BEIA Syphilis IgM Capture 22565

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1 BEIA Syphilis IgM Capture Edizione 20/04/2013 Solo per uso professionale TECHNOGENETICS SRL N Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

2 INTRODUZIONE Il kit BEIA Syphilis IgM Capture è un test immunoenzimatico qualitativo (ELISA) per la determinazione nel siero degli anticorpi di classe IgM specifici verso il Treponema pallidum. SIGNIFICATO CLINICO La ricerca delle IgM anti-treponema pallidum in parallelo al test per le IgG specifiche costituisce un parametro utile per la diagnosi sierologica della sifilide primaria, quella in fase avanzata non curata, per il monitoraggio della terapia, per la diagnosi dell infezione congenita e la definizione dello stadio della malattia. La ricerca degli anticorpi di classe IgM anti-treponema pallidum, viene solitamente eseguita con test di immunofluorescenza con adsorbimento (FTA-ABS-M). Tale test è però affetto da soggettività nell interpretazione dei risultati e da scarsa affidabilità, in particolar modo se viene effettuato su siero non frazionato.in questo ultimo caso si possono avere risultati falsi positivi causati da fattori reumatoidi (RF), oppure una riduzione della sensibilità causata dalla competizione delle IgG anti-treponema pallidum presenti in concentrazioni elevate. Il kit BEIA Syphilis IgM Capture è un metodo d analisi automatizzabile per la determinazione delle IgM specifiche anti- Treponema pallidum, dotato di maggiore sensibilità e specificità rispetto ad altre tecniche di uso routinario, che consente inoltre, grazie alla tecnologia immunocapture di superare le problematiche sopracitate dell FTA-ABS. PRINCIPIO DEL METODO Il test BEIA Syphilis IgM Capture è un dosaggio ELISA basato sulla tecnica a cattura. I campioni da esaminare vengono incubati nei micropozzetti sensibilizzati con anticorpi monoclonali anti-igm umane. Le IgM del campione vengono catturate dagli anticorpi presenti sulla fase solida. Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non legati alla fase solida, la presenza di IgM anti- Treponema pallidum viene rilevata attraverso il legame con una miscela di proteine ricombinanti purificate del T.pallidum, coniugata con perossidasi. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

3 Dopo allontanamento del complesso non legato viene aggiunto il Substrato-TMB che, per azione dell enzima presente sulla fase solida, sviluppa una colorazione azzurra. L aggiunta di una soluzione di acido solforico 0,3 M blocca la reazione e provoca il viraggio del colore dall azzurro al giallo. La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla quantità di IgM specifiche presenti nel campione in esame. CONTENUTO DELLA CONFEZIONE La confezione è sufficiente per 96 determinazioni. Componente SORB A Strip da 8 micropozzetti frazionabili 12x8x1 CONTROL - B Controllo Negativo 1 x 1.6 ml CAL CO C Calibratore Cut-Off 1 x 2.5 ml CONTROL + D Controlo Positivo 1 x 1.6 ml DIL SPE E Diluente Campioni 1 x 100 ml CONJ F Coniugato 1 x 15 ml BUF WASH 10X G Tampone di Lavaggio 1 x 100 ml SUBS TMB H Substrato-TMB 1 x 15 ml H2SO4 K Soluzione Stoppante 1 x 15 ml Istruzioni per l uso 1 A. Strip sensibilizzate Strip sensibilizzate con anticorpi monoclonali anti-igm umane, in busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella busta e richiudere. Le strip sono frazionabili in pozzetti singoli. B. Controllo Negativo Siero umano negativo per anticorpi IgM anti-t.pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. C. Calibratore Cut-off Siero umano a concentrazione nota di anticorpi IgM anti-t. pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all uso. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

