INSULINA ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa del livello dell Insulina nel siero o plasma umano

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1 INSULINA ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa del livello dell Insulina nel siero o plasma umano REF KP10IW 96 PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1.APPLICAZIONI CLINICHE L'insulina è un ormone polipeptidico che regola il metabolismo dei carboidrati. Oltre ad essere l effettore primario nell omeostasi dei carboidrati, ha effetti su metabolismo dei lipidi e regola il rilascio dei depositi lipidici dal fegato. L'insulina è coinvolta nel controllo dell assorbimento cellulare del glucosio a livello del muscolo e del tessuto adiposo, nell incremento della replicazione del DNA e della sintesi proteica, nel cambiamento dell'attività di numerosi enzimi (effetto allosterico), nell incremento della sintesi del glicogeno e degli acidi grassi, nell uptake degli aminoacidi e nell inibizione della proteolisi, della lipolisi e della gluconeogenesi. Le cellule beta rilasciano l insulina in modo glucosio-dipendente. I livelli di glucosio nel sangue variano da circa 70 mg/dl a 110 mg/dl ( mmol/l), tranne subito dopo il consumo di un pasto, quando il livello del glucosio nel sangue aumenta temporaneamente. Questo effetto omeostatico è il risultato di molti fattori, di cui la regolazione dell'ormone è il più importante. Vi sono alcune patologie in cui è coinvolta l'insulina: diabete mellito, insulinoma, sindrome metabolica e sindrome dell ovaio policistico. Ci sono due tipi di diabete mellito: tipo 1 (degradazione autoimmunitaria dell insulina prodotta dalle cellule beta del pancreas con conseguente carenza assoluta di insulina) e tipo 2 (sindrome multifattoriale dovuta ad una predisposizione genetica e all influenza dei fattori ambientali, quali ad esempio obesità, età ed inattività fisica, con conseguente resistenza all'insulina delle cellule che richiedono insulina per l'assorbimento del glucosio. Questa forma di diabete ha una componente fortemente ereditaria). In entrambi i casi la produzione dell'insulina deve essere supportata da una terapia farmacologica o dalla somministrazione di insulina per via orale o endovenosa. La determinazione quantitativa dei livelli di insulina nel sangue può aiutare a determinare le dosi da somministrare. 2. PRINCIPIO DEL METODO I reagenti essenziali richiesti per un dosaggio immunoenzimometrico includono anticorpi ad alta affinità e specificità (coniugati all enzima e immobilizzati) in grado di riconoscere diversi e distinti epitopi, presenti in eccesso, e l antigene nativo. In questa procedura l immobilizzazione avviene, durante il dosaggio, in corrispondenza della superficie del pozzetto della micropiastra attraverso l interazione della streptavidina, adesa sul pozzetto, con l anticorpo monoclonale anti- Insulina biotinilato (Ab) successivamente aggiunto. Nella miscela costituita dall anticorpo monoclonale biotinilato, dall anticorpo coniugato all enzima e dal siero contenente l antigene nativo (Ag), la reazione avviene tra l antigene nativo e gli anticorpi, senza competizione o impedimento sterico, con formazione di un complesso a sandwich solubile. L interazione è illustrata dalla seguente equazione: ka EAb + AgN + BtAb(m) EAb AgN-BtAb(m) k-a BtAb(m) = Anticorpo Monoclonale Biotinilato (Quantità in eccesso) AgN = Antigene Nativo (Quantità Variabile) EAb = Anticorpo coniugato all Enzima (Quantità in Eccesso) EAb-AgN-BtAb(m) = Complesso a Sandwich Antigene-Anticorpo ka = Costante di Associazione k-a = Costante di Dissociazione M466 Rev.0 03/2008 Pag. 1/12

