Epstein Barr Virus VCA IgM

Transcript

1 DCM003i-0 Ed. 08/2012 Epstein Barr Virus VCA IgM per analisi di routine Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgM contro l Epstein Barr Virus VCA in siero umano IVD LOT Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKI003 DESTINAZIONE D USO Il kit ELISA Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM è un metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgM contro l Epstein Barr Virus VCA in siero umano. Il kit Epstein Barr Virus VCA IgM è destinato al solo uso di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO L Epstein-Barr Virus (EBV) è un membro della famiglia degli herpesvirus (sottogruppo Gamma, virus a DNA di nm) e uno dei più comuni virus umani. Il virus è presente in tutto il mondo, e molta gente è infettata da EBV durante vita. La trasmissione del virus è quasi impossibile da evitare dato che molte persone sane possono trasmettere e diffondere il virus ad intermittenza per tutta la vita. I bambini diventano suscettibili ad EBV non appena la protezione degli anticorpi materni scompare. L'infezione dei bambini di solito non provoca sintomi. L'infezione durante l'adolescenza o l'età adulta causa la mononucleosi infettiva per il 35%-50% del tempo. La mononucleosi infettiva non è quasi mai fatale. Non ci sono associazioni note tra infezione attiva da EBV e problemi durante la gravidanza, come aborti o difetti di nascita. Anche se i sintomi della mononucleosi infettiva si risolvono in 1 o 2 mesi, l EBV rimane inattivo o latente in alcune cellule della gola e del sangue per il resto della vita. Periodicamente, il virus può riattivarsi e si trova comunemente nella saliva di persone infette. Questa riattivazione di solito si manifesta senza sintomi di malattia. L EBV provoca anche una infezione permanente latente in alcune cellule del sistema immunitario. Un evento a lungo termine che si manifesta in pochissimi portatori di questo virus è l'emergere del linfoma di Burkitt e del carcinoma nasofaringeo, ma l EBV probabilmente non è l'unica causa di queste neoplasie. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il kit ELISA Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM è un test immunoenzimatico in fase solida (ELISA). I campioni dei pazienti sono diluiti con il diluente per campioni e inoltre incubati con IgG-RF-Sorbent, contenente anticorpi di classe IgG iper-immuni per eliminare l'inibizione competitiva da IgG specifiche e per eliminare i fattori reumatoidi. Questo pretrattamento evita risultati falsi negativi o falsi positivi. I micropozzetti della fase solida sono rivestiti con antigeni EBV inattivati. I campioni diluiti dei pazienti e i controlli pronti all'uso sono pipettati in questi pozzetti. Durante l'incubazione, gli anticorpi specifici contro l EBV dei campioni positivi e dei controlli si legano agli antigeni immobilizzati. Dopo la fase di lavaggio che rimuove il campione e il materiale di controllo non legato, vengono dispensati nei pozzetti anticorpi umani anti IgM coniugati a perossidasi di rafano. Durante una seconda incubazione questi anticorpi si legano specificamente agli anticorpi IgM con conseguente formazione di immunocomplessi enzimatici. Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, gli immunocomplessi formati (in caso di risultato positivo) vengono individuati mediante incubazione con il substrato TMB e lo sviluppo di un colore blu. Il colore blu si trasforma in giallo dopo aver stoppato la reazione enzimatica con acido solforico. L'intensità di questo colore è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi IgM specifici per EBV nel campione del paziente. L'assorbanza a 450 nm viene letta con un lettore di piastre ELISA. 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit 1. Controls (3 flaconi, pronti all uso) Negative Control (2 ml) REF DCE045/00301i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/00302i-0 Cut-Off Control (2 ml) REF DCE045/00303i-0 2. Conjugate (1 flacone, 20 ml) Anticorpi anti IgM umane coniugati con perossidasi REF DCE002/00302i-0 3. Coated Microplate (1 micropiastra breakable coattata con antigeni EBV virali) REF DCE002/00303i-0 4. TMB Substrate (1 flacone, 14 ml) H 2 O 2 -Tetrametilbenzidina (TMB) (evitare il contatto con la pelle) REF DCE004/00304i-0