4 D. Controllo Positivo Siero umano positivo per anticorpi IgM anti-t.pallidum. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto all'uso. E. Diluente Campioni Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine 10% p/v. Contiene 0,09% di sodio azide come conservante e colorante (metilarancio). Reagente pronto all'uso F. Coniugato Soluzione contenente proteine ricombinati del T. pallidum marcate con perossidasi. Contiene fenolo 0.05% e Bronidox 0.02%. Reagente pronto all uso. G. Tampone di Lavaggio Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 10 volte contenente Brij 0.5%. Vedi Preparazione dei reagenti. H. Substrato-TMB Soluzione contenente H2O2/TMB e stabilizzanti. Reagente pronto all'uso. I. Soluzione Stoppante Soluzione 0.3 mol/l di acido solforico. Reagente pronto all'uso. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8 C al riparo dalla luce. Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza del kit riportata sull etichetta. I reagenti hanno una stabilità limitata dopo apertura e/o preparazione: Micropiastra 5 settimane 2-8 C in busta di polietilene Controlli Coniugato Substrato Diluente Campioni Tampone di Lavaggio Soluzione stoppante: 5 settimane 2-8 C 5 settimane 2-8 C Fino data scadenza a 2-8 C, 1 sett. a C al buio Fino data scadenza a 2-8 C Ricostistuito 2 settimane a 2-8 C, 5 giorni a C. Fino data scadenza a 2-8 C Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

5 REAGENTI INTERCAMBIABILI I Diluente Campioni, il Tampone di Lavaggio, il Substrato-TMB e la Soluzione Stoppante ed il Controllo negativo sono intercambiabili tra lotti diversi. Tutti i reattivi del kit NON sono intercambiabili con gli altri kit della linea BEIA. MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI Incubatore a 37 C Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm. Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di micropiastre. Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µl. Provette monouso e normale vetreria da laboratorio. Acqua distillata o deionizzata. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente (18-25 C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi. Evitare l'essiccamento dei pozzetti. Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita. Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti diversi. Cambiare il puntale tra un campione e l altro. Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad azzurro, il reagente non deve essere utilizzato. Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione del campione. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

6 Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire. Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle pipette e del lettore. AUTOMAZIONE Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio deve essere eseguito su siero. Non è possibile utilizzare il Plasma. Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni possono essere conservati a 2-8 C. In caso contrario aliquotare i campioni e congelarli a -20 C. Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l uso di campioni lipemici, torbidi ed emolizzati. I campioni devono essere diluiti 1:51 con il Diluente Campioni BEIA Syphilis IgM Capture prima del dosaggio PREPARAZIONE DEI REAGENTI Tampone di Lavaggio BEIA Syphilis IgM Capture Diluire il Tampone di Lavaggio (10x) 1:10 con acqua distillata o deionizzata prima dell'uso. Nel Tampone di Lavaggio concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si solubilizzano portando il reagente a 37 C prima della diluizione. Si raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

7 CICLO DI LAVAGGIO Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi manualmente. 1. Svuotare completamente i pozzetti. 2. Riempirli con 300 µl di tampone di lavaggio. 3. Svuotare i pozzetti. 4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli. 5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti al termine del lavaggio. ESECUZIONE DEL TEST Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno minuti a C). 1. Diluire (1:51) i campioni in esame con il Diluente Campioni BEIA Syphilis IgM Capture System (esempio 10 µl di siero e 500 µl di Diluente Campioni. Agitare su Vortex. 2. Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione del numero di campioni in esame, del Calibratore Cut-off e dei Controlli (vedi Schema del dosaggio ). Richiudere accuratamente la busta. 3. Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L di ciascun siero in esame prediluito, del Calibratore Cut-off e dei Controlli. 4. Coprire la micropiastra con un foglio adesivo ed incubare a temperatura di 37 C per 45 minuti. 5. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di coniugato. 7. Coprire la piastra con un foglio adesivo ed incubare a temperatura di 37 C per 45 minuti. 8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio). 9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µl di Substrato-TMB. 10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25 C) per 15 minuti. 11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun pozzetto 100 µl di Soluzione Stoppante. 12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

