EBV EA IgG EIA WELL REF K10EAG. Italiano p. 3 English p. 12

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1 EBV EA IgG EIA WELL REF K10EAG Italiano p. 3 English p. 12 M205 - Rev.10 06/2010

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. MTP 1 x 96 Pronti per l'uso, Ready for use CONJ 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use CONTROL + 1 x 2 ml Pronto per l'uso, Ready for use C/O 1 x 2 ml Pronto per l'uso, Ready for use CONTROL 1 x 2 ml Pronto per l'uso, Ready for use DIL 1 x 100 ml Pronto per l'uso, Ready for use SORB G 1 x 7 ml Pronto per l'uso, Ready for use SUBS 3 x 12 ml Pronto per l'uso, Ready for use WASH 10X 1 x 100 ml Conc. STOP 1 x 16 ml Pronto per l'uso, Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M205 Rev.10 06/2010 Pag. 2/24

3 DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA E/O SEMIQUANTITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI EARLY ANTIGEN (EA IgG) DEL VIRUS DI EPSTEIN-BARR NEL SIERO UMANO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE Gli antigeni precoci (Early Antigens) del virus di Epstein-Barr Virus (EBV-EA) sono proteine virali prodotte precocemente nel corso dell infezione litica. La determinazione degli anticorpi serici anti-ebv-ea mediante immunofluorescenza indiretta (IFA) è stata a lungo utilizzata in associazione alla determinazione delle IgG e IgM dirette verso gli antigeni capsidici (VCA) e delle IgG dirette verso un antigene nucleare (EBNA-1) per la diagnosi della mononucleosi infettiva (IM). Recentemente è stato dimostrato che la determinazione mediante metodo immunoenzimatico delle IgG e delle IgM seriche verso due proteine precoci, la p138 e la p54, correla bene con la IFA e può essere utilizzata, oltre che come complemento alla determinazione degli anticorpi anti-vca, anche in sostituzione di questi per la diagnosi di IM. Il kit Radim per la determinazione con il metodo immunoenzimatico delle IgG e IgM anti-ebv-ea impiega polipeptidi ricombinanti prodotti in E. coli contenenti gli epitopi delle proteine p138 e p PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA), ed utilizza come marcatore enzimatico la perossidasi. I pozzetti sono sensibilizzati con proteine ricombinanti degli antigeni precoci di Epstein-Barr virus (epitopi delle p138 e p54). Durante la prima incubazione, gli anticorpi anti-ea IgG eventualmente presenti nel siero in esame, si legano all antigene adeso alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene eliminato il materiale non legato; in una successiva incubazione gli anticorpi monoclonali anti-igg umane, coniugati alla perossidasi, reagiscono con il complesso precedentemente formatosi tra antigene ed anticorpo anti-ea IgG. Dopo ulteriore lavaggio, viene aggiunta tetrametilbenzidina (TMB) incolore che, reagendo con la perossidasi presente, produce un composto colorato. La reazione di sviluppo del colore è bloccata con l aggiunta di H 2 SO 4 e l intensità del colore, misurata mediante spettrofotometro a 450 nm, è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi IgG anti-ea presenti nei campioni in esame. 3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITÀ - I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. - Il kit deve essere conservato a 2-8 C. - La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 3/24