2 Contemporaneamente il complesso si deposita sul pozzetto grazie alla reazione ad alta affinità che avviene tra streptavidina ed anticorpo biotinilato. Questa interazione è mostrata di seguito: EAb -AgN-BtAb(m) + StreptavidinC.W. Immobilized complex StreptavidinC.W. = Streptavidina immobilizzata sul pozzetto Immobilized complex = complesso a sandwich legato al pozzetto. Una volta raggiunto l equilibrio, la frazione di anticorpo legata viene separata dall antigene libero per decantazione o aspirazione. L attività dell enzima nella frazione legata dell anticorpo è direttamente proporzionale alla concentrazione di antigene nativo. L attività dell enzima presente sulla superficie del pozzetto è determinata, in modo quantitativo, attraverso la reazione colorimetrica con un appropriato substrato. Utilizzando alcuni differenti calibratori con concentrazione nota di antigene può essere costruita una curva di calibrazione dalla quale si può estrapolare la concentrazione di antigene di un campione. 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1 Reattivi e materiali forniti nel kit I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. CAL CALIBRATORI 6 flaconi (2 ml) di Insulina in siero umano, liofilizzati. I calibratori sono stati tarati usando la preparazione di riferimento WHO 1 st IRP 66/304 ed hanno approssimativamente le seguenti concentrazioni: CAL 0 0 µiu/ml CAL µiu/ml CAL 2 25 µiu/ml CAL 3 50 µiu/ml CAL µiu/ml CAL µiu/ml Ricostituire ogni flacone con 2 ml di acqua distillata o deionizzata. I calibratori ricostituiti sono stabili 60 giorni, se conservati a C. Conservante: Proclin 300. CONJ CONIUGATO ENZIMATICO 1 fl. (13 ml) contenente anticorpi monoclonali di topo anti-insulina biotilinati, e anticorpi anti-insulina coniugati con Perossidasi (HRP). Conservante: Proclin 300. Pronto per l uso. MTP SUBS WASH MICROPIASTRA SENSIBILIZZATA 96 pozzetti divisibili singolarmente, sensibilizzati con Streptavidina. Aprire la busta solo dopo averla portata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strips da utilizzare. TAMPONE SUBSTRATO 1 flacone da 14 ml di H 2 O 2 -TMB (0,25 gr/l). Pronto per l uso. Nota: Evitare il contatto con la pelle. SOLUZIONE DI LAVAGGIO (Conc. 50x) 1 flacone da 20 ml di tampone fosfato contenente BSA 0.1%, Tween 20 1 g/l, NaCl 9 g/l. Diluire, in un contenitore adatto alla conservazione, l intero contenuto del flacone con acqua distillata o deionizzata fino ad ottenere un volume di 1000 ml. La soluzione è stabile fino alla data di scadenza del kit, se conservata a C. STOP REAGENTE BLOCCANTE 1 flacone da 14 ml di Acido Solforico (H 2 SO 4 ) 0.15 mol/l. Pronto per l uso. Nota: evitare il contatto con gli occhi e la pelle. 3.2 Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata. 3.3 Materiale ausiliario e strumentazione Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 e 405 nm). 3.4 Avvertenze M466 Rev.0 03/2008 Pag. 2/12

3 Conservare tutti i reattivi a +2-8 C, al riparo dalla luce e non utilizzare dopo la data di scadenza indicata nell etichetta del kit. Evitare la esposizione del reattivo TMB/Substrato alla luce solare diretta ed il contatto con metalli e/o ossidanti. I reattivi aperti sono stabili per 60 giorni se conservati a +2-8 C. Questo metodo permette la determinazione quantitativa di insulina da 0.5 a 300 µiu/ml. Non utilizzare reattivi appartenenti a lotti diversi. Osservare la massima precisione nella dispensazione dei reattivi e campioni. Evitare il contatto diretto con tutto il materiale potenzialmente infetto, utilizzando abiti protettivi da laboratorio e guanti monouso. Dispensare: CAL Campione Bianco Campioni μl --- CAL (0-5) 50 μl CONJ 100 μl 100 μl --- Incubare: 2h a temperatura ambiente. Togliere la miscela di reazione e lavare i pozzetti 3 volte con 300μL di soluzione di lavaggio, togliendo sempre completamente l acqua dai pozzetti. Dispensare: CAL Campione Bianco SUBS 100 μl 100 μl 100 μl 4. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE Seguire le buone norme di laboratorio nell utilizzo campioni biologici. Utilizzare campioni di siero prelevati la mattina a digiuno. Il sangue dovrebbe essere raccolto in provette senza additivi o anticoagulanti. Permettere al sangue di coagularsi. Centrifugare il campione per separare il siero dalla parte corpuscolare. I campioni debbono essere conservati a +2-8 C per un periodo massimo di 5 giorni, se non possono essere dosati entro questo tempo, conservare a - 20 C fino a 30 giorni. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento. Campioni di pazienti con concentrazioni di Insulina al di sopra dei 300 μiu/ml debbono essere diluiti (ad esempio 1/10 o diluizioni superiori) con il Calibratore 0 e testati nuovamente. La concentrazione dei campioni si ottiene moltiplicando il risultato per il fattore di diluizione. 5. PROCEDIMENTO Attendere che tutti i reattivi raggiungano la temperatura ambiente, prima dell utilizzo. Poiché è necessario eseguire il dosaggio in duplicato, predisporre due pozzetti per ogni punto della curva di Calibrazione (CAL 0 CAL 5 ), due per ogni Campione ed uno per il Bianco. Riporre le strip non utilizzate nella busta di allumino, chiudere ermeticamente e conservare a +2-8 C. Incubare: 15 minuti a temperatura ambiente (22-28 C), al riparo dalla luce. Dispensare: CAL Campione Bianco STOP 100 μl 100 μl 100 μl Leggere l assorbanza (E) a 450 nm azzerando con il Bianco. Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 6. CONTROLLO QUALITA Ogni laboratorio dovrebbe determinare i propri controlli di riferimento a livelli bassi, medi e alti nel range della curva di calibrazione per monitorare le performance del kit. Questi controlli dovrebbero essere trattati allo stesso modo dei campioni ed i valori determinati in ogni procedura analitica eseguita. Le tabelle di controllo di qualità dovrebbero essere conservate per seguire le prestazioni dei reagenti forniti. Metodi statistici pertinenti dovrebbero essere usati per accertarne le tendenze. Deviazioni significative dalle prestazioni stabilite possono indicare un non notificato cambiamento nelle condizioni sperimentali o il M466 Rev.0 03/2008 Pag. 3/12

4 deterioramento dei reattivi del kit. Reattivi freschi dovrebbero essere utilizzati per determinare la causa delle variazioni. 7. LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA 7.1 Prestazioni del dosaggio Non usare campioni microbiologicamente contaminati, così come campioni altamente lipemici o emolizzati. E importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso per la riproducibilità dei risultati. Per evitare l effetto deriva dosaggio, il tempo di dispensazione dei campioni non deve prolungarsi oltre i 10 minuti. Si raccomanda di dosare nuovamente la curva di calibrazione, se si utilizza più di una piastra. L addizione del tampone substrato da inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l aggiunta del reagente bloccante. L addizione del substrato e del reagente bloccante deve avvenire nella stessa sequenza per eliminare differenti tempi di reazione. I lettori di micropiastra misurano le OD verticalmente, evitare pertanto di lasciare impronte sul fondo dei pozzetti. Un processo di lavaggio non adeguato può determinare risultati non attendibili. - Selezionare i pozzetti le cui OD lette a 450 nm siano maggiori di 2,0. - Selezionare le corrispondenti OD lette a 405 nm e moltiplicare questi valori a 405 nm per il fattore di conversione 3.0 (dove OD 450/OD 405 = 3.0), cioè: OD 450 nm = OD 405 nm x 3,0. Attenzione: Il fattore di conversione 3.0 indicato è solamente un esempio. Per una migliore accuratezza, si raccomanda l utente di calcolare il fattore di conversione specifico sul proprio lettore Estinzione Media Calcolare l estinzione media (Em) di ciascun punto della curva di calibrazione (CAL 0 CAL 5 ) e di ogni campione Curva di Calibrazione Metodo automatico Usare preferibilmente la funzione di calcolo 4 parametri logistica, oppure la funzione smoothed cubic spline come algoritmo di calcolo. 7.2 Interpretazione dei risultati Se per calcolare i risultati viene utilizzato un Personal Computer, è essenziale che i valori dei calibratori siano entro il 10 % delle concentrazioni assegnate. 8. RISULTATI 8.1. Note La OD del Calibratore 5 dovrebbe essere 1.3. Le densità ottica (OD) di alcuni calibratori e campioni potrebbe risultare maggiore di 2,0, in questo caso, potrebbero essere fuori dal range di misurazione del lettore di micropiastra. É quindi necessario, per le OD maggiori di 2,0, eseguire una lettura a 405 nm oltre che a 450 nm e a 620nm (filtro di riferimento per la sottrazione delle interferenze dovute alla plastica). Se si utilizzano lettori non in grado di leggere a 3 lunghezze d onda contemporaneamente, si raccomanda di procedere come segue: - Leggere la micropiastra a 450 nm ed a 620 nm. - Leggere di nuovo la piastra a 405 nm ed a 620 nm Curva di Calibrazione Metodo manuale La curva di calibrazione si utilizza per determinare la concentrazione di Insulina in campioni sconosciuti. Registrare le OD ottenute dal tabulato del lettore della micropiastra Disegnare la curva su carta millimetrata, riportando sull asse delle ordinate le OD di ogni calibratore e sull asse delle ascisse le concentrazioni dei calibratori. Interpolando sulla curva di calibrazione la media delle assorbanze di ciascun campione, si otterranno le corrispondenti concentrazioni d Insulina espresse in µiu/ml. Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l ampliamento del range di lettura. 9. VALORI DI RIFERIMENTO I valori di Insulina sono maggiormente più alti nel plasma che nel siero; di conseguenza è preferibile usare un campione di siero. M466 Rev.0 03/2008 Pag. 4/12

5 I range sono stati assegnati basandosi sui dati clinici raccolti, in accordo con i lavori pubblicati in letteratura. Si raccomanda ad ogni laboratorio di stabilire i propri valori di riferimento I valori di seguito riportati devono essere usati solo come linea guida: Bambini <12 anni Adulti (Normali) Diabetici (Tipo II) <10 μiu/ml 0,7 9,0 μiu/ml 0,7 25 μiu/ml 10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Precisione a) Ripetibilità (Intra-Assay) La variazione intra-assay è stata determinata analizzando tre sieri di controllo a differenti concentrazioni in 12 replicati, in un unica seduta analitica. La variabilità intra-assay è del 6%. b) Riproducibilità (Inter-Assay) La variabilità inter-assay è stata determinata analizzando tre sieri di controllo a differenti concentrazioni con quattro kit appartenenti a lotti diversi. La variabilità inter-assay è del 6%. 104 campioni di siero utilizzando entrambi i metodi. La curva di regressione è stata calcolata: y = 0,91 x + 2,6 r = 0,975 (r 2 = 0,95) 11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali. 12. NOTE SULL AUTOMAZIONE - Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. - Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC. - Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 13. LEGENDA SIMBOLI: vedi pag Specificità La specificità è stata calcolata utilizzando potenziali sostanze interferenti aggiunte a concentrazioni note di Insulina. Insulina 100% Proinsulina 0,8% C-Peptide 0% Glucagone 0% 10.3 Sensibilità La concentrazione minima di Insulina rilevabile, distinguibile dal Calibratore 0 è di 0,7 μiu/ml con un limite di affidabilità del 95% Correlazione con il dosaggio RIA Il dosaggio Insulina Elisa è stato comparato con un altro kit disponibile in commercio. Sono stati testati M466 Rev.0 03/2008 Pag. 5/12

6 INSULINA ELISA Enzyme Immunoassay for quantitative determination of insulin level in human serum or plasma. REF KP10IW 96 FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS Insulin is a polypeptide hormone that regulates carbohydrate metabolism. Apart from being the primary effector in carbohydrate homeostasis, it has effects on fat metabolism and it can change the liver's ability to release fat stores. Insulin is involved in control of cellular intake of glucose in muscle and adipose tissue, increase of DNA replication and protein synthesis, modification of the activity of numerous enzyme (allosteric effect), increased glycogen, fatty acid synthesis, aminoacid uptake, decreased proteinolysis, lipolysis, gluconeogenesis. Beta cells release insulin in a glucose-dependent way. In most humans blood glucose levels varies from about 70 mg/dl to perhaps 110 mg/dl (3.9 to 6.1 mmol/l) except shortly after eating when the blood glucose level rises temporarily. This homeostatic effect is the result of many factors, of which hormone regulation is the most important. There are several conditions in which insulin disturbance is pathologic: diabetes mellitus, insulinoma, metabolic syndrome and polycystic ovary syndrome. There are two types of diabetes mellitus: type 1 (autoimmune-mediated destruction of insulin producing beta cells in the pancreas resulting in absolute insulin deficiency), and type 2 (multifactor syndrome with combined influence of genetic susceptibility and influence of environmental factors, the best known being obesity, age, and physical inactivity, resulting in insulin resistance in cells requiring insulin for glucose absorption. This form of diabetes is strongly inherited). In both cases the insulin production must be increased by medication or delivering insulin by oral or by intravenous method. The quantitative determination of insulin can help to determinate the dose to deliver. 2. PRINCIPLE OF THE TEST The essential reagents required for an immunoenymometric assay include high affinity and specificity antibodies (enzyme conjugated and immobilized), whit different and distinct epitope recognition, in excess, and native antigen. In this procedure, the immobilization takes place during the assay at the surface of a microplate well through the interaction of streptavidin coated on the well and exogenously added biotinylated monoclonal anti-insulin antibody (Ab). Upon mixing monoclonal biotinylated antibody, the enzyme-labelled antibody and a serum containing the native antigen (Ag), reaction results between the native antigen and the antibodies, without competition or steric hindrance, to form a soluble sandwich complex. The interaction is illustrated by the following equation: ka EAb + AgN + BtAb(m) EAb AgN-BtAb(m) k-a BtAb(m) = Biotinylated Monoclonal Antibody (Excess Quantity) AgN = Native Antigen (Variable Quantity) EAb = Enzyme labelled Antibody (Excess Quantity) EAb-AgN-BtAb(m) = Antigen-Antibodies Sandwich Complex ka = Rate Constant of Association k-a = Rate Constant of Dissociation Simultaneously, the complex is deposited to the well through the high affinity reaction of streptavidin and biotinylated antibody. This interaction is illustrated below: EAb -AgN-BtAb(m) + StreptavidinC.W. Immobilized complex M466 Rev.0 03/2008 Pag. 6/12

7 StreptavidinC.W.= Streptavidin immobilized on well Immobilized complex = sandwich complex bound to the well. After equilibrium is attained, the antibody-bound fraction is separated from unbound antigen by decantation or aspiration. The enzyme activity in the antibody-bound fraction is directly proportional to the native antigen concentration. The activity of the enzyme present on the surface of the well is determined by reaction with a suitable substrate to produce colour. By using several different calibrators of known antigen values, a calibration curve can be generated from which the antigen concentration of an unknown can be ascertained. 3. REAGENT, MATERIAL AND INSTRUMENTATION 3.1 Reagent and material supplied in the kit The reagents are sufficient for 96 wells. CAL CONJ CALIBRATORS 6 vials (2mL) of Insulin in human serum. Lyophilized. Calibrators were calibrated using a reference preparation, which was assayed against WHO 1 st IRP 66/304 and have approximately the following concentrations: CAL 0 0 µiu/ml CAL µiu/ml CAL 2 25 µiu/ml CAL 3 50 µiu/ml CAL µiu/ml CAL µiu/ml Reconstitute each vial with 2 ml of distilled or deionised water. The reconstituted calibrators are stable for 60 days if stored at C. Preservative: Proclin 300. ENZYME CONJUGATE 1 vial (13 ml) containing biotilynated mouse monoclonal antibody anti-insulin, anti-insulin antibody HRP conjugated. Preservative: Proclin 300. Ready for use. MTP COATED MICROPLATE 1 x 96 breakable wells, coated with Streptavidin. Allow the microplate to reach room temperature (20 25 C) before opening and close immediately after use. SUBS SUBSTRATE BUFFER 1 vial (14 ml) containing H 2 O 2- TMB 0.25gr/L Ready for use. Note: avoid any skin contact. WASH WASH SOLUTION (Conc. 50x) 1 vial 20 ml of phosphate buffer containing BSA 0.1%, Tween 20 1g/L, NaCl 9 g/l. Dilute the vial content with distilled or deionised water up to obtain 1000 ml of solution, in a suitable storage container. The solution is stable until the expiry date of the kit, if store at +2-8 C. STOP BLOCKING REAGENT 1 vial (14 ml) containing Sulphuric acid (H 2 SO 4 ) 0.15 mol/l. Ready for use. Note: avoid any eyes and skin contact. 3.2 Materials required but not provided Distilled water. 3.3 Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 and 405 nm). 3.4 Precaution Store all reagents at +2-8C in the dark. Do not use the kit reagents after the expiry date printed on the outside of the kit box. Avoid exposure of TMB/Substrate reagent to direct sunlight and direct contact with metal or oxidants. Opened reagents are stable for 60 days if stored at +2-8 C. This method allows the quantitative determination of Insulin from 0.5 to 300 µiu/ml. Do not use reagents from different lots. M466 Rev.0 03/2008 Pag. 7/12

8 Maximum precision is required for dispensation of reagents and specimen. Avoid direct contact with all potentially infected material, by using protective lab coats and disposable gloves. 4. PREPARATION OF THE SAMPLE Follow good laboratory procedures on handling biological specimen. Fasting morning serum sample must be used. The blood should be collected in venipuncture tubes without additives and anti-coagulants. Allow the blood to clot. Centrifuge the sample to separate the serum from the cells. Samples should be stored at +2-8 C up to 5 days, if not tested within this period, store at -20 C up to 30 days. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. Serum samples with Insulin concentrations higher than 300 µiu/ml must be diluted (for example 1/10 or higher) with the Zero Calibrator and retested. The sample s concentration is obtained by multiplying the result by the dilution factor. 5. PROCEDURE Before using the reagents allow them to reach room temperature. Prepare the microplate wells in duplicate for each Calibrator (CAL 0 CAL 5 ) and samples and in single for Blank. Unused strips should be resealed immediately in the aluminium bag and store at +2-8 C. Dispense: CAL Sample Blank Sample μl --- CAL (0-5) 50 μl CONJ 100 μl 100 μl --- Incubate at room temperature for 2 hours. Remove the contents from each well; wash the wells three times with 300 μl of washing solution times by draining always the water completely. Dispense: CAL Sample Blank SUBS 100μl 100μl 100μl Incubate at room temperature (22-28 C) for 15 minutes in the dark. Dispense: CAL Sample Blank STOP 100μl 100μl 100μl Read the absorbance (E) at 450 nm against Blank. While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 6. QUALITY CONTROL Each laboratory should assay controls at levels in the low, medium and high ranges of the Calibration curve for monitoring assay performance. These controls should be treated as unknowns and values determined in every test procedure performed. Quality control charts should be maintained to follow the performance of the supplied reagents. Pertinent statistical methods should be employed to ascertain trends. Significant deviation from established performance can indicate unnoticed change in experimental conditions or degradation of kit reagents. Fresh reagents should be used to determine the reason for the variations. 7. LIMITATION OF PROCEDURE 7.1. Assay Performance Contaminated microbiologically samples should not be used in the assay, as well as haemolysed and visibly highly lipaemic specimens have to be discarded. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Dispensing of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the calibration curve. Addition of the substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the blocking reagent. Therefore, the addition of the substrate and the blocking reagent should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during reaction. Plate readers measure vertically, therefore avoid to touch the bottom of the microplate. Unsuitable washing step may result in unreliable results Interpretation of results If computer controlled data reduction is used to calculate the results of the test, it is imperative that M466 Rev.0 03/2008 Pag. 8/12

9 the predicted values for the calibrators fall within 10% of the assigned concentrations. 8. RESULTS 8.1. Note The OD of calibrator 5 should be 1.3. The optical densities (O.D.) of some calibrators and samples may be higher than 2.0, in such a case, they could be out of the measurement range of the microplate reader. It is therefore necessary, for the O.D. higher than 2.0, to perform a reading at 405 nm in addition to 450 nm and 620 nm (reference filter for the subtraction of interferences due to the plastic). For microplate readers unable to read the plate at 3 wavelengths at the same time, it is advisable to proceed as follows: - Read the microplate at 450 nm and at 620 nm. - Read again the plate at 405 nm and 620 nm. - Identify the wells whose OD at 450 nm are higher than Select the corresponding OD read at 405 nm and multiply these values at 405 nm by the conversion factor 3.0 (where OD 450/OD 405 = 3.0), that is: OD 450 nm = OD 405 nm x 3.0. Warning: The conversion factor 3.0 is an example only. For better accuracy, the user is advised to calculate the conversion factor specific for his own reader Mean Absorbance Calculate the mean of the absorbance (Em) for each point of the Calibration curve (CAL 0 CAL 5 ) and of each sample. vertical y-axis and the calibrator concentrations on the horizontal x-axis. Corresponding Insulin concentration in µiu/ml are obtained by interpolating the absorbance of each sample on the calibration curve. While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. 9. REFERENCE VALUES Insulin values are consistently higher in plasma than in serum; thus, serum is preferred. Based on the clinical data gathered in concordance with the published literature the following ranges have been assigned. It s recommended that each laboratory establishes its own expected range. The following values are provided as a guide only: Children <12 yrs <10 μiu/ml Adult (Normal) μiu/ml Diabetic (Type II) μiu/ml 10. PERFORMANCE CHARACTERISTICS 10.1 Precision a) Repeatability (Intra-assay) The intra-assay variation was evaluated by performing 12 replicates on three different levels of control sera, in one assay. The intra-assay variability is 6% Calibration Curve Automatic method Use the 4 parameters logistic preferred or the smoothed cubic spline function as calculation algorithm. b) Reproducibility (Inter Assay) The inter-assay variation was evaluated testing three control sera at different concentrations using four different lots of reagent. The inter-assay variability 6% Calibration Curve Manual method Calibration curve is used to ascertain the concentration of Insulin in unknown specimens. Record the OD obtained from the printout of the microplate reader. Draw the calibration curve on linear graph paper, by plotting the OD value of each calibrator on the 10.2 Specificity Specificity has been demonstrated by spiking interfering substances into human serum with a known Insulin concentrations. M466 Rev.0 03/2008 Pag. 9/12

10 Insulina 100% Proinsulina 0.8% C-Peptide 0% Glucagone 0% 10.3 Sensitivity The lowest detectable concentration of Insulin, that could be distinguished from Zero Calibrator is 0.7 µiu/ml at 95% confidence limit Correlation with RIA assay Insulin Elisa assay was compared to another commercially available Insulin kit. 104 serum samples were assayed using both methods The linear regression curve was calculated: y = 0,91 x + 2,6 r = 0,975 (r 2 = 0,95) Eastham R.D Biochemical Values in Clinical Medicine, 7 th Ed. Bristol. England. Jonh Wright &Sons, Ltd (1985). Gerbitz, V.K.D., J. Clin. Chem. Biochem. 18, (1980) Boehm TM, et al Diabetes Care (1079) Wayne PA National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedure for the collection of diagnostic blood specimensby venipuncture: approved standards. 4 th Ed. NCCLS (1988) Turkinton RW.,et al Archive of Internal Med. 142 Sacks BD Carbohydrates in Burtis, C.A. and Ashwood, AR (Eds ) Tietz Textbook OF Clinical Chemistry.2 nd Ed. Philadelphia w. B. Saunders Co Kahn CR, et al. Diabetes Care (1979) 11. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. 12 AUTOMATIC TEST - This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. - We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. - While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 13. SYMBOLS LEGEND: see page 11 BIBLIOGRAFIA - BIBLIOGRAPHY M466 Rev.0 03/2008 Pag. 10/12

11 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo LOT Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže IVD Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação- CE segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE- Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C 96 RDATE Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Biogefährdung/ Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat s H 2 O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο - απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce M466 Rev.0 03/2008 Pag. 11/12

12 "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -