IgG (Ref. NPP1N), IgA (Ref. NPP2N), IgM (Ref. NPP3N)

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1 IgG (Ref. NPP1N), IgA (Ref. NPP2N), IgM (Ref. NPP3N) REAGENTI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLE IMMUNOGLOBULINE UMANE IgG (NEL SIERO, NELLE URINE E NEL LIQUOR), IgA E IgM (NEL SIERO) CON METODO NEFELOMETRICO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO APPLICAZIONI CLINICHE La produzione di immunoglobuline (Ig), stimolata dal contatto tra antigene e sistema immunitario acquisito, viene effettuata dalle plasmacellule, derivanti da cloni di cellule B, con conseguente risposta di tipo policlonale da parte dell'organismo. In caso di reazione primaria si verifica l'aumento nel plasma di anticorpi appartenenti alla classe IgM e, a seguire, la formazione di anticorpi IgG ed IgA. Un aumento isolato delle IgG o congiunto alle IgM è sintomo di reazione secondaria verso un agente patogeno già noto all'organismo. La determinazione delle IgG può fornire indicazioni importanti sullo stato immunitario umorale. Un aumento della concentrazione di IgG nel siero si verifica in condizioni di infezioni acute e croniche, nelle malattie epatiche, autoimmuni e nelle infezioni intrauterine e perinatali. Una riduzione delle IgG nel siero si verifica negli stati di deficit immunitario primario e di insufficienza immunitaria secondaria (ad es. tumori maligni progrediti, mieloma multiplo, leucemia linfatica e morbo di Waldenström). In alcune patologie, quali ad esempio plasmocitoma, morbo di Waldenström e malattie a catene pesanti, sono state rilevate proliferazioni monoclonali delle immunoglobuline. Un aumento delle concentrazioni delle IgG nelle urine si riscontra nelle proteinurie glomerulari non selettive. PRINCIPIO DEL METODO Le immunoglobuline contenute nel siero umano formano degli immunocomplessi reagendo con gli anticorpi specifici. Sfruttando il fenomeno della diffrazione della luce che questi immunocomplessi provocano, si è in grado, per mezzo del nefelometro, di misurare l'intensità della luce diffratta, che risulta proporzionale alla concentrazione delle IgG, IgA o IgM presenti nel campione in esame. La valutazione avviene per confronto con un calibratore a concentrazione nota. REAGENTE CONTENUTO NELLA CONFEZIONE Il reagente deve essere conservato a 2-8 C. Durante la conservazione, l'antisiero può presentare flocculazioni o intorbidamenti che non dipendono da contaminazioni e che non influiscono sull'attività. In questi casi è necessario filtrare l'antisiero prima dell'uso. Allo scopo, si consiglia di usare filtri monouso con un diametro dei pori di 0.45 µm. La data di scadenza è indicata sulla etichetta e si riferisce al componente conservato chiuso a 2-8 C. A/S Antisiero: 1 flacone (5 ml) di antisiero policlonale, ottenuto in capra, contro IgG, IgA o IgM umane altamente purificate. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l'uso. Dopo l'impiego, conservare il reagente ermeticamente chiuso a 2-8 C per 4 settimane. Non congelare. I titoli anticorpali (T), che indicano quanti mg di antigene vengono precipitati in gel di agarosio da 1 ml dell'antisiero, vengono determinati mediante immunodiffusione radiale e indicati sull'etichetta del flacone. 1

2 MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO L'antisiero deve essere utilizzato con i seguenti reagenti: Calibratore Proteine S, (Ref. NCPP1) Controllo Proteine S/L, (Ref. NCPP2L) Controllo Proteine S/M, (Ref. NCPP2M) Controllo Proteine S/H, (Ref. NCPP2H) Controllo IgG Urinarie/Liquor, (Ref. NCPP2IU) Diluente, (Ref. NDPP1) Tampone di Reazione, (Ref. NDPP2) Nefelometro Delta (Ref ) Altro materiale di consumo e attrezzature sono descritte nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni e reagenti; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; in tal caso, ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità sotto riportate. I reagenti per cui non si fornisce la scheda di sicurezza non contengono sostanze chimiche pericolose o se presenti, queste sono al di sotto dei limiti di concentrazione definiti nel D.Lgs.285/98 e nella direttiva CEE 91/55. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su campioni di sieri umani, di urina o di liquor freschi. I campioni di siero devono essere completamente coagulati e, dopo essere stati centrifugati, non devono contenere particelle o tracce di fibrina in sospensione. Prima del dosaggio, accertarsi che i campioni siano perfettamente limpidi. Pertanto, campioni fortemente lipemici o campioni congelati, che dopo lo scongelamento si presentano torbidi, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10' a ca g). I campioni di siero e liquor possono essere conservati a 2-8 C per 8 giorni, per tempi più lunghi (1 anno) si consiglia di congelarli a -20 C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Per la determinazione delle IgG nelle urine sono adatte urine spontanee o di raccolta. Si consiglia di non congelare i campioni di urina e, prima di eseguire il test, di centrifugarli per rimuovere le componenti particolate. 2