4 MTP CONJ Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti divisibili singolarmente, sensibilizzati con proteine ricombinanti degli antigeni precoci EBV. I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2-8 C nella busta di polietilene con il gel di silice, sigillata accuratamente. Una volta aperto, il prodotto è stabile per 5 settimane se conservato a 2-8 C. Coniugato Enzimatico: 1 flacone (15 ml) di anticorpi monoclonali (topo) anti-igg umane, coniugati con perossidasi di rafano (HRPO) in tampone fosfato. Conservante: Bronidox (0.02%) e Fenolo (0.05%). Pronto per l uso. Una volta aperto ha una stabilità di 5 settimane, se conservato a 2-8 C. CONTROL + Controllo Positivo: 1 flacone (2 ml) di siero umano a concentrazione nota di anti-ea IgG in tampone fosfato 0.01 mol/l e BSA 1%. Conservante: NaN 3 (0.09%). Pronto per l uso. Una volta aperto ha una stabilità di 5 settimane, se conservato a 2-8 C. C/O Controllo Cut Off: 1 flacone (2 ml) di siero umano a concentrazione nota di anti-ea IgG in tampone fosfato 0.01 mol/l e BSA 1%. Conservante: NaN 3 (0.09%). Pronto per l uso. Una volta aperto ha una stabilità di 5 settimane, se conservato a 2-8 C. CONTROL Controllo Negativo Ref. CN1328 (INTERCAMBIABILE FRA LOTTI) 1 flacone (2 ml) di siero umano in tampone fosfato 0.01 mol/l e BSA 1%. Conservante: NaN 3 (0.09%). Pronto per l uso. Una volta aperto ha una stabilità di 5 settimane, se conservato a 2-8 C. DIL Diluente dei Campioni Ref. SD1332 (INTERCAMBIABILE FRA LOTTI) 1 flacone (100 ml) di soluzione salina tamponata (PBS) contenente proteine 10% p/v, NaN % e colorante metilarancio, pronta per l uso. Dopo apertura Il Diluente è stabile fino alla data di scadenza se conservato a 2-8 C. SORB G Sorbent G - Ref. SG1335 (INTERCAMBIABILE FRA LOTTI) 1 flacone (7 ml) di soluzione salina tamponata e siero bovino. Conservante: NaN 3 (0.09%). Pronto per l uso. Una volta aperto ha una stabilità di 5 settimane, se conservato a 2-8 C. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 4/24

5 SUBS Tampone Substrato - Ref. SB1331 (INTERCAMBIABILE FRA LOTTI) 3 flaconi (12 ml) di tetrametilbenzidina (TMB) 0,26 mg/ml e H 2 O 2 0,01% stabilizzati in tampone citrato 0,05 mol/l (ph 3,8). Pronto per l uso. Una volta aperto è stabile, fino alla data indicata nell etichetta se conservato a 2-8 C, o 1 settimana se conservato a temperatura ambiente. Conservare al buio. WASH 10X Soluzione di Lavaggio (conc.) Ref. SL1333 (INTERCAMBIABILE FRA LOTTI) 1 flacone (100 ml) di soluzione salina tamponata, Brij 0.5%. Al momento dell uso, diluire la quantità necessaria 1:10 con H 2 O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. Dopo diluizione, il tampone di lavaggio è stabile 5 giorni se conservato a temperatura ambiente o 2 settimane se conservato a 2-8 C. STOP Reagente Bloccante - Ref. RB1334 (INTERCAMBIABILE FRA LOTTI) 1 flacone (16 ml) contenente H 2 SO 4 0.3M. Pronto per l uso. CPA Copripiastra adesivo Custodia di plastica con minigrip 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 4.1 Dosaggio Manuale - Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile. - Incubatore a 37±2 C. - Normale vetreria di laboratorio: cilindri, provette, ecc. - Lavatore automatico per il lavaggio delle micropiastre. - Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell intervallo A ad una lunghezza d onda di 450 e 405 nm. - H 2 O distillata o deionizzata. 4.2 Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l'applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC. Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell'utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 5/24

6 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare reagenti specifici di lotti differenti, se non espressamente indicato. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Accertarsi che tutta la strumentazione usata (vetreria, incubatore, agitatore e lavatore di piastre, spettrofotometro, frigoriferi usati per la conservazione dei kit e dei campioni) sia perfettamente funzionante, adeguatamente calibrata e sia soggetta ad un regolare piano di manutenzione. Un uso non accurato di ognuno di questi strumenti può produrre errori metodologici che possono condizionare la riproducibilità e l affidabilità dei risultati ottenuti. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. La loro errata identificazione potrebbe determinare la perdita di specificità del dispositivo e risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni Substrato e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati testati con metodi approvati dall FDA per la ricerca di HBsAg, anti-hiv 1/2 e anti- M205 Rev.10 06/2010 Pag. 6/24

