TETANUS TOXIN IgG 5S E.W.

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1 TETANUS TOXIN IgG 5S E.W. REF K12TEG5S 96 Italiano p. 3 English p.13 M470 Rev. 1 02/2008

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. MTP 1 x 96 Pronti per l'uso, Ready for use DIL 1 x 105 ml Pronto per l'uso, Ready for use STOP 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use WASH 1 x 50 ml Conc. CONJ 1 x 20 ml Pronto per l'uso, Ready for use TMB SUBS 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use CAL 5 x 2 ml Pronti per l'uso, Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo "The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website "Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση "In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden". "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse "Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M470 Rev.1 02/2008 Pag. 2/24

3 Test immunoenzimatico per la determinazione quantitativa degli anticorpi di classe IgG per la tossina del Clostridium tetani nel siero o plasma umano Solo per uso diagnostico in vitro 1. INTRODUZIONE Il Clostridium tetani é un batterio sporigeno gram-positivo. Le spore sono formate da una parte terminale circolare e, viste al microscopio, hanno la forma di una racchetta da tennis. Il tetano si sviluppa solo quando le spore del Clostridium tetani germinano in condizioni di stretta anaerobiosi, dopo essere venute in contatto con ferite e lievi lacerazioni. La manifestazione clinica della malattia non è causata principalmente dall invasione dell agente eziologico ma dalla secrezione di una potente neurotossina (tetanospasmina). Questa tossina blocca l inibizione della trasduzione del segnale ed ha un alta affinità per il sistema nervoso centrale. La conseguenza è una iper-eccittabilità dei muscoli a stimoli esterni, in combinazione con un incremento della contrazione muscolare involontaria. Si manifesta con contrazioni muscolari spastiche nella regione mandibolare (trisma) e occipitale e poi a seguire in corrispondenza di collo, colonna vertebrale ed addome. Allo stesso tempo la comparsa di spasmi prolungati dell intera muscolatura può ostacolare la respirazione e determinare la comparsa di problemi di iper-salivazione e di deglutizione. Il Clostridium tetani è un microrganismo ubiquitario presente nel terreno e nell intestino umano e degli animali. L ingestione del batterio o la crescita nell intestino dell uomo e dell animale non reca danni. Le spore sono estremamente resistenti al calore e rimangono infettive per molto tempo. I batteri possono penetrare sotto la cute anche attraverso ferite molto piccole. In Europa il tetano si manifesta principalmente a seguito di ferite e, talvolta, nel periodo post-operatorio, mentre nei paesi in via di sviluppo il tetano è ampiamente diffuso. Il WHO presume che a livello mondiale un milione di persone all anno muoiano a causa del tetano. La tossina tetanica è un ottimo immunogeno nell uomo. L unico modo efficace per controllare il tetano è attraverso l immunizzazione attiva fornita dalla profilassi vaccinica. Specie Malattia Sintomi Modalità d infezione Clostridium tetani Tetano Spasmi violenti e dolorosi e rigidità dei muscoli volontari, seguiti da insufficienza cardiaca, renale e circolatoria. Trasmissione: contatto di una ferita con il batterio o inoculazione. L infezione può essere diagnosticata attraverso: Microscopia: colorazione di Gram Sierologia: Determinazione della produzione di tossina mediante tecnica ELISA M470 Rev.1 02/2008 Pag. 3/24

