11 AU È importante tenere presente che la determinazione di un range di valori attesi in un dato metodo per una popolazione normale è dipendente da molteplici fattori, quali la specificità e sensibilità del metodo in uso, e la popolazione in esame. Perciò ogni laboratorio dovrebbe considerare i range indicati dal Fabbricante come un indicazione generale e produrre range di valori attesi propri basati sulla popolazione indigena dove il laboratorio risiede. 9. PARAMETRI CARATTERISTICI 9.1. Range di dosaggio Il range di dosaggio è AU/mL Specificità dell'antigene (Cross-reattività) In conseguenza della stretta relazione con Chlamydia pneumoniae e Chlamydia psittaci, non può essere esclusa una cross-reattività di Chlamydia trachomatis con questi due batteri: il kit non mostra cross-reattività con Chlamydia pneumoniae IgM. (Valutazione effettuata su 99 campioni e controlli). la cross-reattività verso Chlamidia psittaci è in revisione. Per i seguenti parametri non esiste cross-reattività: Adenovirus-6, Brucella abortus, Epstein Barr Virus (VCA), Herpes Simplex Virus 1+2, Measles Virus, Mumps Virus, Parvovirus B19, Rubella Virus, Toxoplasma gondii and Varicella zoster Virus Sensibilità analitica La sensibilità analitica è stata calcolata considerando 2 deviazioni standard dalla media di 20 replicati del controllo negativo; la sensibilità analitica è di 0.34 AU/mL (OD 450 = 0.019) Specificità Diagnostica La specificità diagnostica é definita come la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica del kit Diametra Chlamydia trachomatis IgM è > 99.9% Sensibilità Diagnostica La sensibilità diagnostica è definita come la probabilità di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica del kit Diametra Chlamydia trachomatis IgM è > 99.9%.

5 9.6. Correlazione Il kit Diametra Chlamidia trachomatis IgM è stato comparato ad un kit disponibile in commercio. Sono stati testati 100 campioni sierici. n = 100 Commercial ELISA pos neg Diametra pos 19 0 ELISA neg 0 81 I risultati mostrano una correlazione del 100% Precisione Intra assay La variazione intra-assay del kit Diametra ELISA è stato determinato mediante 20 misurazioni di 3 campioni positivi. Campione Media OD CV % n Inter assay La variazione inter-assay del kit Diametra ELISA è stato determinato con 3 campioni con 2 produzioni in 10 indipendenti dosaggi con 2 replicati per dosaggio. Campione Media OD CV % n 1 1,12 8, ,74 2, ,00 5, Linearità Tre differenti campioni sierici contenenti differenti quantità di analita sonostati serialmente diluiti con sample diluent e testati con il kit Diametra. La percentuale di recupero è stata calcolata comparando il valore atteso e il valore misurato Conc. (AU/mL) % Recupero Min Rec. from Max Rec. to ± 15% pass pass pass 9.9. Sostanze interferenti Emoglobina (fino a 4 mg/ml), Bilirubina (fino a 0,5 mg/ml) e Trigliceridi (fino a 30 mg/ml) non influenzano i risultati del saggio. 10. LIMITAZIONI DEL SAGGIO La contaminazione batterica o ripetuti cicli di congelamento e scongelamento del campione possono influenzare i valori di assorbanza. Nei pazienti immunocompromessi e nei neonati i valori sierologici hanno un valore limitato. 11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. BIBLIOGRAFIA 1. Petersen E.E., Clad A. (1995). Genitale Chlamydieninfektionen. Deutsches Ärzteblatt 92, Heft 5, A Paavonen J. (1996). Chlamydia trachomatis: A major cause of mucopurulent cervicitis and pelvic inflammatory disease in women. In: Sexually Transmitted Diseases. Advances in Diagnosis amd Treatment. Curr. Probl. Dermatol. Elsner P., Eichmann A. (eds.), Basel, Karger, Vol. 24, pp Weström L.V. (1996). Chlamydia and its effect on reproduction. J.Brit.Fertil.Soc. 1: Weström L. (1996). Consequences of genital Chlamydia infections in women. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the third meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, Sept. pp Hoyme U.B., Spitzbart H. (1996). Past and current prevalence of Chlamydia trachomatis in women in Germany. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the third meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, Sept. p Ed.02/2013 DCM016i-1 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com