7 HCV e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reattivi può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Pertanto, tali reagenti non devono essere immessi nelle falde freatiche, nei corsi d acqua e nelle fognature. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. 6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio deve essere effettuato su siero umano. Campioni fortemente lipemici, itterici, emolizzati o inquinati non dovrebbero essere utilizzati. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 1-2 giorni; oppure a -20 C per tempi più lunghi e possono subire fino ad un massimo di 3 scongelamenti. Evitare l uso di congelatori auto-sbrinanti per la conservazione dei campioni. Il test non è applicabile al plasma umano. Prima dell uso, diluire i campioni 1:26 con il Diluente dei Campioni precedentemente preparato (es. 40 µl di Campione µl di Diluente dei Campioni). 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO * - Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. - Agitare i campioni per inversione prima dell uso. - Preparare la tampone di lavaggio diluendo la soluzione di lavaggio 10x (100 ml ml H 2 O). 7.1 Preparare i pozzetti necessari al dosaggio, prevedendo la determinazione in duplicato per i Sieri di Controllo in singolo per il Bianco. E preferibile effettuare l analisi dei Campioni in duplicato. 7.2 Dispensare 50 µl di Sorbent G e 50 µl dei Campioni precedentemente diluiti, nei rispettivi pozzetti. 7.3 Dispensare 100 µl dei Sieri di Controllo nei rispettivi pozzetti. N.B.: i Sieri di Controllo non devono essere diluiti. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 7/24

8 7.4 Incubare per 45 minuti a 37±2 C, coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.5 Effettuare 4 lavaggi (per la durata di 30 sec. ciascuno) con un volume di 350 µl per pozzetto, impiegando la Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i pozzetti. 7.6 Dispensare 100 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti eccetto che in quello del Bianco. 7.7 Incubare per 45 minuti a 37±2 C, coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo. 7.8 Lavare i pozzetti come al punto Dispensare 100 µl di Substrato in tutti i pozzetti Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (18-25 C) al riparo della luce Dispensare 100 µl di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). La lettura deve essere effettuata entro 30 minuti dal termine del dosaggio. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p CALCOLO DEI RISULTATI * 9.1 Risultati qualitativi Determinare la densità ottica media del Controllo Negativo, del Controllo Cut-off e del Controllo Positivo. Confrontando la densità ottica dei Campioni con la densità ottica media del Controllo Cut-off (valore soglia) si determina la reattività o non reattività verso gli anticorpi IgG anti-ea. I campioni con valori di densità ottica inferiori a quella relativa al Controllo Cut-off sono da considerare non reattivi per gli anticorpi IgG anti-ea. Campioni con valori di densità ottica superiori al Controllo Cut-off sono da considerare reattivi per gli anticorpi IgG anti-ea. I campioni con valori di densità ottica compresi tra il Controllo Cut-off ± 20% sono da considerare di incerta interpretazione e devono pertanto essere ridosati. 9.2 Risultati semiquantitativi M205 Rev.10 06/2010 Pag. 8/24

9 D.O. Campione INDEX = D.O. Cut-off Questo rapporto è considerato un valore "indice" di positività. Classificazione campione INDEX Positivo > 1.2 Dubbio ± 20% del Cut-off Negativo < Controllo dei valori attesi Prima di procedere al calcolo dei risultati fare la sottrazione del bianco ( 0.150) e verificare che i rapporti tra le assorbanze Controlli/Cut-Off rispettino i seguenti valori: Descrizione Valore Atteso Controllo Negativo/ Cut-off 0.6 Controllo Positivo/ Cut-off 1.5 D.O. Cut-off a 450 nm 0.2 D.O. Cut-off a 450/620 nm 0.16 Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio. * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l ampliamento del range di lettura. 9.4 Esempio di Calcolo I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione D.O. 450 nm Controllo Negativo Controllo Cut Off Controllo Positivo Campione Il campione dosato risulta essere positivo agli anticorpi anti-ea IgG. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 9/24