3 PROCEDIMENTO OPERATIVO Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente (15-25 C). Seguire il procedimento operativo descritto sul manuale d'uso del Nefelometro Delta, che prevede l'allestimento di quanto segue: Curva di calibrazione: viene preparata automaticamente dallo strumento mediante diluizioni seriali del Calibratore Proteine S (Ref. NCPP1) con l'apposito Diluente (Ref. NDPP1). Le diluizioni effettuate vengono quindi impiegate per la calibrazione, che rimane valida purché il dosaggio dei sieri di controllo rientri nei limiti attesi. La calibrazione deve essere necessariamente ripetuta ogni qualvolta si utilizzi un nuovo lotto di antisiero. Campioni: prima del dosaggio, i sieri vengono diluiti automaticamente dallo strumento alla diluizione di 1:400 per le IgG e 1:20 (oppure 1:5 nello schema pediatrico) per le IgA e per le IgM, utilizzando l'apposito Diluente (Ref. NDPP1). Qualora i valori dei campioni siano al di fuori dell'ambito di misura è opportuno ripetere il test, utilizzando una diluizione maggiore o minore. Il dosaggio delle urine e del liquor, relativamente alle IgG, deve essere effettuato sui campioni indiluiti. CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO Per ogni serie di campioni e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di antisiero, è necessario effettuare un controllo di accuratezza e di precisione, utilizzando il Controllo Proteine S/L (Ref. NCPP2L), S/M (Ref. NCPP2M), S/H (Ref. NCPP2H) ed il Controllo IgG Urinarie/Liquor (Ref. NCPP2IU). I controlli vengono trattati come i campioni in esame. Per i limiti attesi di tali controlli fare riferimento alla relativa tabella fornita a corredo della confezione dei controlli stessi. CALCOLO DEI RISULTATI La valutazione dei campioni viene eseguita in modo automatico, mediante elaborazione dei risultati con una funzione logit-log. VALORI NORMALI I valori di IgG, IgA ed IgM sotto riportati sono soltanto indicativi. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento : Proteina Siero Urina Liquor IgG g/l < 8.8 mg/l < 40.0 mg/l IgA IgM g/l g/l CARATTERISTICHE METODOLOGICHE SPECIFICITA' Gli Antisieri utilizzati risultano essere specifici per la determinazione delle rispettive immunoglobuline umane (IgG, IgA o IgM). 3

4 SENSIBILITA' La sensibilità della determinazione viene definita dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende quindi dalla concentrazione delle proteine nel calibratore. Gli ambiti di misura sono riportati nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. PRECISIONE La precisione è stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed intersaggio. Intra-saggio Inter-saggio Proteina n repl. Valore medio [g/l] CV % n repl. Valore medio [g/l] CV % IgG IgA IgM CORRELAZIONE TRA METODI Campioni di siero sono stati esaminati con gli antisieri Radim anti-immunoglobuline umane IgG(y), IgA(y) o IgM(y). Campioni di urine e liquor sono stati esaminati con l'antisiero Radim anti-immunoglobuline IgG. Tali risultati sono stati messi a confronto con un sistema nefelometrico di riferimento (x). Le correlazioni dei risultati sono riportate nella tabella sottostante: Proteina Regressione lineare Coeff. di correlazione n campioni IgG (siero) y = 0.98 x g/l IgA y = 0.99 x g/l IgM y = 0.98 x g/l LIMITI DEL TEST La presenza di torbidità o di particelle può interferire nell'esecuzione del test. Si raccomanda, pertanto, di rimuovere mediante centrifugazione eventuali particelle dovute a sieri non completamente coagulati, a denaturazione proteica o presenti nei campioni di urina per le IgG. Per motivazioni tecniche relative alla produzione e/o all'invecchiamento dei campioni, i risultati ottenuti con i sieri di controllo e con i sieri per il controllo di qualità inter-laboratori possono differire in funzione del metodo utilizzato. Può quindi rendersi necessario valutare i risultati ottenuti facendo riferimento a valori specifici per i diversi metodi utilizzati. 4

5 IgG (Ref. NPP1N), IgA (Ref. NPP2N), IgM (Ref. NPP3N) REAGENTS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF HUMAN IMMUNOGLOBULINS IgG (IN HUMAN SERUM, URINE AND CSF), IgA, IgM (IN HUMAN SERUM) NEPHELOMETRIC METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY CLINICAL APPLICATIONS The production of immunoglobulins (Ig), stimulated by contact between antigens and immune system, originates from plasma cells. These cells, stemmed from B cells, originate the polyclonal immune response. In the case of a primary infection there is an increase of IgM class antibodies in the plasma followed by IgG and IgA classes. An isolated increase of IgG, or combined with an IgM increase, is a symptom of a secondary reaction to a pathogen already known to the organism. The evaluation of IgG can give important indications about the humoral immune condition. An IgG serum increase occurs in acute and chronic infections, in hepatic or autoimmune disease and in intrauterine or perinatal infections. A reduction of IgG serum concentration results in primary immune deficiency or secondary deficiency (i.g.: advanced maligant tumour, multiple myeloma, lymphatic leukaemia, Waldenström's disease). In some diseases such as plasmacytomas, Waldenström's disease and heavy-chain disease, development of monoclonal immunoglobulins are found in the serum. An increase of IgG concentrations in urine is found in cases of non-selective glomerular proteinuria. PRINCIPLE OF THE ASSAY The human serum immunoglobulins form immune complexes with specific antibodies. With the light diffraction phenomenon produced by these complexes it is possible to measure the intensity of scattered light using a nephelometer. This intensity is proportional to the concentration of the relevant Ig (IgG, IgA or IgM) in the sample. The result is evaluated by comparison with a calibrator of known concentration. REAGENT PROVIDED WITH THE KIT - Store the reagent at 2-8 C. During storage the antiserum can develop precipitates or turbidity which are not caused by microbial contamination and do not affect their activity. In such cases the antiserum should be filtered prior to use. Disposable filters with a pore size of 0.45 µm are suitable for this purpose. - The expiry date is given on the label and it refers to the closed component stored at 2-8 C. A/S Antiserum: 1 vial (5 ml) of polyclonal antiserum, produced by immunisation of goat to highly purified IgG, IgA or IgM. Preservative: NaN3 (< 0.1 %). Ready for use. After each use store the reagent, sealed hermetically, at 2-8 C for 4 weeks. Do not freeze. The antibody titres (T) indicate the quantity of antigen in mg which will be precipitated in agarose gel by 1 ml of the corresponding antiserum. The titres are determined by radial immunodiffusion and are printed on the vial labels. 5

6 MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED The Antiserum must be used with the following reagents: Protein Calibrator, (Ref. NCPP1) Protein Control S/L, (Ref. NCPP2L) Protein Control S/M, (Ref. NCPP2M) Protein Control S/H, (Ref. NCPP2H) Urinary/CSF IgG Control, (Ref. NCPP2IU) Diluent, (Ref. NDPP1) Reaction Buffer, (Ref. NDPP2) Delta Nephelometer (Ref ) Disposable materials and samples as described in the instruction manual for the Delta Nephelometer. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: - Do not use reagents beyond their expiry date - Avoid any contamination among samples and reagents. For this purpose disposable tips should be used for each sample and reagent. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: - Use disposable gloves while handling any potentially infectious material and while performing the assay. - Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. - Avoid splashing and aerosol formation; in such cases wash carefully with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. - The reagents for which a Safety Data Sheet is not supplied do not contain hazardous chemical substances or, if they do, are below the concentration limits established by the Italian decree D.Lgs.285/98 in compliance with EEC directive 91/ According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC) all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste materials (European classification code180103). As such they must be eliminated by delegating to special enterprises qualified in waste collection and disposal. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Fresh serum, urine or CSF human samples are suitable for use. Serum samples should have coagulated completely and, after centrifugation, should contain no particles or traces of fibrin. Prior to use be sure that samples are perfectly clear. Specimens showing particulate matter or turbidity should be centrifuged (10 minutes at approx. 15,000 x g) prior to use. Serum and CSF samples can be stored at 2-8 C for 8 days, for longer periods (1 year) it is advisable to freeze samples at -20 C. Repeated Freeze/thawing of samples should be avoided. Random and timed urine collections are suitable specimens for the assessment of IgG in urine. It is advisable not to freeze urine samples and to centrifuge prior to use to remove any particulate matter. 6

7 ASSAY PROCEDURE - All steps are automatically performed by the instrument. - Allow the reagents and samples to warm up to room temperature (15 to 25 C). - Consult the Delta Nephelometer manual for details regarding the operation of the instrument in preparation of the following: - Reference curve: is automatically prepared by instrument with serial dilutions of the Calibrator (Ref. NDPP1) using the supplied Diluent (Ref. NDPP1). These dilutions are used for calibration. The calibration is valid as long as control serum performances are reproduced within their expected limits. Every time a different lot of antiserum is used a new calibration curve must be prepared. - Specimens: prior to use, serum samples are automatically diluted 1:400 for IgG assay and 1:20 dilution (or 1:5 for paediatric scheme) for IgA and IgM assays using the supplied Diluent (Ref. NDPP1). If the readings obtained are outside the assay range the assay can be repeated using a higher or lower dilution of sample. IgG Urine assay protocols must be performed using undiluted samples. - Internal Quality Control: for each series of serum samples as well as the initial opening of an antiserum vial, an accuracy and precision control should be assessed using the Protein Controls S/L (Ref. NCPP2L), S/M (Ref. NCPP2M), S/H (Ref. NCPP2H) and the Urinary/CSF IgG Control (Ref. NCPP2IU). The controls are assayed and results evaluated as for patient samples. For the expected values refer to the table provided with the control kit. CALCULATION OF RESULTS The evaluation of samples is automatic and the results are elaborated by means of a logit-log function. NORMAL VALUES The IgG, IgA and IgM values reported below are indicative. We suggest that each laboratory establish its own normal range: Protein Serum Urine CSF IgG g/l < 8.8 mg/l < 40.0 mg/l IgA IgM g/l g/l ASSAY PERFORMANCE SPECIFICITY Antisera used are specific for determination of corresponding human immunoglobulins (IgG, IgA or IgM). SENSITIVITY The sensitivity of the assay is established by the lower limit of the reference curve and depends therefore upon the concentrations of the proteins in the calibrator. Typical measuring ranges are given in the Delta Nephelometer instruction manual. 7

8 PRECISION Precision was evaluated upon intra- and inter-assay variability. Intra-assay Inter-assay Protein repl. n Mean value [g/l] CV % repl. n Mean value [g/l] CV % IgG IgA IgM METHOD COMPARISON Serum samples were assayed with Radim antisera to human immunoglobulin IgG(y), IgA(y) or IgM(y). Urine and CSF samples were assayed with Radim antiserum to immunoglobulin IgG(y). These results were confronted with a reference nephelometric system(x). Correlation results yielded the following data: Protein Linear Regression Coeff. of correlation n samples IgG (serum) y = 0.98 x g/l IgA y = 0.99 x g/l IgM y = 0.98 x g/l LIMITS OF THE ASSAY Turbidity or particles can interfere with the assay. Any particles formed due to serum samples not completely coagulated, proteinic denaturation or particles in IgG urine samples must be removed by centrifugation. Due to technical manufacturing reasons and/or aged samples the results obtained for control samples and inter-laboratory survey samples may differ depending on the assay method used. It may therefore be necessary to assess these results in relation to method-specific target values. M292N - Rev. 2 Febbraio 2007 RADIM SpA - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: 0039/06/ Fax: 0039/06/ ; National Order Entry: 0039/06/ ; Export Dept.: 0039/06/ ; Customer Care: 0039/06/ ; 8