4 2. USO PREVISTO Il Tetanus Toxin IgG 5S E.W. è un kit per la determinazione quantitativa degli anticorpi di classe IgG specifici per la tossina del Clostridium tetani nel siero o plasma (citrato) umano. Attraverso il suo utilizzo si determina lo stato di immunità dei pazienti e si verifica la necessità di un immunizzazione di base o di vaccini di richiamo. 3. PRINCIPIO DEL TEST La determinazione quantitativa degli anticorpi di classe IgG per la tossina del Clostridium tetani si basa sul principio ELISA. I pozzetti della micropiastra contengono una fase solida sensibilizzata con antigeni della tossina tetanica inattivata (tossoide) del Clostridium tetani. Anticorpi specifici presenti nel campione si legano alla tossina immobilizzata sui pozzetti. Gli anticorpi del coniugato (anticorpi anti-igg umane con perossidasi di rafano) si legano ai complessi antigene (fase solida)-anticorpo (paziente) nei campioni positivi. Questi complessi vengono evidenziati da una colorazione blu dopo l incubazione con la soluzione TMB. L intensità di questa colorazione è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi di classe IgG specifici per il Clostridium tetani presenti nel campione. Bloccando la reazione enzimatica con acido solforico si determina un cambiamento di colore dal blu al giallo, che può essere misurato facilmente con un fotometro per micropiastre ELISA a 450 nm. 4. MATERIALI 4.1. Reagenti forniti MTP Micropiastra sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti (12x8) divisibili, con adesa la tossina inattivata (tossoide) del Clostridium tetani; sigillata sotto vuoto, all interno di una busta d alluminio richiudibile. DIL Diluente campione IgG***: 1 flacone contenente 105 ml di tampone per diluire i campioni; ph 7.2 ± 0.2, color giallo, pronto all uso. STOP Soluzione Stop: 1 flacone contenente 15 ml di acido solforico, 0.2 mol/l, pronto all uso. WASH Tampone di lavaggio (20x)*: 1 flacone contenente 50 ml di un tampone concentrato 20 volte per il lavaggio dei pozzetti, ph 7.2 ± 0.2. CONJ Coniugato Enzimatico**: 1 flacone contenente 20 ml di anticorpi di coniglio anti-igg umane, coniugati con perossidasi; color rosso, pronto all uso. TMB SUBS Soluzione TMB-Substrato: 1 flacone contenente 15 ml di 3,3`,5,5`- Tetrametilbenzidina (TMB), pronto all uso. CAL Calibratori***: 5 flaconi da 2 ml, pronti all uso. CAL 0 : 0.0 IU/ml CAL 1: 0.1 IU/ml CAL 2: 0.5 IU/ml CAL 3: 1.0 IU/ml CAL 4: 5.0 IU/ml * contiene: 0.2 % Kathon ** contiene: 0.2 % Bronidox L *** contiene: 0.1 % Kathon e 0.09% Sodio Azide M470 Rev.1 02/2008 Pag. 4/24

5 4.2. Accessori forniti 2 pellicole adesive 1 supporto per micropiastre 1 istruzione per l uso 1 schema per la distribuzione ed identificazione di campioni e calibratori 4.3. Materiali e attrezzature necessari Dosaggio Manuale Fotometro per micropiastre con filtri da 450/620 nm Incubatore a 37 C Lavatore per micropiastre Micropipette con puntali monouso (10, 100, 200, 1000 µl) Vortex-Mixer Provette monouso Supporto per provette Acqua deionizzata o distillata Timer Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l'applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC. Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori è responsabilità dell'utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta del flacone, se conservati a 2 8 C 6. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C) prima dell uso! 6.1. Micropiastra sensibilizzata I pozzetti con adesi gli antigeni del tossoide inattivato del Clostridium tetani sono separabili e sigillati sotto vuoto. I pozzetti, pronti all uso, devono essere conservati a 2-8 C. Riporre i pozzetti non utilizzati nel sacchetto di alluminio con l essiccante fornito. Il prodotto è stabile fino alla data di scadenza indicata sull etichetta, se conservato a 2-8 C Coniugato Enzimatico Il flacone contiene 20 ml di anticorpi anti-igg umane coniugati con perossidasi di rafano, tampone, stabilizzanti, conservanti e un colorante inerte rosso. La soluzione è pronta per l uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone, se conservato a 2-8 C Calibratori I flaconi contengono 2.0 ml di soluzione pronta all uso. Le concentrazioni dei calibratori, tarati rispetto al 1 st International Standard for TETANUS IMMUNOGLOBULIN, HUMAN (Code TE-3) M470 Rev.1 02/2008 Pag. 5/24

6 dell Istituto Nazionale per gli Standard e il Controllo Biologico (NIBSC), Potters Bar (UK), sono le seguenti: CAL 0: 0.0 IU/ml CAL 1: 0.1 IU/ml CAL 2: 0.5 IU/ml CAL 3: 1.0 IU/ml CAL 4: 5.0 IU/ml Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone, se conservato a 2-8 C Diluente Campione IgG Il flacone contiene 105 ml di tampone fosfato, stabilizzanti, conservanti e un colorante giallo inerte. La soluzione, pronta all uso, viene utilizzata per diluire i campioni. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone, se conservato a 2-8 C Tampone di Lavaggio (20x) Il flacone contiene 50 ml di un tampone concentrato, detergenti e conservanti. Una volta aperto, il tampone concentrato é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C. Diluire il contenuto con acqua deionizzata o distillata (1 + 19), es.: 10 ml di Tampone di Lavaggio ml di acqua deionizzata o distillata. Una volta diluito, il tampone é stabile 5 giorni se conservato a temperatura ambiente. Se sono presenti cristalli, scioglierli in bagnomaria a 37 C prima di diluire. Nota: Preparare solo il volume di tampone di lavaggio necessario per l esecuzione del dosaggio Soluzione TMB-Substrato Il flacone contiene 15 ml di 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno. Il reattivo è pronto all uso e deve essere conservato a 2-8 C, al buio. La soluzione é incolore o celeste chiaro. Nel caso in cui diventasse blu significa che é contaminata e non può essere più usata. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone, se conservato a 2-8 C Soluzione Stop Il flacone contiene 15 ml di acido solforico 0.2 mol/l, pronto all uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone, se conservato a 2-8 C. 7. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Usare campioni di siero o plasma (citrato) umano. Se il test viene effettuato entro 5 giorni dal prelievo i campioni devono essere conservati a 2-8 C, altrimenti devono essere aliquotati e congelati a C. Agitare bene i campioni scongelati prima di diluirli. Evitare cicli ripetuti di congelamento/scongelamento Diluizione dei campioni Prima dell esecuzione del test diluire i campioni con il Diluente Campione IgG. Per esempio, dispensare nelle provette 10 µl di campione + 1 ml di diluente e mescolare bene (Vortex). I calibratori sono pronti all uso e non necessitano di diluizione. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 6/24