10 9.5 Interpretazione dei Risultati - I campioni non reattivi sono da considerare negativi per gli anticorpi IgG anti-ea. - I campioni reattivi sono da considerare positivi per gli anticorpi IgG anti-ea. - I campioni di incerta interpretazione devono essere dosati nuovamente per conferma. Se il risultato rimane dubbio, ripetere il prelievo. 10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Analitica Sono stati testati 10 campioni negativi agli anticorpi IgG anti-ea che contenevano anticorpi IgG anti-cmv, anti-herpes Simplex e anti-varicella. In nessun caso la presenza di detti anticorpi interferiva con il kit EBV EA IgG Eia Well Sensibilità e Specificità Diagnostica Sono stati analizzati 118 sieri di cui 58 sono risultati negativi e 60 positivi. Il metodo di confronto, effettuato con un altro kit ELISA in commercio, ne dichiarava rispettivamente 67 e 51; i discordanti sono stati analizzati con gli altri parametri tipici della sierologia dell'epstein Barr; di questi, 5 mostravano un andamento tipico di una infezione acuta di EBV in atto, sostenendone la positività. I risultati sono i seguenti: RADIM + - RIFERIMENTO Il kit Radim ha mostrato una sensibilità del 98,2% ed una specificità del 93,4% Precisione Ripetibilità (Intra-saggio) Precisione all interno della seduta eseguita su 3 lotti diversi: Cut-off n=15 Lotto 014 Lotto 015 Lotto 016 D.O CV% M205 Rev.10 06/2010 Pag. 10/24

11 Riproducibilità (Inter-saggio) Precisione tra sedute e tra lotti: INDEX Campione Lotto 014 Lotto 015 Lotto 016 Media CV% LIMITI DEL DOSAGGIO Il risultato del test deve servire unicamente come aiuto nella diagnosi e deve essere comunque valutato insieme a dati provenienti da altre procedure diagnostiche. Esiste la possibilità di reazioni incrociate con campioni contenenti anticorpi anti-e. coli. Le caratteristiche della performance non sono state stabilite per una interpretazione visiva. Inoltre non sono state studiate in pazienti affetti da carcinoma nasofaringeo, linfoma di Burkitt nè da altre linfadenopatie associate all EBV, ad esclusione della mononucleosi correlata all EBV. Poichè gli anticorpi anti-ea IgG sono presenti in sieri normali convalescenti, non può essere utilizzata per la diagnosi un unico parametro. L interpretazione accurata di un infezione da EBV si deve basare sui risultati del VCA IgG, VCA IgM, EBNA IgG, EA IgG ed EA IgM, oltre agli anticorpi eterofili Il test va effettuato sul siero. Non è stata stabilita l applicazione su sangue intero nè su plasma. 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 21 M205 Rev.10 06/2010 Pag. 11/24

12 ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUALITATIVE AND/OR SEMIQUANTITATIVE DETECTION OF EPSTEIN-BARR VIRUS IgG ANTIBODIES ANTI-EARLY ANTIGEN (EA IgG) IN HUMAN SERUM FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS The Epstein-Barr Virus Early Antigens (EBV-EA) are viral proteins in early phase made of the lithic infection. The anti-ebv-ea serological antibodies detection by indirect immunofluorescence (IFA) was used, for a long time, in association with the detection of IgG and IgM directed towards capsidic antigens (VCA) and the detection of IgG directed towards a nuclear antigen (EBNA-1) to make the diagnosis of infective mononucleosis (IM). Recently, it was proved that the enzyme immunoassay for serological IgG and IgM towards two early proteins, p138 and p54, has a good correlation with IFA, therefore, it could be used it, not only as complement in antibodies anti-vca detection, but also in substitution of them for IM diagnosis. The RADIM kit for enzyme immunoassay detection of anti-ebv-ea IgG and IgM uses recombinant polypeptides from E.Coli containing epytopes of p138 and p54 proteins. 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where horseradish peroxidase is used as enzyme conjugate. The wells are coated with EBV early antigens recombinant proteins (p138 and p54 epytops). During the first incubation, the sample anti-ea IgG antibodies, if any, are bound to the EA antigen coated wells. A wash cycle eliminates all unbound material. In the incubation that follows, a second antibody (anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase) will bind to the EA-antigen-antibody complex. After a further wash cycle a colorless Chromogen solution (tetramethylbenzidine, TMB) in a substrate-buffer is added to the wells, where it yields a colored compound, by reacting with the peroxidase enzyme. Color development will be stopped by adding H 2 SO 4. The color intensity, measured in a spectrophotometer at 450 nm, will thus be directly proportional to the anti-ea IgG antibody concentration in controls and samples. 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY The reagents are sufficient for 96 wells. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each reagent is shown on the vial label. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 12/24