8 CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA Le condizioni che consentono l accettazione dei risultati sono : La DO del Controllo Positivo dev essere 1.5 la DO del Calibratore Cut-off. il rapporto tra la DO del Controllo Negativo e la DO del Calibratore Cut-off dev essere < 0.6 La DO del Controllo Cut-off dev essere 0.2 a 450 nm e > 0,16 a 450/620 nm. Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed alla gestione di eventuali non conformità. CALCOLO DEI RISULTATI Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l index anticorpale (I.A.) con la seguente formula: DO campione Index anticorpale (I.A.) = DO Calibratore Cut-off Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore medio di densità ottica (DO). Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

9 INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi: Qualitativo IA > 1.2 < INTERPRETAZIONE Il campione è da considerare POSITIVO per la presenza di anticorpi di classe IgM anti- T. pallidum Il campione è da considerare NEGATIVO per la presenza di anticorpi di classe IgM anti- T. pallidum ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO per la presenza di anticorpi di classe IgM anti- T. pallidum Va tenuto presente che: - il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di classe IgM. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato infettivo; - una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo test, ma va fondata sull insieme dei dati clinici disponibili. Dati clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione, eventualmente con il conforto di test di conferma o di II livello; - risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test su un prelievo successivo; con il confronto con un test di riferimento. PRESTAZIONI DEL KIT Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo previsto dal fabbricante. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

10 SENSIBILITÀ & SPECIFICTA Sono stati testati 180 campioni di cui 5 sieri avevano diagnosi accertata di infezione da Treponema pallidum. Tutti i sieri sono stati testati con altro metodo immunoenzimatico e si è avuta una concordanza del 100% tra i due metodi sia sui campioni negativi che positivi. La sensibilità e la specificità risultano essere del 100 %. SPECIFICITÀ ANALITICA Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 11 mg/dl di bilirubina, fino a 1048 UI/mL di fattore reumatoide, fino a 1281 mg/dl di trigliceridi. L uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati viene comunque sconsigliato. RIPETIBILITÀ La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata ottenendo i seguenti risulatati: Intra-saggio TPM1 TPM2 TPM3 CUT-OFF CP N D.O CV% Inter-saggio INDEX CAMPIONE MEDIA CV% TMP TMP TMP CP LIMITAZIONI Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgM specifiche. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

11 PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni previste per l'esecuzione del test. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell area di laboratorio designata. Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca. Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando guanti monouso e camici. Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio. Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di lavoro eventualmente contaminate. Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme vigenti. Controllare periodicamente il grado di contaminazione dell'ambiente di lavoro e degli operatori. Reagenti contenenti siero I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e trovati negativi per HbsAg, anti-hcv ed anticorpi anti-hiv. Poiché nessun metodo può garantire che tali derivati non possano trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di manipolare i reagenti con le opportune cautele. Reagenti pericolosi Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritante per gli occhi e per la pelle S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un medico. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

12 SCHEMA DEL DOSAGGIO Preparare i reattivi Diluire i campioni 1:51 con il Diluente Campioni BEIA Syphilis IgM Capture Dispensare: 100 L di Controllo Negativo in singolo 100 L di Calibratore Cut-off in doppio 100 L di Controllo Positivo in singolo 100 L di campione prediluito in singolo o doppio, Incubare 45 minuti a 37 C Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Coniugato-HRP Incubare 45 minuti a 37 C Eseguire 4 cicli di lavaggio Dispensare 100 L di Substrato-TMB Incubare 15 minuti a T.A. (18-25 C) Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm A CN P5 B CC C CC D CP E P1.. F P2.. G P3.. H P4 Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

13 BEIA Syphlis IgM Capture Version 20/04/2013 For professional use only TECHNOGENETICS SRL Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