2 5. Stop Solution (1 flacone, 14 ml) Acido Solforico 0,2 mol/l (evitare il contatto con la pelle) REF DCE005/00305i X Conc Wash Solution (1 vial, 30 ml) Contiene presrvante privo di mercurio REF DCE007/00307i-0 7. Sample diluent (1 vial, 100 ml) Soluzione tampone ph 7.2 REF DCE053/00353i-0 8. IgG-RF-Sorbent (1 vial, 6,5 ml) Contiene anticorpi anti IgG umane REF DCE033/00333i Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata Materiale e strumentazione ausiliari Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm). Note Conservare tutti i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Il kit aperto mantiene l attività per 2 mesi se conservato come indicato. Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare. 4. AVVERTENZE Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri Umani o Animali. Usare i previsti dispositivi di protezione individuale mentre si lavora con i reagenti forniti. Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per la manipolazione di prodotti derivati da sangue. Tutti i reattivi di origine umana usati nella preparazione dei reagenti sono stati testati e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi anti- HTLV, TPHA (Sifilide), HIV 1&2, HBV e HCV. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i reagenti devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Sodio Azide (NaN 3 ) o di Proclin 300 R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. La Sodio Azide può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi; inoltre, può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, lasciar scorrere grandi quantità di acqua per prevenire la formazione di azidi. Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la soluzione. 5. PRECAUZIONI Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati presentati qui sono stati ottenuti usando specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per l Uso. Tutti i reattivi devono essere conservati a temperatura controllata di 2-8 C nei loro contenitori originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Prima dell uso lasciare tutti i componenti dei kit e i campioni a temperatura ambiente (22-28 C) e mescolare accuratamente. Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi. Devono essere osservate le date di scadenza riportate sulle etichette della scatola e di tutte le fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di scadenza. Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso. Per evitare il time shifting durante la dispensazione degli reagenti, il tempo di dispensazione dei pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in ogni piastra. L addizione del TMB Substrato dà inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l addizione della Stop Solution. L addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per evitare tempi di reazione differenti. Osservare le linee guida per l esecuzione del controllo di qualità nei laboratori clinici testando controlli e/o pool di sieri. Osservare la massima precisione nella ricostituzione e dispensazione dei reagenti. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, altamente lipemici o emolizzati. I lettori di micropiastre leggono l assorbanza verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparazione della Wash Solution Diluire la 20X Conc. Wash Solution 1:20 con acqua distillata; ad esempio per preparare 600 ml di

3 soluzione di lavaggio diluita aggiungere 30 ml di soluzione di lavaggio 20X a 570 ml di acqua distillata. Se la "20X Conc. Wash Solution" presenta i cristalli, scioglierli in un bagno di acqua calda a 37 C prima dell uso. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 mese a 2-8 C Preparazione del Campione Il kit ELISA Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM può essere utilizzato con siero umano. Prima di essere analizzato, ogni campione deve essere diluito con il Sample Diluent e successivamente incubato con IgG-RF-Sorbent per l'assorbimento dei Fattori Reumatoidi, secondo la seguente procedura: 1. Diluire ogni campione 1:51 con il Sample Diluent e mescolare bene (per esempio, aggiungere 10 µl di campione a 0,5 ml di Sample Diluent). 2. Diluire il campione prediluito 1:2 con l'igg-rf- Sorbent e mescolare bene (per esempio, aggiungere 60 µl di campione prediluito a 60 µl di IgG-RF-Sorbent). 3. Lasciare riposare per almeno 15 minuti a temperatura ambiente o per tutta la notte a 2-8 C e mescolare bene di nuovo. 4. Prelevare 100 µl di questo campione pretrattato per il test. I controlli sono pronti all'uso e non devono essere pre-trattati! Per ottenere il siero, raccogliere il sangue venoso, far coagulare e separare il siero centrifugando a temperatura ambiente. Non centrifugare prima che la coagulazione sia completata. I pazienti trattati con terapia anticoagulante possono richiedere un tempo di coagulazione più lungo. Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo del sangue. Non usare campioni emolitici, itterici o lipemici. I campioni devono essere chiusi e possono essere conservati per un massimo di 24 ore a 2-8 C prima di essere analizzati. Per conservazioni più lunghe, tenere i campioni congelati a -20 C prima del dosaggio; congelare una sola volta. I campioni scongelati devono essere miscelati bene prima della prova Procedura Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28 C). Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate a 2-8 C. Per evitare potenziali contaminazioni microbiche e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei flaconi originali. Al fine di aumentare l accuratezza dei risultati del test è necessario operare in doppio, allestendo due pozzetti per ogni campione, due per ogni Controllo, e uno per il Bianco. Reagente Controlli Campione Bianco Controlli (Neg, Pos, Cut-off) Campione diluito 100 µl 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 1 ora a 37 C. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione battendo delicatamente la piastra capovolta su un tovagliolo di carta assorbente. Nota importante: la sensibilità e la precisione di questo dosaggio sono marcatamente influenzati da una corretta procedura di lavaggio. Conjugate 100 µl 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (22-28 C). Non esporre a luce solare diretta. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione battendo delicatamente la piastra capovolta su un tovagliolo di carta assorbente. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubare 15 minuti al buio a temperatura ambiente (22 28 C) senza la pellicola adesiva. Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Agitare delicatamente la micropiastra. (Nota: pazienti altamente positivi possono causare precipitati scuri del cromogeno!). Leggere l assorbanza (E) a 450 nm contro una lunghezza d onda di riferimento di 620 nm o contro il bianco entro 30 minuti dall aggiunta della Stop Solution. Misurazione: Settare il lettore di micropiastra ELISA a zero usando il bianco. Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può essere regolato a zero usando il bianco, sottrarre il valore di assorbanza del bianco a tutti i valori delle altre assorbanze misurate in modo da ottenere risultati attendibili! Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e registrare tutti i valori di assorbanza di ogni controllo e campione. Si raccomanda una lettura a doppia lunghezza d'onda utilizzando 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile calcolare la media delle assorbanze di tutti i duplicati.