7 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparazione del test Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il dosaggio. Per ottenere risultati validi é indispensabile seguire esattamente le istruzioni. Per l esecuzione manuale del test seguire la procedura di seguito riportata. Prima di iniziare il dosaggio stabilire lo schema di distribuzione ed identificazione di campioni e controlli sul foglio di lavoro fornito con il kit. Prelevare il numero di strips o di pozzetti necessari ed inserirli nel supporto per micropiastre. Utilizzare almeno: 1 pozzetto (es. A1) per il Bianco (blank) 5 pozzetti (es. B1, C1, ecc.) per i Calibratori 0, 1, 2, 3 e 4 È consigliato eseguire ogni analisi in duplicato. Eseguire il test nell ordine stabilito dalle istruzioni, senza pause. Utilizzare puntali nuovi e puliti per ogni campione e calibratore. Regolare l incubatore a 37 ± 1 C. 1. Dispensare 100 µl di ogni calibratore e dei campioni diluiti nei rispettivi pozzetti. Usare il pozzetto A1 per il bianco. 2. Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva. 3. Incubare 1 ora ± 5 min a 37 ± 1 C. 4. Al termine dell incubazione, togliere la pellicola ed aspirare il liquido dai pozzetti. Successivamente lavare i pozzetti tre volte con 300 µl di tampone di lavaggio. Evitare che la soluzione trabocchi dai pozzetti. L intervallo tra il lavaggio e l aspirazione deve essere almeno di 5 sec. Dopo il lavaggio picchiettare delicatamente i pozzetti con l apertura verso il basso su una carta assorbente per togliere completamente il liquido. Attenzione: Il lavaggio é una fase critica. Un lavaggio non accurato determina una cattiva precisione del test ed un innalzamento falsato delle densità ottiche. 5. Dispensare 100µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti, escludendo quello con il bianco (blank). Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva. 6. Incubare 30 min a temperatura ambiente ( C). Non esporre a fonti di luce diretta. 7. Ripetere il lavaggio come indicato nel punto Dispensare 100µl di Soluzione TMB-Substrato in tutti i pozzetti. 9. Incubare esattamente per 15 min a temperatura ambiente ( C), al buio. 10. Dispensare 100µl di Soluzione Stop in tutti i pozzetti, mantenendo lo stesso ordine e lo stesso tempo di dispensazione utilizzato per la soluzione TMB. Durante l incubazione il colore cambia dal blu al giallo. Attenzione: Campioni con un risultato altamente positivo possono causare precipitati scuri del cromogeno! Questi precipitati influenzano la lettura della densità ottica. In questo caso è consigliato diluire ulteriormente i campioni così come indicato nel paragrafo 7.1 Diluizione dei campioni. 11. Misurare l assorbanza di tutti i pozzetti a 450/620 nm entro 30 min dall aggiunta della Soluzione Stop. Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropriastre RADIM/SEAC, far riferimento al relativo manuale. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 7/24

8 8.2. Misurazione Regolare il fotometro per le micropiastre (ELISA-Reader) a zero usando il bianco (blank) in A1. Se, per motivi tecnici, non é possibile regolare il fotometro sottrarre l assorbanza del Bianco da tutti i valori delle altre assorbanze. Misurare l assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e inserire tutti i valori ottenuti nel foglio di lavoro. É raccomandato fare una misurazione delle densità ottiche a doppia lunghezza d onda utilizzando i 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile, calcolare la media delle assorbanze di tutti i duplicati. Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastra RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d onda: 450, 405, 620 nm, permettendo l ampliamento del range di lettura. 9. RISULTATI 9.1. Validazione del test Il test é valido se risponde ai seguenti criteri: Bianco in A1: Valore di assorbanza inferiore a Calibratore 0 in B1: Valore di assorbanza inferiore a Calcolo dei risultati Per ottenere i risultati quantitativi in IU/ml disegnare la curva di calibrazione su carta millimetrata riportando sull asse delle ordinate la media delle assorbanze dei Calibratori (0.0, 0.1, 0.5, 1.0 e 5.0 IU/ml) e sull asse delle ascisse le corrispondenti concentrazioni. Interpolando sulla curva di calibrazione le medie delle assorbanze relative a ciascun campione si otterranno le rispettive concentrazioni in IU/ml degli anticorpi IgG anti-tossina. Attenzione: I risultati dei campioni diluiti due volte devono essere moltiplicati per l appropriato fattore di diluizione per ottenere il valore corretto! (Diluizione 1+10 = Fattore di diluizione: 11) Tutti i programmi commercializzati per computer sono utilizzabili per calcolare ed interpretare i risultati Tipica curva di calibrazione Tetanus IgG E 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0, IU/ml M470 Rev.1 02/2008 Pag. 8/24

9 9.3 Interpretazione dei risultati [IU/ml] e raccomandazioni <0.01 Nessuna protezione, mancanza di anticorpi! Si raccomanda un ciclo completo di immunizzazione di base La protezione dall infezione non é assicurata! Si raccomanda una ripetizione dell immunizzazione e il controllo della concentrazione anticorpale dopo 4-6 settimane Protezione sicura dall infezione! Si raccomanda una ripetizione dell immunizzazione e il controllo della concentrazione anticorpale dopo 4-6 settimane Protezione sicura dall infezione! Si raccomanda un controllo della concentrazione di anticorpi dopo 2 anni. La ripetizione dell immunizzazione non è necessaria. Nota: In caso di una concentrazione di anticorpi maggiore di 0.5 IU/ml la vaccinazione può causare degli effetti collaterali! Protezione a lungo termine! Controllo raccomandato dopo 5-10 anni. >5.0 Protezione a lungo termine! Controllo raccomandato dopo 10 anni. 10. CARATTERISTICHE DEL TEST Precisione Ripetibilità: Intra-saggio n Media (IU/ml) CV (%) Siero debolmente pos Siero pos Riproducibilità: Inter-saggio n Media (IU/ml) CV (%) Siero debolmente pos Siero pos Specificità Diagnostica La specificità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica del kit é >95% Sensibilità Diagnostica La sensibilità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica del kit é >95%. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 9/24

10 10.4 Sensibilità Analitica La sensibilità analitica è definita come la concentrazione più piccola dell analita che può essere distinta dal Calibratore 0. Essa risulta <0.05 IU/ml Possibili interferenze Campioni emolitici, lipemici ed itterici contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, 5 mg/ml di trigliceridi e 0.2 mg/ml di bilirubina non hanno presentato fenomeni di interferenza con questo test. 11. LIMITI DELLA PROCEDURA Una contaminazione da microrganismi o ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono alterare i valori delle assorbanze. La diagnosi di una malattia infettiva non deve essere fatta soltanto sulla base della risultanza di un unico test. Una diagnosi precisa deve prendere in considerazione anche l anamnesi, i sintomi del paziente e i dati derivanti dalle analisi sierologiche. I risultati sierologici provenienti da pazienti immunosoppressi e dai neonati hanno un valore limitato. 12. PRECAUZIONI E AVVERTENZE In ottemperanza alla direttiva Europea 98/79/CE l uso dei dispositivi medico-diagnostici in vitro è inteso da parte del fabbricante ad assicurare la congruenza, le prestazioni e la sicurezza del prodotto. Di conseguenza la procedura analitica, le informazioni, le precauzioni e le avvertenze contenute nelle istruzioni per l uso devono essere seguite scrupolosamente. L uso dei kit con analizzatori e attrezzature similari deve essere previamente convalidato. Qualunque cambiamento nel progetto, nella composizione o struttura e nella procedura analitica, così come qualunque uso dei kit in associazione ad altri prodotti non approvati dal fabbricante non è autorizzato; l utilizzatore stesso è responsabile di questi eventuali cambiamenti. Il fabbricante non è responsabile di falsi risultati e incidenti che possano essere causati da queste ragioni. Il fabbricante non è responsabile di qualunque risultato ottenuto attraverso l esame visivo dei campioni dei pazienti. Solo per uso diagnostico in-vitro. Tutti i componenti di origine umana impiegati nella produzione dei reagenti contenuti nel kit sono stati trovati non reattivi agli anticorpi anti-hiv ed anti-hcv e all HBsAg. Nonostante ciò tutti i materiali devono comunque essere considerati e trattati come se fossero potenzialmente infettivi. La sodio azide, contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare la formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua durante l eliminazione dei reagenti. Non scambiare reagenti e strips di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri fabbricanti insieme ai reagenti di questo kit. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza indicata sull etichetta. Utilizzare soltanto attrezzatura (puntali, dispensatori) e materiale di laboratorio puliti. Non scambiare i tappi dei flaconi al fine di evitare contaminazioni crociate. Richiudere bene i flaconi immediatamente dopo l uso per evitare fenomeni di evaporazione e contaminazione microbica. Una volta aperti e dopo relativo stoccaggio verificare i reagenti, prima dell uso, al fine di escludere una loro eventuale contaminazione microbica. Per evitare contaminazioni crociate e risultati erroneamente alti dispensare campioni e reagenti con molta precisione sul fondo dei pozzetti, evitando la formazione di schizzi. Il kit è destinato esclusivamente all utilizzo da parte di personale specializzato, che conosce perfettamente le tecniche di lavoro. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 10/24