6 DCM016i-1 Ed. 02/2013 Chlamydia trachomatis IgM for research use only Enzyme immunoassay for the qualitative and semiquantitative determination of human IgM antibodies to Chlamydia trachomatis in human serum and plasma. RUO LOT See external label Σ = 96 tests REF DKI016 INTENDED USE Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA assay is an immunoenzymatic method for the qualitative and semiquantitative determination of human IgM antibodies against Chlamydia trachomatis in human serum and plasma. Chlamydia trachomatis IgM kit is intended for laboratory use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE Chlamydiae are non-motile, Gram negative and obligatory intracellular growing bacteria which form characteristic inclusions within the cytoplasm of parasitized cells. They are easily visible in the light microscope. Three different Chlamydia species are known to be pathogenic for humans: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci, and only one species is pathogenic for animals (C. pecorum). Chlamydia trachomatis is the most prevalent agent of sexually transmitted diseases worldwide ( million cases) and the number of infections is constantly growing. Pregnant women infected with C. trachomatis may transmit these bacteria during childbirth, causing conjunctivitis or pneumonia in newborns. Untreated cases of chlamydial infection can lead to chronic salpingitis, possibly resulting in ectopic pregnancy or infertility. In males, C. trachomatis is a major cause of non-gonococcal urethritis. A severe problem in Chlamydia infections is the frequent asymptomatic insidious course which may result in the initiation of chronic diseases. In many instances primary infections are not recognized and only the sequelae caused by ascended, persisting agents are diagnosed. 2. PRINCIPLE OF THE METHOD Diametra Chlamydia trachomatis IgM kit is a solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Patient samples are diluted with Sample Diluent and additionally incubated with IgG-RF-Sorbent to eliminate competitive inhibition from specific IgG and to remove rheumatoid factors. This pretreatment avoids false negative or false positive results. Microtiter wells as a solid phase are coated with inactivated Elementary Bodies Chlamydia trachomatis antigen. Diluted patient specimens and ready-for-use controls are pipetted into these wells. During incubation Chlamydia trachomatis-specific antibodies of positive specimens and controls are bound to the immobilized antigens. After a washing step to remove unbound sample and control material horseradish peroxidase conjugated anti-human IgM antibodies are dispensed into the wells. During a second incubation this anti-igm conjugate binds specifically to IgM antibodies resulting in the formation of enzyme-linked immune complexes. After a second washing step to remove unbound conjugate the immune complexes formed (in case of positive results) are detected by incubation with TMB substrate and development of a blue color. The blue color turns into yellow by stopping the enzymatic indicator reaction with sulfuric acid. The intensity of this color is directly proportional to the amount of Chlamydia trachomatis-specific IgM antibody in the patient specimen. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microtiter plate reader. 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1. Reagents and materials supplied in the kit 1. Controls (3 vials, ready to use) Negative Control (2 ml) REF DCE045/01601i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/01602i-0 Cut-Off Control (2 ml) REF DCE045/01603i-0 2. Conjugate (1 vial, 20 ml) Anti human IgM antibodies conjugated with peroxidase REF DCE002/01602i-0 3. Coated Microplate (1 breakable microplate coated with inactivated Elementary Bodies Chlamydia trachomatis antigen) REF DCE002/01603i-0 4. TMB Substrate (1 vial, 14 ml) H 2 O 2 -Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact) REF DCE004/01604i-0

7 5. Stop Solution (1 vial, 14 ml) Sulphuric acid 0.2M (avoid any skin contact) REF DCE005/01605i X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 ml) Contain non-mercury preservative REF DCE007/01607i-0 7. Sample Diluent (1 vial, 100 ml) Buffered solution ph 7.2 REF DCE053/01653i-0 8. IgG-RF-Sorbent (1 vial, 6,5 ml) Contains anti human IgG-class antibody REF DCE033/01633i Reagents necessary not supplied Distilled water Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 nm) Notes Store all reagents at 2 8 C in the dark. Opened kits retain activity for two months if stored as described above. Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close it immediately after use. 4. WARNINGS This kit is intended for in vitro use by professional persons only. Not for internal or external use in Humans or Animals. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All human source material used in the preparation of the reagents has been tested and found negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and HCV. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled in the same manner as potentially infectious material. Some reagents contain small amounts of Sodium Azide or Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. Sodium Azide may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes; moreover it may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides. If you use a sink to remove the reagents, allow scroll through large amounts of water to prevent azide build-up. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. 5. PRECAUTIONS Please adhere strictly to the sequence of pipetting steps provided in this protocol. The performance data represented here were obtained using specific reagents listed in this Instruction For Use. All reagents should be stored refrigerated at 2-8 C in their original container. Any exceptions are clearly indicated. The reagents are stable until the expiry date when stored and handled as indicated. Allow all kit components and specimens to reach room temperature (22-28 C) and mix well prior to use. Do not interchange kit components from different lots. The expiry date printed on box and vials labels must be observed. Do not use any kit component beyond their expiry date. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of the reagents. Samples microbiologically contaminated, highly lipemeic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. 6. PROCEDURE 6.1. Preparation of the Wash Solution Dilute the "20X Conc. Wash Solution" 1:20 with distilled water; for example to prepare 600 ml of diluted Wash Solution add 30 ml of "20X Wash Solution" to 570 ml of distilled water. If the "20X Wash Solution" presents crystals, dissolve them by warming up at 37 C in a water bath before use. The diluted Wash Solution is stable for 1 month at 2-8 C Preparation of the Sample Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA can be used with human serum and plasma (EDTA-, heparin or citrate plasma). Prior to assaying each patient specimen is first to be diluted with Sample Diluent and then, for the

8 absorption of rheumatoid factor, these prediluted samples have to be incubated with IgG-RF-Sorbent, according to the following procedure: 1. Dilute each patient specimen 1:51 with the Sample Diluent and mix well (for example, add 10 µl of sample to 0,5 ml of Sample Diluent) 2. Dilute this prediluted sample 1:2 with the IgG- RF-Sorbent and mix well (for example, add 60 µl of prediluted sample to 60 µl of IgG-RF- Sorbent) 3. Let stand for at least 15 minutes at room temperature or over night at 2-8 C and mix well again. 4. Take 100 µl of this pretreated sample for the ELISA. The Controls are ready to use and must not be diluted! To obtain the serum, collect blood by venipuncture, allow to clot, and separate serum by centrifugation at room temperature. Do not centrifuge before complete clotting has occurred. Patients receiving anticoagulant therapy may require increased clotting time. To obtain the plasma, whole blood should be collected into centrifuge tubes containing anti coagulant and centrifuged immediately after collection. Do not use hemolytic, icteric or lipemic specimens. Specimens should be capped and may be stored for up to 3 days at 2-8 C prior to assaying. Specimens held for a longer time should be frozen only once at 20 C prior to assay. Thawed samples should be inverted several times prior to testing Procedure Allow all reagents to reach room temperature (22-28 C). Unused coated microwell strips should be released securely in the foil pouch containing desiccant and stored at 2-8 C. To avoid potential microbial and/or chemical contamination, unused reagents should never be transferred into the original vials. As it is necessary to perform the determination in duplicate in order to improve accuracy of the test results, prepare two wells for each Control, two for each sample, one for Blank. Reagent Controls Sample Blank Controls (Neg, Pos, Cut-Off) Pre-treated Sample 100 µl 100 µl Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1 hour at 37 C. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. Important note: the sensitivity and precision of this assay is markedly influenced by the correct performance of the washing procedure! Conjugate 100 µl 100 µl Incubate 30 minutes at room temperature (22-28 C). Do not expose to direct sunlight. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubate 15 minutes in the dark at room temperature (22 28 C). Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Shake the microplate gently. (note: highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen!) Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference wavwlenght of 620 nm or against Blank within 30 minutes after adding the Stop Solution. Measurement: Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to zero using the substrate blank. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the substrate blank, subtract the absorbance value of the blank from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results! Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each control and patient sample. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. 7. QUALITY CONTROL It is recommended to use control samples according to state and federal regulations. The use of control samples is advised to assure the day to day validity of results. Use controls at both normal and pathological levels.

9 It is also recommended to make use of national or international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of the results. If the results of the assay do not fit to the established acceptable ranges of control materials patient results should be considered invalid. In this case, please check the following technical areas: pipetting and timing devices; photometer, expiration dates of reagents, storage and incubation conditions, aspiration and washing methods. After checking the above mentioned items without finding any error contact your distributor or Diametra directly. 8. RESULTS 8.1. Validation of the Test Run The test run may be considered valid provided the following criteria are met: Absorbance value (OD) Blank lower than 0,100 Negative Control lower than 0,200 Cut-Off Control between 0,350-0,850 Positive Control between 0,650-3, Calculation of Results Mean absorbance value of Cut-off Control (CO) Calculate the mean absorbance value of the two Cutoff Control determinations. Example: (0,49 + 0,51) : 2 = 0,50 = CO 8.3. Interpretation of Results POSITIVE GREY ZONE NEGATIVE Patient (mean) absorbance values more than 10% above CO (Mean OD patient > 1.1 x CO) Patient (mean) absorbance values from 10% above to 10% below CO: repeat test 2-4 weeks later with new patient samples (0.9 x CO Mean OD patient 1.1 x CO) Results in the second test again in the grey zone NEGATIVE Patient (mean) absorbance values more than 10% below CO (Mean OD patient < 0.9 x CO) Results in Arbitrary Units (AU) Patient (mean) absorbance value x 10 = AU CO Interpretation of Results in AU: Cut-off value Grey zone Negative Positive 10 AU 9-11 AU < 9 AU > 11 AU Please pay attention to the fact that the determination of a range of expected values for a normal population in a given method is dependent on many factors, such as specificity and sensitivity of the method used and type of population under investigation. Therefore each laboratory should consider the range given by the Manufacurer as a general indication and produce their own range of expected values based on the indigenous population where the laboratory works. 9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS 9.1. Assay Dynamic Range The range of the assay is between AU/mL Specificity of Antigen (Cross Reactivity) For Chlamydia trachomatis ELISA a cross reactivity could be expect with Chlamydia pneumonia and Chlamydia psittaci samples, due to their close relationship. Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA shows no cross-reactivity to Chlamydia pneumoniae IgM. The cross-reactivity study to Chlamydia psittaci is in evaluation. For the following parameters no cross reactivity is found: Adenovirus-6, Brucella abortus, Epstein Barr Virus (VCA), Herpes Simplex Virus 1+2, Measles Virus, Mumps Virus, Parvovirus B19, Rubella Virus, Toxoplasma gondii and Varicella zoster Virus Analytical Sensitivity The analytical sensitivity of Diametra ELISA kit was calculated by adding 2 standard deviations from the mean of 20 replicate analyses of the negative control and was found to be 0.34 AU/mL (OD 450 = 0.019) Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. The diagnostic specificity of Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA is >99.9% Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. The diagnostic sensitivity of Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA is >99.9%. Example: x 10 = 34 AU Method Comparison Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA was compared to a commercial available Chlamydia trachomatis IgM ELISA from another manufacturer. 100 serum samples have been assayed.

10 n = 100 Commercial ELISA pos neg Diametra pos 19 0 ELISA neg 0 81 The results show an agreement of 100% Precision Intra assay The intra-assay (within-run) precision of Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA was determined by 20x measurements of 12 serum samples covering the whole measuring range.. Sample Mean OD CV % n Inter assay The inter-assay variation of Diametra Chlamydia trachomatis IgM ELISA was determined with 3 samples with 2 production kits in 10 independent runs with 2 replicates per run. Sample Mean OD CV % n Linearity Three serum samples containing different amounts of analyte were serially diluted with sample diluent and assayed with Diametra ELISA kit. The percentage recovery was calculated by comparing the expected and measured values for the analyte. 10. LIMITATIONS OF USE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value. 11. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. BIBLIOGRAPHY 1. Petersen E.E., Clad A. (1995). Genitale Chlamydieninfektionen. Deutsches Ärzteblatt 92, Heft 5, A Paavonen J. (1996). Chlamydia trachomatis: A major cause of mucopurulent cervicitis and pelvic inflammatory disease in women. In: Sexually Transmitted Diseases. Advances in Diagnosis amd Treatment. Curr. Probl. Dermatol. Elsner P., Eichmann A. (eds.), Basel, Karger, Vol. 24, pp Weström L.V. (1996). Chlamydia and its effect on reproduction. J.Brit.Fertil.Soc. 1: Weström L. (1996). Consequences of genital Chlamydia infections in women. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the third meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, Sept. pp Hoyme U.B., Spitzbart H. (1996). Past and current prevalence of Chlamydia trachomatis in women in Germany. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the third meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, Sept. p Ed. 02/2013 DCM016i-1 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com Conc. (AU/mL) % Recovery Min Rec. from Max Rec. to ± 15% pass pass pass 9.9. Interfering Substances Haemoglobin (up to 4 mg/ml), Bilirubin (up to 0.5 mg/ml) and Triglyceride (up to 30 mg/ml) have no influence on the assay results.