13 MTP CONJ CONTROL + C/O CONTROL DIL SORB G Coated Microplate: 1 microplate of 96 breakable wells, coated with EBV early antigen recombinant proteins. Keep unused wells at 2-8 C in the provided polythene bag with the silica gel, accurately sealed. Once opened the coated microplate is stable for 5 weeks if stored at 2-8 C. Enzyme Conjugate: 1 vial (15 ml) of mouse monoclonal antihuman IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRPO) in phosphate buffer. Preservative: Bronidox (0.02%) and Phenol (0.05%). Ready for use. Once opened, it is stable for 5 weeks if stored at 2-8 C. Positive Control: 1 vial (2 ml) of human serum at known concentration of anti-ea IgG, in phosphate buffer 0.01 mol/l and 1% BSA. Preservative: NaN 3 (0.09%). Ready for use. Once opened, it is stable for 5 weeks if stored at 2-8 C. Cut-Off Control: 1 vial (2 ml) of human serum at known concentration of anti-ea IgG in phosphate buffer 0.01 mol/l and BSA 1%. Preservative: NaN 3 (0.09%). Ready for use. Once opened, it is stable for 5 weeks if stored at 2-8 C. Negative Control Ref. CN1328 (INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS) 1 vial (2 ml) of human serum in phosphate buffer 0.01 mol/l and 1% BSA. Preservative: NaN 3 (0.09%). Ready for use. Once opened, it is stable for 5 weeks if stored at 2-8 C. Sample Diluent Ref. SD1332 (INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS) 1 vial (100 ml) of phosphate buffered saline (PBS) containing proteins 10% w/v and methyl orange as dye. Preservative: 0.09% NaN 3. Ready for use. Once opened the Sample Diluent is stable until the expiry date if store at 2-8 C. Sorbent G - Ref. SG vial (7 ml) of phosphate buffered saline and bovine serum. Preservative: NaN 3 (0.09%). Ready for use. Once opened, it is stable 5 weeks if stored at 2-8 C. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 13/24

14 SUBS WASH 10X Substrate Buffer - Ref. SB1331 (INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS) 3 vials (12 ml) containing 0,26 mg/ml tetramethylbenzidine (TMB) and 0,01% H 2 O 2 stabilized in 0,05 mol/l citrate buffer (ph 3,8). Ready for use. Once opened, it is stable up to its expiry date if stored at 2-8 or 1 week at room temperature. Keep in the dark. Washing Solution (concentrated) Ref. SL1333 (INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS) 1 vial (100 ml) of phosphate buffered saline, Brij 0.05%. Just before use, dilute the needed amount 1:10 with distilled H 2 O. In case of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37 C for a few minutes. Store the diluted Washing Solution for 5 days at room temperature or for two weeks at 2-8 C. STOP Blocking Reagent - Ref. RB1334 (INTERCHANGEABLE BETWEEN LOTS) 1 vial (16 ml) containing 0.3M H 2 SO 4. Ready for use. CPA Adhesive plate sealers. Grip plastic bag. 4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Test Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Incubator, adjustable at 37±2 C. Normal laboratory glassware: cylinders, test-tubes, ecc. Automatic Microplate washer. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a A interval at 450 and 405 nm. Distilled or deionized H 2 O. 4.2 Automatic Test This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 14/24

15 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents of different lots, if not otherwise indicated. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify the "Assay Procedure" in any way. Altering volume of reagent added exact temperature and incubation times may cause incorrect clinical results. In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that all the equipment used (glassware, incubators, plate shakers, plate washers, spectrophotometers and fridge/freezers used for reagent and sample storage) is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Any deviation from the correct use of the equipment listed can produce errors in the methodology, this may affect the reproducibility and reliability of results obtained. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Substrate Buffer and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All the material of human origin used for the preparation of this kit has been tested by using an FDA approved method and found negative for HBsAg, anti- HIV 1/2 and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 15/24

16 Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. Some components contain sodium azide as preservative which may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. Therefore, these reagents shouldn t be discarded into phreatic water, streams or sewers. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. 6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum samples. Strongly Lipemic, icteric or contaminated samples should be avoided. Keep samples properly stored at 2-8 C for 1-2 days; for longer periods it is advisable to freeze serum samples at -20 C. Samples can be thawed a maximum of 3 times and shouldn t be kept in autodefrosting freezers. The test is not applicable to human plasma. Before use, dilute samples 1:26 with diluted Sample Diluent (Example: 40 µl sample µl diluent). 7. ASSAY PROCEDURE* Allow the reagents and samples to warm up at room temperature. Mix samples by inversion before use. Prepare the washing buffer by diluting the Washing Solution 10x (100 ml ml H 2 O). 7.1 Prepare the wells in duplicate for Controls and in single for Blank. It would be preferred testing samples in duplicate. 7.2 Pipette 50 µl of Sorbent G and 50 µl of diluted Samples into the corresponding wells. 7.3 Pipette 100 µl of Controls into the corresponding wells. Note: Controls must not be diluted. 7.4 Cover the microplate with the adhesive sheet (supplied with the kit) and incubate the wells for 45 minutes at 37 ± 2 C. 7.5 Wash the wells 4 times (30 sec. each one) with 350 µl of diluted Washing Solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.6 Add 100 µl of Enzyme Conjugate into all wells except for Blank. 7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and incubate the wells for 45 minutes at 37 ± 2 C. 7.8 Wash the wells as described in point Pipette 100 µl of Substrate Solution into all wells. M205 Rev.10 06/2010 Pag. 16/24

17 7.10 Incubate the wells for 15 minutes at room temperature (18-25 C). Avoid direct light exposure Pipette 100 µl of Blocking Reagent into all wells Read the absorbance of the wells at 450 nm possibly with a bichromatic spectrophotometer, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument at zero with the Blank well). Reading must be completed within 30 minutes from the end of the assay. * While using for the procedure a Radim and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 8. ASSAY SCHEME: see p CALCULATION OF RESULTS* 9.1 Qualitative results The optical density of each negative, positive and cut-off control must be considered. The presence or absence of anti-ea EBV IgG antibodies is defined by comparing the sample absorbance with the absorbance of the Cut-off Control (threshold value). Samples with optical density lower than the cut-off control are to be considered nonreactive for anti-ea IgG antibodies. Samples with optical density higher than the cutoff control are to be considered reactive for anti-ea IgG antibodies. Samples with absorbance values ranging within ± 20% of the cut-off control are to be considered doubtful and should be retested for confirmation. 9.2 Semi-quantitative results Sample O.D. INDEX = Cut-off O.D. This is considered like an "index" value of positiveness. Sample classification INDEX Positive > 1.2 Doubful ± 20% Cut-off Negative < Control of expected values Before proceeding to calculation of results subtract the value of blank ( 0.150), make sure that Control/Cut-off absorbance ratios are included within the following ranges: M205 Rev.10 06/2010 Pag. 17/24

18 Description Expected values Negative Control/Cut-off 0.6 Positive Control/Cut-off 1.5 O.D. Cut-off at 450 nm 0.2 O.D. Cut-off at 450/620 nm 0.16 If the values obtained are not within the expected range, it will be necessary to repeat the assay. * While using a Radim and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. 9.4 Calculation example The following values must be taken as an example and should not be used in place of experimental data. Description O.D. 450 nm Negative Control Cut-off Control Positive Control Sample The tested sample comes out positive for anti-ea EBV IgG antibodies. 9.5 Interpretation of Results Non-reactive samples are to be considered negative for anti-ea IgG antibodies. Reactive samples are to be considered positive for anti-ea IgG antibodies. Doubtful samples must be critically evaluated or repeated for confirmation. If the result is doubtful even on the second assay, repeat the sample collecting. 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY 10.1 Analytical Specificity 10 samples which were negative for anti-ea IgG and which contained IgG anti- CMV, anti-herpes Simplex and anti-varicella, were tested. In no case did the presence of these antibodies interfere with the EBV EA IgG Eia Well kit Diagnostic Sensitivity and Specificity M205 Rev.10 06/2010 Pag. 18/24

19 118 samples were analysed, 58 of which were negative and 60 positive. The comparative method (another commercial ELISA kit) gave 67 and 51 samples, respectively; those which were not in agreement were tested with the other serological parameters typical of Epstein Barr Virus infection, and 5 showed the typical pattern of an acute EBV infection in progress, confirming the positive results. The results are the following: RADIM + - REFERENCE Radim kit has shown a sensitivity of 98.2% and specificity of 93.4% PRECISION Repeatability (Within run) Precision between 3 different lots: Cut-off n=15 Lot 014 Lot 015 Lot 016 O.D CV% Reproducibility Between run and between lots precision: INDEX Samples Lot 014 Lot 015 Lot 016 Average CV% LIMITS OF THE ASSAY M205 Rev.10 06/2010 Pag. 19/24

20 The results obtained can only be used as a guide in the diagnosis and must always be evaluated together with results of other diagnostic procedures. There is the possibility of cross-reactions with samples containing anti-e. coli antibodies. Performance characteristics have not been determined for a visual interpretation, nor have they been evaluated in patients affected by nasopharyngeal carcinoma, Burkitt s lymphoma or other lymphadenopathies associated with EBV, apart from EBV-related mononucleosis. As anti-ea IgG antibodies are present in normal convalescent sera, the diagnosis cannot be established on the basis of a single parameter. An accurate interpretation of an EBV infection must be based on the results of VCA IgG, VCA IgM, EBNA IgG, EA IgG and EA IgM, in addition to heterophyle antibodies. The test must be performed on serum. The use of blood or plasma has not been established. 12. SYMBOLS LEGEND: see p. 21 M205 Rev.10 06/2010 Pag. 20/24

21 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití M205 Rev.10 06/2010 Pag. 21/24

22 Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M205 Rev.10 06/2010 Pag. 22/24

23 BIBLIOGRAFIA - REFERENCES 1. Gorgievski H. M.Hinderer W. et al.: Serodiagnosis of infectious mononucleosis by using recombinant Epstein-Barr Virus antigens and enzyme-linked immunosorbent assay technology. J. Clin. Microbiol. 28: 2305 (1990). 2. J. Middeldorp and P. Herbrink: Epstein Barr Virus specific marker molecules for early diagnosis of infectious mononucleosis. J. Vir. Methods 21: 133 (1988). 3. J. Luka, R. C. Chase and G. Pearson: A sensitive enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) against the major EBV-associated antigens. I. Correlation between ELISA and immunofluorescence titers using purified antigens. J. Immunol. Methods 67: 145 (1984). 4. Motz M., Fan J., Seibl R. and Wolf H.: Expression of the Epstein-Barr Virus 138 kda early protein E. coli for the use as antigen in diagnostic tests. Gene 42: (1986). M205 Rev.10 06/2010 Pag. 23/24

24 SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/26 Pozzetti, Wells Bianco, Blanck CONTROL CONTROL + C/O Campioni, Samples Reag. SORB G µl Campioni, Samples µl CONTROL µl CONTROL µl C/O µl Incubare, Incubate: 45' 37± 2 C Lavare, Wash: 4 x 350 µl. CONJ µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 45' 37± 2 C Lavare, Wash: 4 x 350 µl. SUBS 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 15' T.A. STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: 450 nm. RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -