C1-INIBITORE (Ref. NPP37)

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1 C1-INIBITORE (Ref. NPP37) REAGENTE PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEL C1-INIBITORE NEL PLASMA E NEL SIERO UMANO CON METODO NEFELOMETRICO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO APPLICAZIONI CLINICHE Il C1-inibitore (C1-Inattivatore) è una proteina, che interviene nella regolazione del complemento e di altri sistemi coinvolti nei processi infiammatori (contatto, fibrinolisi, coagulazione). La carenza di C1-inibitore provoca il rilascio di sostanze che hanno l effetto di aumentare la permeabilità dei vasi capillari: si formano quindi edemi, cioè accumuli di fluidi nei tessuti, con conseguente rigonfiamento. La determinazione del C1-inibitore è di supporto nella diagnosi dell angioedema ereditario. PRINCIPIO DEL METODO Le proteine C1-Inibitore contenute nel plasma o nel siero formano degli immunocomplessi reagendo con gli anticorpi specifici. Sfruttando il fenomeno della diffrazione della luce che questi immunocomplessi provocano, si è in grado, per mezzo del nefelometro, di misurare l'intensità della luce diffratta, che risulta proporzionale alla concentrazione del C1 Inibitore presente nel campione in esame. La valutazione avviene per confronto con uno calibratore a concentrazione nota. REAGENTE CONTENUTO NELLA CONFEZIONE Il reagente deve essere conservato a 2-8 C. Durante la conservazione, l'antisiero può presentare flocculazioni o intorbidamenti che non dipendono da contaminazioni e che non influiscono sull'attività. In questi casi è necessario filtrare l'antisiero prima dell'uso. Allo scopo, si consiglia di usare filtri monouso con un diametro dei pori di 0.45 /m. La data di scadenza è indicata sulla etichetta e si riferisce al componente conservato chiuso a 2-8 C. A/S Antisiero: 1 flacone (2 ml) di antisiero policlonale, ottenuto in capra, contro C1- Inibitore umano altamente purificato. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l'uso. Dopo l'impiego, conservare il reagente ermeticamente chiuso a 2-8 C per 4 settimane. Non congelare. I titoli anticorpali (T), che indicano quanti mg di antigene vengono precipitati in gel di agarosio da 1 ml dell'antisiero, vengono determinati mediante immunodiffusione radiale e indicati sull'etichetta del flacone. 1

2 MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO L'antisiero deve essere utilizzato con i seguenti reagenti: Calibratore Proteine P, (Ref. NCPP1PL1); Controllo Proteine P, (Ref. NCPP2PL1) Tampone Supplementare, (Ref. NSPP1); Diluente (Ref. NDPP1) Tampone di reazione, (Ref. NDPP2) Nefelometro Delta (Ref ) Altro materiale di consumo e attrezzature sono descritte nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni e reagenti; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; in tal caso, ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità sotto riportate. I reagenti per cui non si fornisce la scheda di sicurezza non contengono sostanze chimiche pericolose o se presenti, queste sono al di sotto dei limiti di concentrazione definiti nel D.Lgs.285/98 e nella direttiva CEE 91/55. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su campioni di plasma o siero umano freschi. I campioni di siero devono essere completamente coagulati e, dopo essere stati centrifugati non devono contenere particelle o tracce di fibrina in sospensione; prima del dosaggio, accertarsi che i campioni siano perfettamente limpidi. Pertanto, campioni fortemente lipemici o campioni congelati, che dopo lo scongelamento si presentano torbidi, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10' a ca g). I campioni di siero e plasma possono essere conservati a 2-8 C per 8 giorni, per tempi più lunghi (1 anno) si consiglia di congelarli a -20 C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. 2

3 PROCEDIMENTO OPERATIVO Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente (15-25 C). Seguire il procedimento operativo descritto sul manuale d'uso del Nefelometro Delta, che prevede l'allestimento di quanto segue: Curva di calibrazione: viene preparata automaticamente dallo strumento mediante diluizioni seriali del Calibratore Proteine P (Ref. NCPP1PL1) con l'apposito Diluente (Ref. NDPP1). Le diluizioni effettuate vengono quindi impiegate per la calibrazione, che rimane valida purché il dosaggio dei sieri di controllo rientri nei limiti attesi. La calibrazione deve essere necessariamente ripetuta ogni qualvolta si utilizzi un nuovo lotto di antisiero. Campioni: prima del dosaggio, il plasma o il siero viene diluito automaticamente dallo strumento alla diluizione di 1:5, utilizzando l'apposito Diluente (Ref. NDPP1). Qualora i valori dei campioni siano al di fuori dell'ambito di misura è opportuno ripetere il test, utilizzando una diluizione maggiore o minore. Controllo di qualità interno: Per ogni serie di campioni e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di antisiero, è necessario effettuare un controllo di accuratezza e di precisione, utilizzando il Controllo Proteine P (NCPP2PL1). Il controllo viene trattato come i campioni in esame. Per i limiti attesi di tale controllo fare riferimento alla relativa tabella fornita a corredo della confezione del controllo stesso. CALCOLO DEI RISULTATI La valutazione dei campioni viene eseguita in modo automatico, mediante elaborazione dei risultati con una funzione logit-log. VALORI NORMALI I valori di C1-Inibitore sotto riportati sono soltanto indicativi. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento : Proteina Plasma Siero C1-Inibitore g/l g/l CARATTERISTICHE METODOLOGICHE SPECIFICITA' L' Antisiero utilizzato risulta essere specifico per la determinazione del C1-Inibitore umano. SENSIBILITA' La sensibilità della determinazione viene definita dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende quindi dalla concentrazione delle proteine nel calibratore. Gli ambiti di misura sono riportati nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. 3

4 PRECISIONE La precisione è stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed intersaggio. Intra-saggio Inter-saggio Proteina n repl. Valore medio [g/l] CV % n repl. Valore medio [g/l] CV % C1-Inibitore CORRELAZIONE TRA METODI Campioni di siero e plasma sono stati esaminati con l'antisiero Radim C1-Inibitore umano (y) a confronto con un sistema nefelometrico di riferimento (x). Le correlazioni dei risultati sono riportate nella tabella sottostante: Proteina Regressione lineare Coeff. di correlazione N campioni C1-Inibitore y = 0.901x g/l Sieri C1-Inibitore y = 0.942x g/l Plasma LIMITI DEL TEST La presenza di torbidità o di particelle può interferire nell'esecuzione del test. Si raccomanda, pertanto, di rimuovere mediante centrifugazione eventuali particelle dovute a sieri non completamente coagulati, a denaturazione proteica. Per motivazioni tecniche relative alla produzione e/o all'invecchiamento dei campioni, i risultati ottenuti con il plasma/sieri di controllo e con plasma/sieri per il controllo di qualità inter-laboratori possono differire in funzione del metodo utilizzato. Può quindi rendersi necessario valutare i risultati ottenuti, facendo riferimento a valori specifici per i diversi metodi utilizzati. 4

5 C1-INHIBITOR (Ref. NPP37) REAGENT FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF C1-INHIBITOR IN HUMAN PLASMA AND SERUM USING A NEPHELOMETRIC METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY CLINICAL APPLICATIONS C1-Inhibitor (C1-Inactivator) is a protein that occurs in the regulation of the complement and other system involved in inflammatory processes (fibrinolysis, coagulation). Deficiency of C1-Inhibitor leads to increase blood vessel permeability causing swelling of tissues. Measurement of C1-Inhibitor aids in the diagnosis of rare form of hereditary angioedema. PRINCIPLE OF THE ASSAY The human plasma or serum proteins form immune complexes with specific antibodies. With the light diffraction phenomenon produced by these complexes it is possible to measure the intensity of scattered light using a nephelometer. This intensity is proportional to the concentration of the relevant C1-Inhibitor in the sample. The result is evaluated by comparison with a calibrator of known concentration. REAGENT PROVIDED WITH THE KIT - Store the reagent at 2-8 C. During storage the antiserum can develop precipitates or turbidity which are not caused by microbial contamination and do not affect their activity. In such cases the antiserum should be filtered prior to use. Disposable filters with a pore size of 0.45 /m are suitable for this purpose. - The expiry date is given on the label and it refers to the closed component stored at 2-8 C. A/S Antiserum: 1 vial (2 ml) of polyclonal antiserum, produced by immunisation of goat to highly purified C1-Inhibitor. Preservative: NaN3 (< 0.1 %). Ready for use. After each use store the reagent, sealed hermetically, at 2-8 C for 4 weeks. Do not freeze. The antibody titres (T) indicate the quantity of antigen in mg which will be precipitated in agarose gel by 1 ml of the corresponding antiserum. The titres are determined by radial immunodiffusion and are printed on the vial labels. 5

6 MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED The Antiserum must be used with the following reagents: Protein Calibrator P, (Ref. NCPP1PL1) Protein Control P, (Ref. NCPP2PL1) Supplementary Buffer, (Ref. NSPP1) Diluent, (Ref. NDPP1) Reaction Buffer, (Ref. NDPP2) Delta Nephelometer (Ref ) Other consumables and equipment are described in the Manual for use of Delta Nephelometer. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: - Do not use reagents beyond their expiry date - Avoid any contamination among samples and reagents. For this purpose disposable tips should be used for each sample and reagent. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: - Use disposable gloves while handling any potentially infectious material and while performing the assay. - Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. - Avoid splashing and aerosol formation; in such cases wash carefully with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. - The reagents for which a Safety Data Sheet is not supplied do not contain hazardous chemical substances or, if they do, are below the concentration limits established by the Italian decree D.Lgs.285/98 in compliance with EEC directive 91/ According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC) all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste materials (European classification code180103). As such they must be eliminated by delegating to special enterprises qualified in waste collection and disposal. SAMPLES COLLECTION AND PREPARATION The assay can be carried out on plasma or serum samples. Before the assay assure that the samples are perfectly clear. Therefore, heavily lipemic samples or frozen samples, that are cloudy after thawing, should be cleared with centrifugation (10 min at about rpm). Plasma or serum samples can be stored at 2-8 C for 8 days, for a storage for longer periods (1 year), it is recommended to freeze them at -20 C. Avoid repeated freezings and thawings. 6

7 ASSAY PROCEDURE - All steps are automatically performed by the instrument. - Allow the reagents and samples to warm up to room temperature (15 to 25 C). - Consult the Delta Nephelometer manual for details regarding the operation of the instrument in preparation of the following: - Reference curve: is automatically prepared by instrument with serial dilutions of the Protein Calibrator P (Ref. NCPP1PL1) using the supplied Diluent (Ref. NDPP1). These dilutions are used for calibration. The calibration is valid as long as control serum performances are reproduced within their expected limits. Every time a different lot of antiserum is used a new calibration curve must be prepared. - Specimens: prior to use, plasma or serum samples are automatically diluted 1:5 for C1- Inhibitor assay using the supplied Diluent (Ref. NDPP1). If the readings obtained are outside the assay range the assay can be repeated using a higher or lower dilution of sample. - Internal Quality Control: for each series of samples and every time a new vial of reagent is used, it is necessary to perform an accuracy and precision check, using the Protein Control P (NCPP2PL1). The controls are treated as for samples under test. For the expected limits of such controls please make reference to the relevant table supplied included with the kit. CALCULATION OF RESULTS The evaluation of samples is automatic and the results are elaborated by means of a logit-log function. NORMAL VALUES The C1-Inhibitor values reported below are indicative. We suggest that each laboratory establish its own normal range: Protein Plasma Serum C1-Inhibitor g/l g/l ASSAY PERFORMANCE SPECIFICITY Antisera used are specific for determination of corresponding human C1-Inhibitor. SENSITIVITY The sensitivity of the assay is established by the lower limit of the reference curve and depends therefore upon the concentrations of the proteins in the calibrator. Typical measuring ranges are given in the Delta Nephelometer instruction manual. 7

8 PRECISION Precision was evaluated upon intra- and inter-assay variability. Intra-assay Inter-assay Protein n repl. Mean value [g/l] CV % n repl. Mean value [g/l] CV % C1-Inhibitor METHOD COMPARISON Serum and plasma samples were assayed with Radim antisera to anti-c1-inhibitor (y). These results were confronted with a reference nephelometric system(x). Correlation results yielded the following data: Protein Lineare regression Coeff. of correlation n samples C1-Inhibitor y = 0.901x g/l Sera C1-Inhibitor y = 0.942x g/l Plasma LIMITS OF THE ASSAY Turbidity or particles can interfere with the assay. Any particles formed due to serum samples not completely coagulated, proteinic denaturation or particles in samples must be removed by centrifugation. Due to technical manufacturing reasons and/or aged samples the results obtained for control samples and inter-laboratory survey samples may differ depending on the assay method used. It may therefore be necessary to assess these results in relation to method-specific target values. M365 - Rev.1 Ottobre 2005 RADIM SpA - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: 0039/06/ Fax: 0039/06/ ; National Order Entry: 0039/06/ ; Export Dept.: 0039/06/ ; Customer Care: 0039/06/ ; 8