11 ATTENZIONE: ATTENZIONE: Bronidox L, nella concentrazione usata, non presenta quasi alcun rischio di tossicità sulla pelle e sulle mucose. L acido solforico irrita occhi e pelle! In caso di contatto sciacquare immediatamente con abbondante acqua e consultare un medico. Mantenere fuori dalla portata dei bambini Smaltimento In genere i residui delle sostanze chimiche e delle preparazioni vengono considerati rifiuti pericolosi. Lo smaltimento di questo tipo di materiale viene regolato da leggi nazionali e regolamenti regionali. Per ulteriori informazioni contattare le autorità locali o le società autorizzate allo smaltimento dei rifiuti. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 11/24

12 SCHEMA DEL DOSAGGIO Tetanus Toxin IgG 5S E.W. Preparazione Preparare i campioni e i reagenti come indicato. Stabilire lo schema di distribuzione ed identificazione dei campioni e dei calibratori sull apposito foglio fornito nel kit. Inserire la quantità di pozzetti necessari all esecuzione del test nel supporto per micropiastre. Procedimento Bianco CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 Campione (diluito 1+100) CAL 0-100µl CAL µl CAL µl CAL µl - - CAL µl - Campione (diluito 1+100) µl Coprire la micropiastra con la pellicola fornita nel kit Incubare per 1 h ± 5 min a 37 C ± 1 C Lavare ogni pozzetto 3 x con 300µl di tampone di lavaggio CONJ - 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Coprire la micropiastra con la pellicola fornita nel kit Incubare per 30 min a temperatura ambiente Lavare ogni pozzetto 3 x con 300µl di tampone di lavaggio TMB SUBS 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio STOP 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Misurazione fotometrica a 450 nm (lunghezza d onda di riferimento: 620 nm) M470 Rev.1 02/2008 Pag. 12/24

13 Enzyme immunoassay for the quantitative determination of IgG-class antibodies against Clostridium tetani toxin in human serum or plasma Only for in-vitro diagnostic use 1. INTRODUCTION Clostridia are spore-forming gram-positive bacteria. The round spores are built at the terminal end which results in the microscope in a tennis racket like shape. Tetanus develops only when spores of Clostridium tetani germinate under strict anaerobic conditions after gaining access to wounds and small lacerations. The clinical manifestation of the disease is primarily not caused by the invasion of the exciter but by the secretion of a powerful neurotoxin (tetanospasmin). This toxin blocks the inhibition of the signal transduction and has a high affinity to the central nervous system. The consequence is hyper excitability of the muscles to external stimuli in combination with a principal increase of the muscle tonus without influence of consciousness. It starts with tonic spasm of muscles (trimus), mimic muscles and gallet muscles. Neck, back and abdominal musculature follow. At the same time the appearance of refectory spasm of whole muscle groups can hamper breathing. Hyper salivation and swallowing problems cause aspiration and pneumonia with the next breath. Clostridium tetani is ubiquitous present in soil and intestine of humans and animals. Ingestion of bacteria or growth in the intestine of man or animal is without harm. The spores are extremely resistant towards heat and can stay infectious for a long period. The bacteria can get under the skin by even smallest wounds. In Europe tetanus mainly occurs after injuries and sometimes postoperative whereas in developing countries Tetanus is widely disseminated. The WHO assumes that one million people die because of tetanus worldwide per year. Tetanus toxin is an excellent immunogen in man - only one antigenic type of toxin. The only effective way to control tetanus is by prophylactic active immunization. Species Disease Symptoms Mechanism of infection Clostridium tetani Tetanus Severe and painful spasms and rigidity of voluntary muscles, followed by cardiac, renal and circulatory failure Injury, inoculation Infection may be identified by: Microscopy: Gram stain Serology: Detection of toxin production by ELISA 2. INTENDED USE The Tetanus Toxin IgG 5S E.W. is intended for the quantitative determination of IgG class antibodies against Clostridium tetani toxin in human serum or plasma (citrate). This allows for the determination of the immune status of the patients facilitating individual recommendations about the necessity of a basic immunization or booster injection. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 13/24

