ANTITROMBINA III (Ref. NPP22L)

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1 ANTITROMBINA III (Ref. NPP22L) REAGENTI PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELL ANTITROMBINA III NEL PLASMA UMANO CON METODO NEFELOMETRICO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO APPLICAZIONI CLINICHE L Antitrombina III è una glicoproteina sintetizzata nel fegato deputata alla neutralizzazione della Trombina. Svolge un azione anticoagulante e in particolare previene la tromboembolia. Una riduzione dei livelli di Antitrombina III nel plasma può verificarsi in caso di gravi epatopatie croniche (cirrosi epatica), coagulopatie da consumo, ad esempio CID (coagulazione intravasolare disseminata), nefrosi, uso di contraccettivi orali di tipo estrogeno-progestinico, deficit congenito. PRINCIPIO DEL METODO L Antitrombina III, contenuta nel plasma umano, forma degli immunocomplessi reagendo con gli anticorpi specifici. Sfruttando il fenomeno della diffrazione della luce che questi immunocomplessi provocano, si è in grado, per mezzo del nefelometro, di misurare l'intensità della luce diffratta, che risulta proporzionale alla concentrazione di Antitrombina III presente nel campione in esame. La valutazione avviene per confronto con un calibratore a concentrazione nota. REAGENTE CONTENUTO NELLA CONFEZIONE Il reagente deve essere conservato a 2-8 C. Durante la conservazione, l'antisiero può presentare flocculazioni o intorbidamenti che non dipendono da contaminazioni e che non influiscono sull'attività. In questi casi è necessario filtrare l'antisiero prima dell'uso. Allo scopo, si consiglia di usare filtri monouso con un diametro dei pori di 0.45 µm. La data di scadenza è indicata sulla etichetta e si riferisce al componente conservato chiuso a 2-8 C. A/S Antitrombina III: 1 flacone (2 ml) di antisiero policlonale, ottenuto in capra, contro Antitrombina III umana, altamente purificato. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l'uso. Dopo l'impiego, conservare il reagente ermeticamente chiuso a 2-8 C per 4 settimane. Non congelare. I titoli anticorpali (T), che indicano quanti mg di antigene vengono precipitati in gel di agarosio da 1 ml dell'antisiero, vengono determinati mediante immunodiffusione radiale e indicati sull'etichetta del flacone. RS Reagente Supplementare Antitrombina III: 1 flacone (3.0 ml) di soluzione tamponata e catalizzatore. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l uso. Dopo l'impiego, conservare il reagente ermeticamente chiuso a 2-8 C per 4 settimane. Non congelare. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Il kit deve essere utilizzato con i seguenti reagenti: Calibratore Proteine P, (Ref. NCPP1PL1); Controllo Proteine P, (Ref. NCPP2PL1) Diluente, (Ref. NDPP1) Tampone di Reazione, (Ref. NDPP2) Nefelometro Delta (Ref ) Altro materiale di consumo ed attrezzature sono descritte nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. 1

2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni e reagenti; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; in tal caso, ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità sotto riportate. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su campioni di plasma umano freschi. Prima del dosaggio, accertarsi che i campioni siano perfettamente limpidi. Pertanto, campioni fortemente lipemici o campioni congelati, che dopo lo scongelamento si presentano torbidi, devono essere chiarificati mediante centrifugazione (10' a ca g). I campioni di plasma possono essere conservati a 2-8 C per 8 giorni, per tempi più lunghi (1 anno) si consiglia di congelarli a -20 C. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. PROCEDIMENTO OPERATIVO Tutte le fasi vengono eseguite automaticamente dallo strumento Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente (15-25 C). Seguire il procedimento operativo descritto sul manuale d'uso del Nefelometro Delta, che prevede l'allestimento di quanto segue: Curva di calibrazione: viene preparata automaticamente dallo strumento mediante diluizioni seriali del Calibratore (Ref. NCPP1PL1) con l'apposito diluente (Ref. NDPP1). Le diluizioni effettuate vengono quindi impiegate per la calibrazione, che rimane valida purché il dosaggio del siero di controllo rientri nei limiti attesi. La calibrazione deve essere necessariamente ripetuta ogni qualvolta si utilizzi un nuovo lotto di antisiero. Campioni: prima del dosaggio, i campioni di plasma vengono diluiti automaticamente dallo strumento Delta alla diluizione di 1:20 utilizzando l'apposito diluente (Ref. NDPP1). Qualora i valori dei campioni siano al di fuori dell'ambito di misura è opportuno ripetere il test, utilizzando una diluizione maggiore o minore. 2

3 CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO Per ogni serie di campioni e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di antisiero, è necessario effettuare un controllo di accuratezza e di precisione, utilizzando il Controllo Proteine P (NCPP2PL1). Il controllo viene trattato come i campioni in esame. Per i limiti attesi di tale controllo fare riferimento alla relativa tabella fornita a corredo della confezione del controllo stesso. CALCOLO DEI RISULTATI La valutazione dei campioni viene eseguita in modo automatico, mediante elaborazione dei risultati con una funzione logit-log. VALORI NORMALI I valori di Antitrombina III sotto riportati sono soltanto indicativi. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento: Proteina Antitrombina III Plasma g/l CARATTERISTICHE METODOLOGICHE SPECIFICITA' L antisiero utilizzato risulta essere specifico per la determinazione dell Antitrombina III umana. SENSIBILITA' La sensibilità della determinazione viene definita dal limite inferiore della curva di calibrazione e dipende quindi dalla concentrazione delle proteine nello standard. Gli ambiti di misura sono riportati nel manuale d'uso del Nefelometro Delta. PRECISIONE La precisione è stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed inter-saggio. Proteina n repl. Intra-saggio n repl. Inter-saggio Valore medio [g/l] CV % Valore medio [g/l] CV % Antitrombina III

4 CORRELAZIONE TRA METODI Campioni di plasma sono stati esaminati con l antisiero Radim anti-antitrombina III umana (y). Tali risultati sono stati messi a confronto con un sistema nefelometrico di riferimento (x). Le correlazioni dei risultati sono riportate nella tabella sottostante: Proteina Regressione lineare Coeff. di correlazione n campioni Antitrombina III y = 0.98 x LIMITI DEL TEST La presenza di torbidità o di particelle può interferire nell'esecuzione del test. Si raccomanda, pertanto, di rimuovere mediante centrifugazione eventuali particelle dovute a plasma con denaturazione proteica. Per motivazioni tecniche relative alla produzione e/o all'invecchiamento dei campioni, i risultati ottenuti con i plasma di controllo e con i plasma per il controllo di qualità inter-laboratori possono differire in funzione del metodo utilizzato. Può quindi rendersi necessario valutare i risultati ottenuti facendo riferimento a valori specifici per i diversi metodi utilizzati. 4

5 ANTITHROMBIN III (Ref. NPP22L) REAGENTS FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF ANTITHROMBIN III IN HUMAN PLASMA WITH NEPHELOMETRIC METHOD FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY CLINICAL APPLICATIONS Antithrombin III is a glycoprotein formed in the liver and serves to neutralization of Thrombin. It acts as an anticoagulant and in particular it prevents the thrombotic disease. Diminished plasma levels of Antithrombin III can occur in severe chronic hepatic impairment (hepatic cirrhosis), consumption coagulopathies, e.g. DIC (disseminated intravascular coagulation), nephroses, in patients receiving oral estrogen-progesterone based contraceptives, genetic deficiency. PRINCIPLE OF THE ASSAY The Antithrombin III in plasma forms immunocomplexes, by reacting with the specific antibodies. By exploiting the light diffraction phenomenon which these immunocomplexes provoke, it is possible, by means of the nephelometer, to measure the intensity of the diffracted light, which is proportional to the concentration of Antithrombin III present in the test sample. The evaluation is made by comparing a standard with a known concentration. REAGENT CONTAINED IN THE KIT The reagent has to be stored at 2-8 C. During the storage, the antiserum can show flocculation or clouding, that are not dependant on contaminations and do not influence the activity. In these cases, it is necessary to filter the antiserum before use. For this purpose, it is recommended to use disposable filters with a pore diameter of 0.45 µm. The expiry date is printed on the label and refers to the component stored closed at 2-8 C. A/S Antithrombin III: 1 vial (2 ml) of polyclonal antiserum, obtained from goat, against highly purified human Antithrombin III. Preservative: NaN3 (<0.1%). Ready for use. After use, store the reagent hermetically sealed at 2-8 C for 4 weeks. Do not freeze. The antibody titers (T) indicate the quantity of antigen in mg which will be precipitated in agarose gel by 1 ml of the corresponding antiserum. The titers are determined by radial immunodiffusion and they are printed on the vial labels. RS Antithrombin III Supplementary Reagent: 1 vial (3.0 ml) of buffered solution of detergents. Preservative: NaN3 (< 0.1 %). Ready for use. After each use store the reagent, sealed hermetically, at 2-8 C for 4 weeks. Do not freeze. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED The Antiserum must be used with the following reagents: Protein Calibrator P, (Ref. NCPP1PL1) Protein Control P, (Ref. NCPP2PL1) Reaction Buffer, (Ref.NDPP2) Diluent, (Ref. NDPP1) Delta Nephelometer (Ref ) Other consumables and equipment are described in the Manual for use of Delta Nephelometer. WARNINGS AND PRECAUTIONS 5

6 In order to get correct and reproducible results, it is necessary to adopt the following rules: Do not use reagents after the expiry date. Accurately avoid contaminations between samples and reagents; to this purpose, it is advisable to use pipettes with disposable tips for each sample and for each reagent. In order to avoid personal and environmental contaminations, it is necessary to comply with the following safety rules: Use disposable gloves during the handling of potentially infected material and during the assay. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Avoid the formation of spills and aerosols. In this event, clean accurately with sodium hypochlorite at 3% concentration. The medium employed for cleaning should be treated as a potentially infected residual and should be eliminated by the methods mentioned below. Complying with the Italian Decree of Law n. 22 of February 5, 1997, which refers to EEC Directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all the wastes coming from manual and/or automatic processes are classified as special dangerous wastes with the classification code CER Therefore, they should be eliminated by specialized companies authorized for the withdrawal and disposal of special wastes. SAMPLES COLLECTION AND PREPARATION The assay can be carried out on fresh plasma samples. Before the assay assure that the samples are perfectly clear. Therefore, heavily lipemic samples or frozen samples, that are cloudy after thawing, should be cleared with centrifugation (10 min at about rpm). Plasma samples can be stored at 2-8 C for 8 days, for a storage for longer periods (1 year), it is recommended to freeze them at -20 C. Avoid repeated freezings and thawings. OPERATIONAL PROCEDURE All the steps are automatically carried out by the equipment Wait until reagents and samples reach the room temperature (15-25 C). Follow the operational procedure described in the manual for use of Delta Nephelometer, which provides for the preparation of the following data: Calibration curve: it is automatically prepared by the equipment through serial dilutions of the Calibrator (Ref. NCPP1PL1) with the suitable diluting agent (Ref. NDPP1). The dilutions carried out are used for calibration, which is valid on condition that the assay of the control sera is within the expected limits. Calibration should be necessarily repeated whenever a new batch of antiserum is used. Samples: before the assay, the plasma samples are automatically diluted by the equipment to the dilution of 1:20 using the suitable diluting agent (Ref. NDPP1). Whenever the values of the samples are out of the range of measurement, it is advisable to repeat the test using a higher or lower dilution. INTERNAL QUALITY CONTROL 6

7 For each series of samples and every time a new vial of reagent is used, it is necessary to perform an accuracy and precision check, using the Protein Control P (Ref. NCPP2PL1). The controls are treated as for samples under test. For the expected limits of such controls please make reference to the relevant table supplied included with the kit. CALCULATION OF RESULTS The samples are assessed automatically by processing the results with a logit-log function. NORMAL VALUES The Antithrombin III values mentioned here below are only indicative. It is recommended that each laboratory establishes its own reference ranges. Protein Antithrombin III Serum g/l METHODOLOGICAL FEATURES SPECIFICITY The antiserum used is specific for the determination of human Antithrombin III. SENSITIVITY The sensitivity of the determination is defined by the lower limit of the calibration curve and depends on the concentration of proteins in the standard. The measurement ranges are listed in the manual for use of Delta Nephelometer. PRECISION Precision has been evaluated by measuring the intra and inter assay variability. Protein n repl. Intra-assay n repl. Inter-assay Mean value [g/l] CV % Mean value [g/l] CV % Antithrombin III

8 METHOD COMPARISON Serum samples were examined with Radim antiserum anti human Antithrombin III (y). The results were compared with a reference nephelometric method (x). The correlations of results are shown in the following table: Protein Linear regression Coeff. of correlation n samples Antithrombin III y = 0.98 x TEST LIMITS The presence of turbidity and particles could interfere with the test performance. Therefore, it is recommended to remove by centrifugation any particles due to protein denaturation. Due to technical reasons related to the production and/or ageing of samples, the results obtained with control plasma and with plasma for inter-laboratories quality control, could differ depending on the methods employed. Therefore, it could be necessary to assess the results obtained by referring to specific values for the different methods adopted. M364 - Rev.2 Gennaio 2009 RADIM SpA - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: 0039/06/ Fax: 0039/06/ ; National Order Entry: 0039/06/ ; Export Dept.: 0039/06/ ; Customer Care: 0039/06/ ; 8