14 INTRODUCTION The BEIA Syphilis IgM Capture kit is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific IgM antibodies to Treponema pallidum, in human seru. CLINICAL RELEVANCE The determination of IgM anti-treponema pallidum in association to specific IgGs, is an useful diagnostic tool, for the serological diagnosis of primary syphilis, untreated syphilis in advanced phase and congenital infection besides being an aid for monitoring theraphy and defining the stage of disease. IgM anti-treponema pallidum are usually determined with absorption immunofluorescence tests (FTA-ABS-M) but this kind of tests can hardly be relied upon due to subjectivity of interpretation.moreover, false positive results can occur due to the presence of rheumatoid factors (RF) or sensitivity can be reduced due to competition with IgG anti-treponema pallidum when present in a great quantity. BEIA Syphilis IgM Capture is a test for the determination of specific IgM anti-treponema pallidum which can be performed in automation, more sensitive and specific than other routinary tests and better than FTA-ABS thanks to the immunocapture technology. PRINCIPLE OF THE ASSAY The BEIA Syphilis IgM Capture kit is a qualitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on capture method. During the first incubation, IgM antibodies present in serum bind to the inner surface of the wells coated with the monoclonal anti-human IgM. After the first incubation the wells are washed to remove nonreactive serum components. During the second incubation a Conjugate (Purified recombinant protein of Treponema pallidum labelled with HRP) binds only to the specific IgM anti-t. pallidum, bound in the anti-igm-igm complex present on the wells. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

15 After a second washing cycle, a Substrate - TMB solution is dispensed into the wells in order to detect specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic reaction is then stopped by adding a Stop Solution which changes to yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is directly proportional to the specific IgM anti-t. pallidum concentration in the patient samples. KIT COMPONENTS Package size: 96 tests. Component SORB A Coated Strip 12x8x1 CONTROL - B Negative Control 1 x 1.6 ml CAL CO C Cut-off Calibrator 1 x 2.5 ml CONTROL + D Positive Control 1 x 1.6 ml DIL SPE E Sample Diluent BEIA Syphilis IgM 1 x 120 ml capture CONJ F Conjugate BEIA Syphilis IgM capture 1 x 15 ml BUF WASH 10X G Wash Buffer BEIA Syphilis IgM 1 x 100 ml capture SUBS TMB H Substrate-TMB BEIA Syphilis IgM 1 x 15 ml capture H2SO4 I Stop Solution BEIA Syphilis IgM 1 x 15 ml capture Package Insert 1 A. Coated strips Breakable strips coated with monoclonal anti-human IgM antibodies packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and reseal. B. Negative Control Human serum negative for anti-t. pallidum IgM antibodies. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

16 C. Cut-off Calibrator Human serum containing anti-t. pallidum IgM antibodies with known concentration. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent. D. Positive Control Human serum positive for anti-t. pallidum IgM antibodies. Contains 0.09% w/w Sodium azide as preservative. Ready to use reagent E. Sample Diluent Buffered salt solution (PBS). Contains proteins 10% w/v, 0,09 % w/w Sodium azide and methyl orange as dye. Ready to use reagent. F. Conjugate Solution containing purified recombinant of T. pallidum conjugated with peroxidase (HRP) and stabilizers. Contains phenol 0.05% e Bronidox 0.02%. Ready to use reagent. G. Wash Buffer Buffered salt solution (PBS) 10x concentrated. Contains Brij 0.5%. See Preparation of reagents. H. Substrate-TMB Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered solution. Ready to use reagent. I. Stop Solution 0.3 mol/l Sulphuric acid solution. Ready to use reagent. STORAGE OF REAGENTS Store all reagents at 2-8 C avoiding exposure to light. Do not use reagents after the expiry date indicated on the label. Reagents have a limited stability after opening and/or preparation Microplate Controls Conjugate Substrate Sample Diluent Wash Buffer Stop solution: 5 wks 2-8 C polythjene bag 5 wks at 2-8 C 5 wks at 2-8 C up to exp date at 2-8 C, 1 wk at C in the dark up to exp date at 2-8 C Reconstituted 2 wks at 2-8 C, 5 days at C. up to exp date at 2-8 C Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

17 INTERCHANGEABLE REAGENTS The Sample Diluent, Wash Buffer, Substrate-TMB,Stop Solution and Negative Control are interchangeable between lots. All reagents are NOT interchangeable with the other kits of the BEIA line. MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED Incubator at 37 C Microplate reader with 450/620 nm filters. Manual or automated microplate washing device. Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L. Disposable pipettes and normal glassware. Distilled or deionised water. WARNINGS AND PRECAUTIONS Bring all reagents to room temperature (18-25 C) before use. Only take the quantity necessary for the assay. Avoid wells drying. Use clean glassware. Use a clean disposable pipette tip for each reagent. Use a clean disposable pipette tip for each sample. If the chromogenic substrate shows a change from pink to blue colour, discard the reagent. For repeated assays, each time provide for new diluted samples. Every analytical run should include control samples in order to validate the results, according to criteria and procedures established by each laboratory. Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate reader are required. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

18 AUTOMATION The test can be performed on automated ELISA processor. Please refer to specific instrument manual for proper applications. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The test can be performed only with serum. It s not possible to use plasma. Specimens may be stored refrigerated at 2-8 C up to 5 days. For longer storage they should be aliquoted and stored frozen at 20 C. Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed, lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be pre-diluted with Sample Diluent BEIA IgM Capture 1:51 prior to assay. See assay protocol. PREPARATION OF REAGENTS Wash Buffer (10 X) Dilute 1:10 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or deionised water. If crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, warm the solution to 37 C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay. WASHING CYCLES Both using a microplate washer and washing the plate manually, perform the following steps. 1. Empty the wells 2. Fill them with 300 µl of Wash Buffer. 3. Empty the wells 4. Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles 5. Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the washing cycles. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

19 ASSAY PROTOCOL Allow all reagents to reach room temperature leaving them at least minutes at C. 1. Dilute the samples to be assayed (1:51) with the Sample Diluent (i.e. 10 µl of serum and 500 µl of Sample Diluent). Shake on Vortex. 2. Select the number of strips required for the assay according to the number of samples to be assayed, the Negative Control, Cut-off Calibrator and the Positive Control (see paragraph Summary of protocol below). Reseal the pouch. 3. Dispense 100 µl of Negative Control, Cut-off Calibrator, Positive Control and of the diluted samples. 4. Cover the microplate and incubate at 37 C for 45 minutes. 5. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 6. Dispense 100 µl of conjugate-hrp complex in each well. 7. Cover the microplate and incubate at 37 C for 45 minutes. 8. Perform a washing cycle following the suggested procedure (see Washing Cycles). 9. Dispense 100 µl of Substrate-TMB in each well. 10. Incubate the plate at room temperature (18-25 C) for 15 minutes. 11. Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µl of Stop Solution into each well. 12. Read the optical density (O.D.) in bi-chromatism at 450/620 nm. CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS RUN VALIDATION CRITERIA Criteria used to validate the obtained results are the following: The OD for Positive Control must be 1.5 to the OD for the Cut-off Calibrator. The ratio of the OD for Negative Control the OD for the Cutoff Calibrator must be < 0.6 The OD for Calibrator Cut-off must be 0.2 at 450 nm and > 1.6 at 450/620 nm. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

20 If the above criteria are not met, the run is invalid and the results cannot be reported without a documented critical review of the data. The non conformity must be addressed and treated according to each laboratory s Quality Assurance procedures. Each lab should establish and follow its own internal Quality Control procedures and use the QC results to validate runs and manage non conformities. CALCULATION OF RESULTS In order to correlate the analytical results to the immunity of the sample results should be determined calculating the antibody index (A.I.) using the following formula: O.D. sample Antibody Index (A I) = O.D. Cut-off Calibrator For the Cut-off Calibrator calculate, if assayed in duplicate, the mean OD value (OD). INTERPRETATION OF RESULTS Results from our clinical trials, performed on samples representative of the European population, suggest the following interpretative criteria: QUALITATIVE A.I. > INTERPRETATION Sample should be considered POSITIVE for the presence of anti -T. pallidum IgM antibodies Sample should be considered NEGATIVE for the presence of anti-t. pallidum IgM antibodies. GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE for the presence of anti-t. pallidum IgM antibodies. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

21 Please consider that: - the test only detects specific IgM antibodies. It cannot per se and univocally be referred to as evidence of infection; - a medical decision cannot be made on the basis of a single test result but should be grounded on all the available clinical data; discrepancies in clinical data should be clarified prior to final decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2 nd level tests; - results within grey zone should be made clear: re-testing the same sample; testing a sample from another collection from the same patient; comparing the results with those of a reference test. PERFORMANCE DATA Warning: Data below do not represent the performance specifications of the kit, but only experimental evidence that the performance of the kit is within such specifications, as intended by the manufacturer. SENSITIVITY & SPECIFICITY The sensitivity and the specificity were assessed by testing 180 specimens of which 5 patients with diagnosed Syphilis infection. The samples were analysed with another commercial immunoenzymatic method: 100% agreement was found between the two method, both in the positive and in the negative samples. The sensitivity ans the specificity of the kit are of 100 %. ANALYTICAL SPECIFICITY No interference has been observed in samples with 11 mg/dl of bilirubin up to 1048 UI/mL of RF, up to 1281 mg/dl triglycerides. Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be used. REPEATABILITY The within-run and run-to-run variability were determined with the followings steps Intra-assay TPM1 TPM2 TPM3 CUT-OFF CP N D.O CV% Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

22 Inter-assay INDEX SAMPLE AVERAGE CV% TMP TMP TMP CP LIMITATIONS Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens may affect the detectable levels of specific IgM GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the procedural directions. Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab. Do not pipette solutions or samples by mouth. Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and samples. Avoid direct contact. Wash hands thoroughly after assay. Thoroughly clean working area with proper detergent solutions. Collect solid and liquid waste material in proper containers and provide for disposal according to the local regulations. Periodically check contamination level of operators and rooms. Reagents containing serum All components of human origin have been tested and found negative for HBsAg, anti-hcv and anti-hiv antibodies. Since no known test can guarantee, however, that products derived from human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious diseases, these reagents should be handled as hazardous material. Hazardous Reagents Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC) R36/38 Irritating to eyes and skin. S26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water, and seek for medical advice. Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

23 SUMMARY OF PROTOCOL Prepare reagents Pre-dilute samples 1:51 with Sample Diluent BEIA Syphilis IgM capture Dispense: 100 L of Negative Control (single) 100 L of Cut-off Calibrator (duplicate) 100 L of Positive Control (single) 100 L of pre-diluted samples in single or duplicate Cover and incubate 45 minutes at 37 C Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Conjugate-HRP Cover and incubate 45 minutes at 37 C Perform 4 washing cycles Dispense 100 L of Substrate-TMB Incubate 15 minutes at R.T. (18-25 C) Dispense 100 L of Stop Solution Read the O.D. at 450/620nm A NC P5 B CC C CC D PC E P1.. F P2.. G P3.. H P4 Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013

24 BIBLIOGRAFIA / REFERENCES - L.Lewis et al: Evaluation of immunoglobulin M Western Blot analysis in the diagnosis of congenital syphilis. J. Clin. Mirobiolol. 28: 296 (1990). - G.Dettori, R.Grillo, et al.: Evaluation of western immuno-blotting technique in the serological diagnosis of human syphilitic infections. Eur. J. Epidemiol. 5 :22 (1989) - G.B. Wisdom: Enzyme-Immunoassay. Clin.Chem. 22:1243 (1976) - S.A. Lukehart: Identification and characterization of Treponema pallidum antigens by monoclonal antibodies. in: Monoclonal Antibodies, Academic Press 1986, p.1. - S.Norris, S. Sell Antigenic complexity of Treponema pa-lidum : antigenicity and surface location of major polipeptide. The Journ. of Immun. 133 : A.A. Codd, M.S. Sprott et al. Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for Treponema pallidum antibodies. J. Med. Microbiol. 26:153 (1988). - P.A. Hanff, S.J. Norris et al. Purification of Treponema pallidum, Nichols strain, by Percoll density gradient centrifugation. Sexually Trasmitted Diseases 11:275 (1984). - J.D. Radolf, N.R. Chamberlain et al. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect. Immunity 56:490 (1988). Pag BEIA Syphilis IgM Capture Ed. 20/04/2013