14 3. PRINCIPLE OF THE ASSAY The quantitative immunoenzymatic determination of IgG-class antibodies against Tetanus toxoid is based on the ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) technique. Microtiter strip wells are precoated with inactivated Tetanus toxoid antigens to bind corresponding antibodies of the specimen. After washing the wells to remove all unbound sample material horseradish peroxidase (HRP) labelled anti-human IgG conjugate is added. This conjugate binds to the captured Tetanus toxoid specific antibodies. The immune complex formed by the bound conjugate is visualized by adding Tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product. The intensity of this product is proportional to the amount of toxoid specific IgG antibodies in the specimen. Sulphuric acid is added to stop the reaction. This produces a yellow endpoint colour. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microwell plate reader. 4. MATERIALS 4.1. Reagents supplied MTP DIL STOP WASH CONJ TMB SUSB CAL Coated Microplate: 1 microplate with 96 breakable wells (12x8) coated with Tetanus toxoid antigen; vacuum sealed, in resealable aluminium foil. Sample Diluent IgG***: 1 bottle containing 105 ml of buffer for sample dilution; ph 7.2 ± 0.2, coloured yellow; ready to use. Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml of sulphuric acid, 0.2 mol/l; ready to use. Washing Solution (20x)*: 1 bottle containing 50 ml of a 20-fold concentrated buffer (ph 7.2 ± 0.2) for washing the wells; ph 7.2 ± 0.2. Enzyme Conjugate**: 1 bottle containing 20 ml of rabbit antibody antihuman IgG labelled with peroxidase; coloured red, ready to use. TMB-Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml of 3,3',5,5'- tetramethylbenzidine (TMB); ready to use. Calibrators ***: 5 vials (2 ml). Ready to use: CAL 0 : 0.0 IU/ml CAL 1: 0.1 IU/ml CAL 2: 0.5 IU/ml CAL 3: 1.0 IU/ml CAL 4: 5.0 IU/ml * contains 0.2 % Kathon ** contains 0.2 % Bronidox L *** contains 0.1 % Kathon and 0.09% Sodium azide 4.2. Materials supplied 2 Cover foils 1 Strip holder 1 Instruction for use 1 Distribution and identification plan for samples and calibrators M470 Rev.1 02/2008 Pag. 14/24

15 4.3. Materials and Equipment needed Manual Test ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450/620nm Incubator at 37 C Manual or automatic equipment for rinsing wells Micropipettes and disposable plastic tips (10, 100, 200, 1000 µl) Vortex tube mixer Disposable tubes Test tube rack Deionized or (freshly) distilled water Timer AutomaticTest This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. STABILITY AND STORAGE The reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at C. 6. REAGENT PREPARATION It is very important to bring all the reagents to room temperature (20 25 C) before starting the test run! 6.1. Coated Microplate The ready to use breakapart snap-off strips are coated with inactivated Tetanus toxoid antigens. Store at C. The strips are vacuum sealed. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at 2 8 C. Once opened they are stable until expiry date indicated on the label, if stored at 2 8 C Enzyme Conjugate The bottle contains 20 ml of a solution with anti-human IgG labelled with horseradish peroxidase, buffer, stabilizers, preservatives and an inert red dye. The solution is ready to use. Store at C. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label, if stored at 2 8 C Calibrators The vials contain 2 ml of a solution ready to use. The concentrations, calibrated in accordance with the 1 st International Standard for TETANUS IMMUNOGLOBULIN, HUMAN (Code TE-3) of the National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Potters Bar, UK, are: CAL 0: 0.0 IU/ml CAL 1: 0.1 IU/ml CAL 2: 0.5 IU/ml CAL 3: 1.0 IU/ml CAL 4: 5.0 IU/ml Store at C. Once opened, calibrators are stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 15/24