4 7. CONTROLLO QUALITA Si raccomanda di utilizzare i controlli secondo le norme statali e federali. L'uso di controlli è consigliato per assicurare la validità dei risultati durante i test. Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico. Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi per la valutazione della qualità nazionali o internazionali, al fine di assicurare l'accuratezza dei risultati. Se i risultati del test non rientrano nei range di accettazione dei controlli, i risultati devono essere considerati non validi. In questo caso, si prega di consultare i seguenti parametri tecnici: pipettaggio e apparecchiature di cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei reagenti, metodi di conservazione e condizioni di incubazione, aspirazione e lavaggio. Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile alcun errore, contattare il proprio distributore o Diametra direttamente. 8. RISULTATI 8.1. Validazione del dosaggio Il dosaggio può essere considerato valido se sono soddisfatti i seguenti criteri: Assorbanza (OD) Bianco minore di 0,100 Controllo Negativo minore di 0,200 Controllo Cut-off compresa tra 0,350-0,850 Controllo Positivo compresa tra 0,650-3, Calcolo dei risultati Valore medio di assorbanza del Controllo Cut-off (CO) Calcolare il valore medio di assorbanza dei due valori del controllo Cut-off ottenuti. Esempio: (0,49 + 0,51): 2 = 0,50 = CO 8.3. Interpretazione dei risultati POSITIVO Assorbanza media del paziente oltre il 10% al di sopra del CO (Media OD paziente > 1.1 x CO) ZONA INCERTA Assorbanza media del paziente dal 10% sopra al 10% sotto il CO: ripetere il test 2-4 settimane dopo con un campione fresco del paziente (0.9 x CO Media OD paziente 1.1 x CO) Risultato nel second test ancora nella zona incerta NEGATIVO NEGATIVO Assorbanza media del paziente oltre il 10% al di sotto del CO (Media OD paziente < 0.9 x CO) Risultati in unità arbitrarie (AU) Assorbanza media del paziente x 10 = AU CO Esempio: x 10 = 32 AU 0.50 Interpretazione dei risultati in AU Valore di Cut-off Zona Incerta Negativo Positivo 10 AU 9-11 AU < 9 AU > 11 AU È importante tenere presente che la determinazione di un range di valori attesi in un dato metodo per una popolazione normale è dipendente da molteplici fattori, quali la specificità e sensibilità del metodo in uso, e la popolazione in esame. Perciò ogni laboratorio dovrebbe considerare i range indicati dal Fabbricante come un indicazione generale e produrre range di valori attesi propri basati sulla popolazione indigena dove il laboratorio risiede. 9. PARAMETRI CARATTERISTICI 9.1. Specificità Diagnostica La specificità diagnostica é definita come la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica del kit Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM è 98,3% Sensibilità Diagnostica La sensibilità diagnostica è definita come la probabilità di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica del kit Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM è > 99,9%. 10. LIMITAZIONI DELL USO La contaminazione batterica o ripetuti cicli di congelamento e scongelamento del campione possono influenzare i valori di assorbanza. Nei pazienti immunocompromessi e nei neonati i valori sierologici hanno un valore limitato. 11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. BIBLIOGRAFIA 1. Lamy ME., Favart AM., Cornu A. et al., Study of Epstein-Barr virus (EBV) antibodies: IgG and IgM anti-vca, IgG anti EA and Ig anti-ebna obtained with an original microtiter technique. Serological criterions of primary and recurrents EBV infections and follow-up of infectious mononucleosis. Seroepidemiology of EBV in Belgium based on 5178 sera from patients. Acta Clin. Belg., 37 (5): , (1982).

5 2. Lennette E., Epstein-Barr Virus, in Manual of Clinical Microbiology, 4th ed. Washington D.C., Am. Soc. Microbiol. P , (1985). 3. Luka J., chase PC., Pearson GR., A sensitive enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) against the major EBV-associated antigens. I- Correlation between ELISA and immunofluorescence titers using purified antigens, J. Immunol. Metho., 67: , (1984). Ed. 08/2012 DCM003i-0 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com

6 DCM003i-0 Ed. 08/2012 Epstein Barr Virus VCA IgM for routine analysis Enzyme immunoassay for the qualitative and semiquantitative determination of human IgM antibodies against Epstein Barr viral capsid antigen in human serum IVD LOT See external label Σ = 96 tests REF DKI003 INTENDED USE Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM ELISA assay is an immunoenzymatic method for the qualitative and semiquantitative determination of human IgM antibodies against Epstein Barr viral capsid antigen in human serum. Epstein Barr Virus VCA IgM kit is intended for laboratory use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE Epstein-Barr Virus (EBV) is a member of the herpesvirus family (Gamma subgroup, DNA virus of nm) and one of the most common human viruses. The virus occurs worldwide, and most people become infected with EBV sometime during their lives. Transmission of the virus is almost impossible to prevent since many healthy people can carry and spread the virus intermittently for life. Infants become susceptible to EBV as soon as maternal antibody protection disappears. Infection of children usually causes no symptoms. Infection during adolescence or young adulthood causes infectious mononucleosis 35% to 50% of the time. Infectious mononucleosis is almost never fatal. There are no known associations between active EBV infection and problems during pregnancy, such as miscarriages or birth defects. Although the symptoms of infectious mononucleosis usually resolve in 1 or 2 months, EBV remains dormant or latent in a few cells in the throat and blood for the rest of the person s life. Periodically, the virus can reactivate and is commonly found in the saliva of infected persons. This reactivation usually occurs without symptoms of illness. EBV also establishes a lifelong dormant infection in some cells of the body s immune system. A late event in a very few carriers of this virus is the emergence of Burkitt s lymphoma and nasopharyngeal carcinoma, but EBV is probably not the sole cause of these malignancies. 2. PRINCIPLE OF THE METHOD Diametra Epstein-Barr Virus (VCA) IgM ELISA Kit is a solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Patient samples are diluted with Sample Diluent and additionally incubated with IgG-RF-Sorbent, containing hyper-immune anti-human IgG-class antibody to eliminate competitive inhibition from specific IgG and to remove rheumatoid factors. This pretreatment avoids false negative or false positive results. Microplate wells as a solid phase are coated with inactivated Epstein-Barr viral capsid antigen. Pretreated patient specimens and ready-for-use controls are pipetted into these wells. During incubation Epstein-Barr viral capsid antigen-specific antibodies of positive specimens and controls are bound to the immobilized antigens. After a washing step to remove unbound sample and control material horseradish peroxidase conjugated anti-human IgM antibodies are dispensed into the wells. During a second incubation this anti-igm conjugate binds specifically to IgM antibodies resulting in the formation of enzyme-linked immune complexes. After a second washing step to remove unbound conjugate the immune complexes formed (in case of positive results) are detected by incubation with TMB substrate and development of a blue color. The blue color turns into yellow by stopping the enzymatic indicator reaction with sulfuric acid. The intensity of this color is directly proportional to the amount of Epstein-Barr viral capsid antigen-specific IgM antibody in the patient specimen. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microtiter plate reader.

7 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1. Reagents and materials supplied in the kit 1. Controls (3 vials, ready to use) Negative Control (2 ml) REF DCE045/00301i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/00302i-0 Cut-Off Control (2 ml) REF DCE045/00303i-0 2. Conjugate (1 vial, 20 ml) Anti human IgM antibodies conjugated with peroxidase REF DCE002/00302i-0 3. Coated Microplate (1 breakable microplate coated with Epstein Barr viral capsid antigen) REF DCE002/00303i-0 4. TMB Substrate (1 vial, 14 ml) H 2 O 2 -Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact) REF DCE004/00304i-0 5. Stop Solution (1 vial, 14 ml) Sulphuric acid 0.2M (avoid any skin contact) REF DCE005/00305i X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 ml) Contain non-mercury preservative REF DCE007/00307i-0 7. Sample Diluent (1 vial, 100 ml) Buffered solution ph 7.2 REF DCE053/00353i-0 8. IgG-RF-Sorbent (1 vial, 6,5 ml) Contains anti human IgG-class antibody REF DCE033/00333i Reagents necessary not supplied Distilled water Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 nm) Notes Store all reagents at 2 8 C in the dark. Opened kits retain activity for two months if stored as described above. Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close it immediately after use. 4. WARNINGS This kit is intended for in vitro use by professional persons only. Not for internal or external use in Humans or Animals. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All human source material used in the preparation of the reagents has been tested and found negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and HCV. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled in the same manner as potentially infectious material. Some reagents contain small amounts of Sodium Azide or Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. Sodium Azide may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes; moreover it may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides. If you use a sink to remove the reagents, allow scroll through large amounts of water to prevent azide build-up. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. 5. PRECAUTIONS Please adhere strictly to the sequence of pipetting steps provided in this protocol. The performance data represented here were obtained using specific reagents listed in this Instruction For Use. All reagents should be stored refrigerated at 2-8 C in their original container. Any exceptions are clearly indicated. The reagents are stable until the expiry date when stored and handled as indicated. Allow all kit components and specimens to reach room temperature (22-28 C) and mix well prior to use. Do not interchange kit components from different lots. The expiry date printed on box and vials labels must be observed. Do not use any kit component beyond their expiry date. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of the reagents. Samples microbiologically contaminated, highly lipemeic or haemolysed should not be used in the assay.

8 Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. 6. PROCEDURE 6.1. Preparation of the Wash Solution Dilute the "20X Conc. Wash Solution" 1:20 with distilled water; for example to prepare 600 ml of diluted Wash Solution add 30 ml of "20X Wash Solution" to 570 ml of distilled water. If the "20X Wash Solution" presents crystals, dissolve them by warming up at 37 C in a water bath before use. The diluted Wash Solution is stable for 1 month at 2-8 C Preparation of the Sample Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM ELISA can be used with human serum. Prior to assaying each patient specimen is first to be diluted with Sample Diluent and then, for the absorption of rheumatoid factor, these prediluted samples have to be incubated with IgG-RF-Sorbent, according to the following procedure: 1. Dilute each patient specimen 1:51 with the Sample Diluent and mix well (for example, add 10 µl of sample to 0,5 ml of Sample Diluent) 2. Dilute this prediluted sample 1:2 with the IgG- RF-Sorbent and mix well (for example, add 60 µl of prediluted sample to 60 µl of IgG-RF- Sorbent) 3. Let stand for at least 15 minutes at room temperature or over night at 2-8 C and mix well again. 4. Take 100 µl of this pretreated sample for the ELISA. The Controls are ready to use and must not be pretreated! To obtain the serum, collect blood by venipuncture, allow to clot, and separate serum by centrifugation at room temperature. Do not centrifuge before complete clotting has occurred. Patients receiving anticoagulant therapy may require increased clotting time. The usual precautions for venipuncture should be observed. Do not use hemolytic, icteric or lipemic specimens. Specimens should be capped and may be stored for up to 24 hours at 2-8 C prior to assaying. Specimens held for a longer time should be frozen only once at 20 C prior to assay. Thawed samples should be inverted several times prior to testing Procedure Allow all reagents to reach room temperature (22-28 C). Unused coated microwell strips should be released securely in the foil pouch containing desiccant and stored at 2-8 C. To avoid potential microbial and/or chemical contamination, unused reagents should never be transferred into the original vials. As it is necessary to perform the determination in duplicate in order to improve accuracy of the test results, prepare two wells for each Control, two for each sample, one for Blank. Reagent Controls Sample Blank Controls (Neg, Pos, Cut-Off) Pretreated Sample 100 µl 100 µl Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1 hour at 37 C. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. Important note: the sensitivity and precision of this assay is markedly influenced by the correct performance of the washing procedure! Conjugate 100 µl 100 µl Incubate 30 minutes at room temperature (22-28 C). Do not expose to direct sunlight. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubate 15 minutes in the dark at room temperature (22 28 C). Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Shake the microplate gently. (Note: Highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen!) Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference wavwlenght of 620 nm or against Blank within 30 minutes after adding the Stop Solution. Measurement: Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to zero using the substrate blank. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the substrate blank, subtract the absorbance value of the blank from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results! Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each control and patient sample. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. 7. QUALITY CONTROL It is recommended to use control samples according to state and federal regulations. The use of control samples is advised to assure the day to day validity of results. Use controls at both normal and pathological levels.

9 It is also recommended to make use of national or international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of the results. If the results of the assay do not fit to the established acceptable ranges of control materials patient results should be considered invalid. In this case, please check the following technical areas: pipetting and timing devices; photometer, expiration dates of reagents, storage and incubation conditions, aspiration and washing methods. After checking the above mentioned items without finding any error contact your distributor or Diametra directly. 8. RESULTS 8.1. Validation of the Test Run The test run may be considered valid provided the following criteria are met: Absorbance value (OD) Blank lower than 0,100 Negative Control lower than 0,200 Cut-Off Control between 0,350-0,850 Positive Control between 0,650-3, Calculation of Results Mean absorbance value of Cut-off Control (CO) Calculate the mean absorbance value of the two Cutoff Control determinations. Example: (0,49 + 0,51) : 2 = 0,50 = CO 8.3. Interpretation of Results POSITIVE GREY ZONE NEGATIVE Patient (mean) absorbance values more than 10% above CO (Mean OD patient > 1.1 x CO) Patient (mean) absorbance values from 10% above to 10% below CO: repeat test 2-4 weeks later with new patient samples (0.9 x CO Mean OD patient 1.1 x CO) Results in the second test again in the grey zone NEGATIVE Patient (mean) absorbance values more than 10% below CO (Mean OD patient < 0.9 x CO) Results in Arbitrary Units (AU) Patient (mean) absorbance value x 10 = AU CO Example: x 10 = 32 AU 0.50 Interpretation of Results in AU: Cut-off value Grey zone Negative Positive 10 AU 9-11 AU < 9 AU > 11 AU Please pay attention to the fact that the determination of a range of expected values for a normal population in a given method is dependent on many factors, such as specificity and sensitivity of the method used and type of population under investigation. Therefore each laboratory should consider the range given by the Manufacurer as a general indication and produce their own range of expected values based on the indigenous population where the laboratory works. 9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS 9.1. Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. The diagnostic specificity of Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM ELISA is 98,3% Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. The diagnostic sensitivity of Diametra Epstein Barr Virus VCA IgM ELISA is > 99,9%. 10. LIMITATIONS OF USE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value. 11. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. BIBLIOGRAPHY 1. Lamy ME., Favart AM., Cornu A. et al., Study of Epstein-Barr virus (EBV) antibodies: IgG and IgM anti-vca, IgG anti EA and Ig anti-ebna obtained with an original microtiter technique. Serological criterions of primary and recurrents EBV infections and follow-up of infectious mononucleosis. Seroepidemiology of EBV in Belgium based on 5178 sera from patients. Acta Clin. Belg., 37 (5): , (1982)

10 2. Lennette E., Epstein-Barr Virus, in Manual of Clinical Microbiology, 4th ed. Washington D.C., Am. Soc. Microbiol. P , (1985) 3. Luka J., chase PC., Pearson GR., A sensitive enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) against the major EBV-associated antigens. I- Correlation between ELISA and immunofluorescence titers using purified antigens, J. Immunol. Metho., 67: , (1984) Ed. 08/2012 DCM003i-0 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax info@diametra.com