Ig/L KAPPA REF NPP8L, Ig/L Lambda REF NPP9L

Transcript

1 Ig/L KAPPA REF NPP8L, Ig/L Lambda REF NPP9L REAGENTI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLE CATENE LEGGERE DELLE IMMUNOGLOBULINE UMANE tipo "κ" o tipo "λ" NEL SIERO E NELLE URINE CON METODO NEFELOMETRICO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO APPLICAZIONI CLINICHE L'interesse relativo alla determinazione quantitativa delle catene leggere (tipo κ e tipo λ) delle immunoglobuline è essenzialmente legato alla diagnosi delle gammapatie monoclonali. Ciò deriva dal fatto che, normalmente, la concentrazione delle catene L di immunoglobuline nel siero è legata alla concentrazione delle corrispondenti molecole complete, ovvero alla concentrazione delle IgG, IgA ed IgM. Una variazione indipendente delle catene L è funzione della presenza, nel siero, di catene libere, sia leggere che pesanti. Nelle Ig policlonali il rapporto tra le concentrazioni delle catene leggere di tipo κ e tipo λ è circa di 2:1; nelle Ig monoclonali, invece, si determina l aumento di un solo tipo di catene leggere, o κ o λ. La variazione del rapporto tra le catene leggere può essere provocata, quindi, dalla proliferazione di Ig monoclonali complete o di catene leggere monoclonali libere ed indicare così la presenza di una gammapatia monoclonale. Molecole complete di Ig non riescono a passare nelle urine attraverso una barriera glomerulare intatta. Al contrario, le catene leggere attraversano il glomerulo ma vengono normalmente riassorbite nel tratto tubulare. Alte concentrazioni di catene leggere libere possono superare la normale capacità di riassorbimento del tubulo e passare nelle urine (proteine di Bence-Jones), indicando anche qui, una gammapatia monoclonale. PRINCIPIO DEL METODO Le catene leggere delle immunoglobuline contenute nel siero umano formano degli immunocomplessi, reagendo con gli anticorpi specifici. Sfruttando il fenomeno della diffrazione della luce che questi immunocomplessi provocano, si è in grado, per mezzo del nefelometro, di misurare l'intensità della luce diffratta, che risulta proporzionale alla concentrazione delle Ig/L tipo κ o tipo λ presenti nel campione in esame. La valutazione avviene per confronto con un calibratore a concentrazione nota. REAGENTE CONTENUTO NELLA CONFEZIONE Il reagente deve essere conservato a 2-8 C. Durante la conservazione, l'antisiero può presentare flocculazioni o intorbidamenti che non dipendono da contaminazioni e che non influiscono sull'attività. In questi casi è necessario filtrare l'antisiero prima dell'uso. Allo scopo, si consiglia di usare filtri monouso con un diametro dei pori di 0.45 µm. La data di scadenza è indicata sulla etichetta e si riferisce al componente conservato chiuso a 2-8 C. A/S Antisiero: 1 flacone (2 ml) di antisiero policlonale, ottenuto in capra, contro Ig/L tipo κ o tipo λ umane altamente purificate. Conservante: NaN3 (<0.1%). Pronto per l'uso. Dopo l'impiego, conservare il reagente ermeticamente chiuso a 2-8 C per 4 settimane. Non congelare. I titoli anticorpali (T), che indicano quanti mg di antigene vengono precipitati in gel di agarosio da 1 ml dell'antisiero, vengono determinati mediante immunodiffusione radiale e indicati sull'etichetta del flacone. 1

2 MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO L'antisiero deve essere utilizzato con i seguenti reagenti: Calibratore Proteine S, (REF NCPP1) Controllo Proteine S/L, (REF NCPP2L) Controllo Proteine S/M, (REF NCPP2M) Controllo Proteine S/H, (REF NCPP2H) Diluente, (REF NDPP1) Tampone di Reazione, (REF NDPP2) Nefelometro Delta, (REF ) Altro materiale di consumo e attrezzature sono descritte nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni e reagenti; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; in tal caso, ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità sotto riportate. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su campioni di sieri umani o di urina freschi. I campioni di siero devono essere completamente coagulati e, dopo essere stati centrifugati, non devono contenere particelle o tracce di fibrina in sospensione; prima del dosaggio, accertarsi che i campioni siano perfettamente limpidi. Pertanto, campioni fortemente lipemici o campioni congelati, che dopo lo scongelamento si presentano torbidi, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10' a ca g). I campioni di siero possono essere conservati a 2-8 C per 8 giorni, per tempi più lunghi (1 anno) si consiglia di congelarli a -20 C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Per la determinazione delle Ig/L nelle urine sono adatte urine spontanee o di raccolta. Si consiglia di non congelare i campioni di urina e, prima di eseguire il test, di centrifugarli per rimuovere le componenti particolate. PROCEDIMENTO OPERATIVO Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente (15-25 C). Seguire il procedimento operativo descritto sul manuale d'uso del Nefelometro Delta, che prevede l'allestimento di quanto segue: Curva di calibrazione: viene preparata automaticamente dallo strumento mediante diluizioni seriali del Calibratore (REF NCPP1) con l'apposito Diluente (REF NDPP1). Le diluizioni effettuate vengono quindi impiegate per la calibrazione, che rimane valida purché il 2

3 dosaggio dei sieri di controllo rientri nei limiti attesi. La calibrazione deve essere necessariamente ripetuta ogni qualvolta si utilizzi un nuovo lotto di antisiero. Campioni: prima del dosaggio, i sieri vengono diluiti automaticamente dallo strumento alla diluizione di 1:20 utilizzando l'apposito Diluente (REF NDPP1). Qualora i valori dei campioni siano al di fuori dell'ambito di misura è opportuno ripetere il test, utilizzando una diluizione maggiore o minore. Il dosaggio delle urine deve essere effettuato sui campioni indiluiti. CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO Per ogni serie di campioni e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di antisiero, è necessario effettuare un controllo di accuratezza e di precisione, utilizzando il Controllo per Proteine S/L (REF NCPP2L), S/M (REF NCPP2M), S/H (REF NCPP2H). Utilizzare il Controllo per Proteine S/M (REF NCPP2M) come controllo urinario. I controlli vengono trattati come i campioni in esame. Per i limiti attesi di tali controlli fare riferimento alla relativa tabella fornita a corredo della confezione dei controlli stessi. CALCOLO DEI RISULTATI La valutazione dei campioni viene eseguita in modo automatico, mediante elaborazione dei risultati con una funzione logit-log. VALORI NORMALI I valori di Ig/L sotto riportati sono soltanto indicativi. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento. Nelle urine i valori normali si trovano al di sotto del limite di sensibilità dei metodi immunonefelometrici. Proteina Siero Urina Ig/L tipo κ g/l < 7.10 mg/l Ig/L tipo λ g/l < 3.90 mg/l Rapporto κ / λ CARATTERISTICHE METODOLOGICHE SPECIFICITA' Gli Antisieri utilizzati risultano essere specifici per la determinazione delle rispettive immunoglobuline umane Ig/L (tipo κ o tipo λ). SENSIBILITA' La sensibilità della determinazione viene definita dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende quindi dalla concentrazione delle proteine nel calibratore. Gli ambiti di misura sono riportati nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. PRECISIONE La precisione è stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed intersaggio. Intra-saggio Inter-saggio Proteina n repl. Valore medio [g/l] CV % n repl. Valore medio [g/l] CV % Ig/L tipo κ Ig/L tipo λ

4 CORRELAZIONE TRA METODI Campioni di siero e urina sono stati esaminati con gli antisieri Radim anti-immunoglobuline umane Ig/L tipo κ (y) o Ig/L tipo λ (y). Tali risultati sono stati messi a confronto con un sistema nefelometrico di riferimento (x). Le correlazioni dei risultati sono riportate nella tabella sottostante: Proteina Regressione lineare Coeff. di correlazione n campioni Ig/L tipo κ (siero) y = 1.04x Ig/L tipo κ (urina) y = 1.08x Ig/L tipo λ (siero) y = 0.99x Ig/L tipo λ (urina) y = LIMITI DEL TEST La presenza di torbidità o di particelle può interferire nell'esecuzione del test. Si raccomanda, pertanto, di rimuovere mediante centrifugazione eventuali particelle dovute a sieri non completamente coagulati, a denaturazione proteica o presenti nei campioni di urina. Per motivazioni tecniche relative alla produzione e/o all'invecchiamento dei campioni, i risultati ottenuti con i sieri di controllo e con i sieri per il controllo di qualità inter-laboratori possono differire in funzione del metodo utilizzato. Può quindi rendersi necessario valutare i risultati ottenuti facendo riferimento a valori specifici per i diversi metodi utilizzati. Gli A/S anti Ig/L reagiscono sia contro catene leggere libere che legate. E possibile, attraverso l'impiego di adeguate indagini (elettroforesi, immunofissazione, dosaggio quantitativa delle immunoglobuline), determinare la presenza nel campione d'urina di catene leggere legate che altrimenti possono essere interpretate come presenza di catene leggere libere (proteine di Bence-Jones), causando la misclassificazione del reperto. Nella diagnosi di una gammapatia monoclonale, la determinazione nefelometrica delle catene L di tipo κ o tipo λ non può sostituire l'immunofissazione o l'immunoelettroforesi. Gli antigeni presenti nei campioni possono mostrare un epitopo diverso da quello delle catene leggere delle Ig policlonali dello Standard, per cui, differenti diluizioni possono dare risultati diversi. Di conseguenza, i valori delle concentrazioni ottenute dovrebbero essere utilizzati soltanto per monitorare singoli pazienti. Nei casi in cui siano presenti contemporaneamente due Ig monoclonali con catene leggere diverse, il rapporto κ/λ potrebbe rientrare nell ambito dei valori di riferimento, rendendo necessaria la presenza di ulteriori dati di laboratorio e accertamenti clinici. In campioni di urine con concentrazione di Ig/L particolarmente elevate, si possono avere risultati erroneamente bassi. In presenza di altri dati diagnostici o clinici che contrastino con il risultato ottenuto, è consigliabile ridosare il campione con diluizioni superiori. Utile la determinazione delle proteine totali come verifica della veridicità dei dati ottenuti nei campioni di urina. 4

5 Ig/L KAPPA REF NPP8L, Ig/L Lambda REF NPP9L REAGENTS FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF LIGHT CHAINS OF HUMAN IMMUNOGLOBULINS type "κ" or type "λ" IN SERUM AND URINES WITH NEPHELOMETRIC METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY CLINICAL APPLICATIONS The interest for the quantitative determination of the light chains (type κ and type λ) of immunoglobulins is essentially linked to the diagnosis of monoclonal gammopathies, because the serum concentration of light chains of immunoglobulins depends on the concentration of the corresponding complete molecules, namely on the concentration of IgG, IgA and IgM. An independent variation of light chains is a function of the presence in the blood serum of free both light and heavy chains. In polyclonal immunoglobulins the ratio between the concentrations of light chains type κ and type λ is about 2:1; in monoclonal Ig s, on the contrary, only one type of light chains, or κ or λ, appears. Therefore, the change in the ratio between the light chains could be caused by the proliferation of complete monoclonal Ig s or of free light monoclonal chains, and could indicate the presence of a monoclonal gammopathy. Complete molecules of Ig s are unable to pass into the urine through an intact glomerular barrier. On the contrary, the light chains cross the glomerule, but they are normally reabsorbed in the tubular tract. High concentrations of free light chains could overcome the normal reabsorption capacity of the tubule and pass into the urine (Bence-Jones proteins). This indicates again a monoclonal gammopathy. PRINCIPLE OF THE ASSAY the human serum immunoglobulins light chains form immuno complexes with specific antibodies. With the light diffraction phenomenon produced by these complexes it is possible to measure the intensity of scattered light using a nephelometer. This intensity is proportional to the concentration of the relevant Ig (type κ or λ) in the sample. The result is evaluated by comparison with a calibrator of known concentration. REAGENT CONTAINED IN THE PACKAGE Store the reagent at 2-8 C. During storage the antiserum can develop precipitates or turbidity which are not caused by microbial contamination and do not affect their activity. In such cases the antiserum should be filtered prior to use. Disposable filters with a pore size of 0.45 µm are suitable for this purpose. The expiry date is given on the label and it refers to the closed component stored at 2-8 C. A/S Antiserum: 1 vial (2 ml) of polyclonal antiserum, produced by immunisation of goat to highly purified human Ig/L type κ or type λ. Preservative NaN3 (<0.1%). Ready for use. After each use store the reagent, sealed hermetically, at 2-8 C for 4 weeks. Do not freeze. The antibody titres (T) indicate the quantity of antigen in mg which will be precipitated in agarose gel by 1 ml of the corresponding antiserum. The titres are determined by radial immunodiffusion and are printed on the vial labels. 5

6 MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED The antiserum should be used with the following reagents: Protein Calibrator S, (REF NCPP1) Protein Control S/L, (REF NCPP2L) Protein Control S/M, (REF NCPP2M) Protein Control S/H, (REF NCPP2H) Diluent, (REF NDPP1) Reaction Buffer, (REF NDPP2) Delta Nephelometer, (REF ) Other consumables and equipment are described in the Manual for Use of Delta Nephelometer. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not use reagents beyond their expiry date Avoid any contamination among samples and reagents. For this purpose disposable tips should be used for each sample and reagent. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling any potentially infectious material and while performing the assay. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases wash carefully with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC) all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste materials (European classification code180103). As such they must be eliminated by delegating to special enterprises qualified in waste collection and disposal. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Fresh serum or urine human samples are suitable for use. Serum samples should have coagulated completely and, after centrifugation, should contain no particles or traces of fibrin. Prior to use be sure that samples are perfectly clear. Specimens showing particulate matter or turbidity should be centrifuged (10 minutes at approx. 15,000 x g) prior to use. Serum samples can be stored at 2-8 C for 8 days, for longer periods (1 year) it is advisable to freeze samples at -20 C. Repeated Freeze/thawing of samples should be avoided. Random and timed urine collections are suitable specimens for the assessment of light chains (type κ and type λ) of immunoglobulins in urine. It is advisable not to freeze urine samples and to centrifuge prior to use to remove any particulate matter. ASSAY PROCEDURE All steps are automatically performed by the instrument. Allow the reagents and samples to warm up to room temperature (15 to 25 C). Consult the Delta Nephelometer manual for details regarding the operation of the instrument in preparation of the following: Reference curve: is automatically prepared by instrument with serial dilutions of the Calibrator (REF NCPP1) using the supplied Diluent (REF NDPP1). These dilutions are used for calibration. The calibration is valid as long as control serum performances are reproduced within their expected limits. Every time a different lot of antiserum is used a new calibration curve must be prepared. Specimens: prior to use, serum samples are automatically diluted 1:20 for assay using the supplied Diluent (REF NDPP1). If the readings obtained are outside the assay range the 6

7 assay can be repeated using a higher or lower dilution of sample. Ig light chains urine assay protocols must be performed using undiluted samples. INTERNAL QUALITY CONTROL For each series of serum samples as well as the initial opening of an antiserum vial, an accuracy and precision control should be assessed using the Protein Controls S/L (REF NCPP2L), S/M (REF NCPP2M), S/H (REF NCPP2H). Use the Protein Controls S/M (REF NCPP2M) as urinary control. The controls are assayed and results evaluated as for patient samples. For the expected values refer to the table provided with the control kit. CALCULATION OF RESULTS The evaluation of samples is automatic and the results are elaborated by means of a logit-log function. NORMAL VALUES The Ig light chains values reported below are indicative. We suggest that each laboratory establish its own normal range: Protein Serum Urine Ig/L type κ g/l < 7.10 mg/l Ig/L type λ g/l < 3.90 mg/l κ / λ ratio ASSAY PERFORMANCE SPECIFICITY Antisera used are specific for determination of corresponding human immunoglobulins Ig/L (type κ or type λ). SENSITIVITY The sensitivity of the assay is established by the lower limit of the reference curve and depends therefore upon the concentrations of the proteins in the calibrator. Typical measuring ranges are given in the Delta Nephelometer instruction manual. PRECISION Precision has been assessed by measuring the intra and inter assay variability. Intra- assay Inter- assay Protein repl. n Mean value [g/l] CV % repl. n Mean value [g/l] CV % Ig/L type κ Ig/L type λ METHOD COMPARISON Serum and urine samples were examined with Radim antisera anti-human immunoglobulins Ig/L type κ (y) or Ig/L type λ (y). The results were compared with a reference nephelometric system (x). The correlations of results are shown in the following table: 7

8 Protein Linear Regression Coeff. of correlation n samples Ig/L type κ (serum) y = 1.04x Ig/L type κ (urine) y = 1.08x Ig/L type λ (serum) y = 0.99x Ig/L type λ (urine) y = TEST LIMITS The presence of turbidity and particles could interfere with the test performance. Therefore, it is recommended to remove by centrifugation any particles due to not completely coagulated sera, to protein denaturation or to particles present in the urine samples. Due to technical reasons related to the production and/or ageing of samples, the results obtained with control sera and with sera for inter-laboratories quality control, could differ depending on the methods employed. Therefore, it could be necessary to assess the results obtained by referring to specific values for the different methods adopted. Antisera anti Ig/L react against both free or bound light chains. Using suitable investigations (electrophoresis, immunofixation, quantitative dosage of immunoglobulins), it is possible to determine in a sample of urine the presence of light chains bound, that can be otherwise interpreted as the presence of free light chains (Bence-Jones proteins), causing a missclassification of the findings. In the diagnosis of a monoclonal gammopathy, the nephelometric determination of light chains type κ or type λ could not replace the immunofixation or the immunoelectrophoresis. Antigens present in the samples could show an epitope different from the one of the light chains of polyclonal Ig s of the Standard. Therefore, different dilutions could give different results. Accordingly, the values of concentrations obtained should be used only to monitor single patients. When two monoclonal Ig s with different light chains are present simultaneously, the κ/λ ratio could be within the range of the reference values, requiring the presence of further laboratory data and clinical investigations. In urine samples with particularly high Ig/L concentrations, falsely low results could be obtained. In the presence of other diagnostic or clinical data that are in contrast with the result obtained, it is advisable to dose again the sample with higher dilutions. The determination of total proteins as a verification of the truth of data obtained in urine samples may be useful. M300 - Rev.5 Giugno 2009 RADIM SpA - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: 0039/06/ Fax: 0039/06/ ; National Order Entry: 0039/06/ ; Export Dept.: 0039/06/ ; Customer Care: 0039/06/ ; 8