16 6.4. Sample Diluent IgG The bottle contains 105 ml of phosphate buffer, stabilizers, preservatives and an inert yellow dye. It is used for the dilution of the patient specimen. This ready to use solution has to be stored at C. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label, if stored at 2 8 C Washing Solution (20X) The bottle contains 50 ml of a concentrated buffer, detergents and preservatives. Once opened the concentrated Washing Solution is stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C. Dilute washing solution with deionized or distilled water 1+19 (e.g. 10 ml of washing solution ml of deionized or distilled water). Once diluted, buffer will keep for 5 days if stored at room temperature. Crystals in the solution disappear by warming up to 37 C in a water bath. Note: Prepare only the volume of washing solution necessary for carrying out the assay TMB-Substrate Solution The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be stored at C, away from the light. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into blue, it may have become contaminated and should be thrown away. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C Stop Solution The bottle contains 15 ml of 0.2 mol/l sulphuric acid solution. This ready to use solution has to be stored at C. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C. 7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Use human serum or plasma (citrate) samples with this assay. If the assay is performed within 5 days after sample collection, the specimen should be kept at C; otherwise they should be aliquoted and stored deep-frozen (-70 to -20 C). If samples are stored frozen, mix thawed samples well before testing. Avoid repeated freezing and thawing Sample Dilution Before assaying, all samples should be diluted with Sample Diluent IgG. Dispense 10µl of sample and 1mL of Sample Diluent IgG into tubes to obtain a dilution and thoroughly mix with a vortex. Calibrators are ready to use and must not be diluted. 8. ASSAY PROCEDURE 8.1. Test Preparation Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described. The following procedure should be observed to perform the manual test. Prior to beginning the assay, the distribution and identification plan for all specimens and controls should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 16/24

17 Please allocate at least: 1 well (e.g. A1) for the blank 5 wells (e.g. B1, C1, etc.) for Calibrators 0, 1, 2, 3 and 4 It is recommended to perform the assay in duplicate. Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. A clean, disposable tip should be used for dispensing each calibrator and sample. Adjust the incubator to 37 ± 1 C. 1. Dispense 100µl of each calibrator and diluted samples into their respective wells. Leave well A1 for blank. 2. Cover wells with the foil supplied in the kit. 3. Incubate for 1 hour ± 5 min at 37±1 C. 4. When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times with 300µl of Washing Solution. Avoid overflows from the reaction wells. The soak time between each wash cycle should be >5sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue paper prior to the next step! Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values. 5. Dispense 100µl of Enzyme Conjugate into all wells except for the blank well (e.g. A1). Cover with foil. 6. Incubate for 30 min at room temperature ( C). Do not expose to direct sunlight. 7. Repeat step Dispense 100µl of TMB-Substrate Solution into all wells 9. Incubate for exactly 15 min at room temperature ( C) in the dark. 10. Dispense 100µl of Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB-Substrate Solution. Any blue colour developed during the incubation turns into yellow. Note: Highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen! These precipitates have an influence when reading the optical density. Predilution of the sample, as described in paragraph 7.1 Sample Dilution is recommended. 11. Measure the absorbance of the specimen at 450/620nm within 30 min after addition of the Stop Solution. While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual Measurement Adjust the ELISA Microwell Plate Reader to zero using the Blank in well A1. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the Blank in well A1, subtract the absorbance value of well A1 from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results! Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record all the absorbance values for each calibrator and patient sample in the distribution and identification plan. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 17/24

18 9. RESULTS 9.1. Assay Validation Criteria The assay is considered valid if the following criteria are met: Blank in A1: Absorbance value lower than Calibrator 0 in B1: Absorbance value lower than Calculation of Results In order to obtain quantitative results in IU/ml draw a calibration curve plotting the (mean) absorbance values of each calibrator 0, 1, 2, 3 and 4 on (linear/linear) graph paper in a system of coordinates against their corresponding concentrations (0.0 / 0.1 / 0.5 / 1.0 and 5.0 IU/ml). The mean absorbance values of calibrators should be set on the vertical y-axis, calibrators concentration on the horizontal x-axis. Corresponding antitoxin IgG concentrations in IU/ml are obtained by plotting the mean absorbance of each sample on the calibration curve. NOTE: Readings of additionally (1+10) diluted patient samples must be multiplied by the appropriate dilution factor in order to obtain correct results! (Dilution: 1+10 = Dilution factor: 11). All suitable computer programs available can be used for automated result reading and calculation Typical Calibration Curve Tetanus IgG E 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0, IU/ml 9.3. Interpretation of Results [IU/ml] and Recommendations < 0.01 No protective antibody level! Immediate full course of basic immunization is recommended! No reliable protection! Booster injection and control of antibody concentration 4 to 6 weeks later is recommended. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 18/24

19 Reliable protection! Booster injection and control of antibody concentration 4 to 6 weeks later is recommended Reliable protection; control of antibody concentration after about 2 years is recommended. Booster injection is not required. Note: In cases of antibody concentrations greater than 0.5 IU/ml vaccination can cause side effects! Range of long term protection: Control after 5 to 10 years. > 5.0 Range of long term protection: Control after 10 years. 10. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS Precision Repeatability: Intra-assay n Mean (IU/ml) CV (%) Weak Pos. Serum Pos. Serum Reproducibility: Inter-assay n Mean (IU/ml) CV (%) Weak Pos. Serum Pos. Serum Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. It is >95 % Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. It is >95 % Analytical Sensitivity The analytical sensitivity defined as the apparent concentration of the analyte that can be distinguished from the zero calibrator is <0.05 IU/ml Possible Interferences Interferences with haemolytic, lipemic or icteric sera are not observed up to a concentration of 10 mg/ml hemoglobin, 5 mg/ml triglycerides and 0.2 mg/ml bilirubin. 11. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. Diagnosis of an infectious disease should not be established on the basis of a single test result. A precise diagnosis should take into consideration clinical history, symptomatology as well as serological data. In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 19/24

20 12. PRECAUTIONS AND WARNINGS In compliance with European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed. The use of the test kits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples. Only for in-vitro diagnostic use. All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-hiv antibodies, anti-hcv antibodies and HBsAg and have been found to be non-reactive. Nevertheless, all materials should still be regarded and handled as potentially infectious. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. Do not interchange reagents or strips of different production lots. No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit. Do not use reagents after expiry date stated on the label. Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware. Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination. Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After first opening and subsequent storage check conjugate and calibrators vials for microbial contamination prior to further use. To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense reagents without splashing accurately to the bottom of wells. This kit is only designed for qualified personnel who are familiar with good laboratory practise. WARNING: In the used concentration Bronidox L has hardly any toxicological risk upon contact with skin and mucous membranes! WARNING: Sulphuric acid irritates eyes and skin. Upon contact, rinse thoroughly with water and consult a doctor! Keep out of the reach of children Disposal Considerations Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste. M470 Rev.1 02/2008 Pag. 20/24

21 ASSAY SCHEME Tetanus Toxin IgG 5S E.W. Test preparation Prepare samples and reagents as described. Establish the distribution and identification plan for all specimens and calibrators on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Blank (e.g. A1) Assay procedure CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 CAL 0-100µl CAL µl CAL µl CAL µl - - CAL µl - Sample (diluted 1+100) Sample (diluted 1+100) µl Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 1 h ± 5 min at 37 C ± 1 C Wash each well three times with 300µl of washing solution CONJ - 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 30 min at room temperature Wash each well three times with 300µl of washing solution TMB SUBS 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Incubate for 5 min at room temperature in the dark STOP 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Photometric measurement at 450 nm (reference wavelength: 620 nm) M470 Rev.1 02/2008 Pag. 21/24

22 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / Reference or order code / Référence ou numéro de commande / Referencia o número de pedido / Referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / Lot / Lot / Lote / Lote / Charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / Expiry date / Date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic invitro / Para uso diagnóstico In-vitro / Aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / Marquage CE conforme aux directives IVD 98/7/EC / Marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / Marcação-CE segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / Keep at 2-8 C / Conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / Produzido por / Fabricante / Produkt der / κατασκευάζεται από / Tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος/ Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / Consult instructions for use / Consulter le mode opératoire / Consultar las instrucciones de uso / Consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití 96 Sufficiente per 96 test / Sufficient for 96 tests / Suffisant pour 96 déterminations / Suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů M470 Rev.1 02/2008 Pag. 22/24

23 RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / Reconstitute with / Reconstituer avec / Reconstituir con / Reconstituir com / Rekonstituiren mit / ανασυστάται με / Ile karıştırma / Rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / Deionized or distilled water / Eau deionisée ou distillée / Agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / Deiyonize veya distile su / Deionizovaná nebo destilovaná voda M470 Rev.1 02/2008 Pag. 23/24

24 BIBLIOGRAFIA - LITERATURE Ambrosch, F., Wiedermann, G., Müller, H.: Eine neue Mikro-ELISA-Methode zur Bestimmung der Tetanus-Antikörper.Zbl.Bakt.Hyg.A258, (1984) Mai, K., Bartelheimer, H. K., Rosin, H.: Über den Stand und die Dauer des Impfschutzes gegen Tetanus bei Kindern. Dtsch.med.Wschr.95,1044 (1970) Müller, H. E., Müller, M., Schiek, W.: Tetanus-Schutzimpfung-Indikation und Kontraindikation. Dtsch.med.Wschr.113,1326 (1988) Pietsch, M.: Impfserologie zur Ergänzung von Impfungen. Allgemeinarzt 15, (1993) Schröder, J. P., Kuhlmann, W. D.: Tetanusimmunität bei Männern und Frauen in der BRD. Immun. Infekt.19,14 (1991) RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -