PSA FREE EIA REF KMT11IW 96. Italiano p. 3 English p. 17. M342 Rev /2008

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1 Z 0123 PSA FREE EIA REF KMT11IW 96 Italiano p. 3 English p. 17 M342 Rev /2008

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. MTP 12 x 8 Pronti per l'uso, Ready for use WASH 1 x 50 ml Conc. CAL 6 x 0.75 ml Pronti per l'uso, Ready for use CTR 2 x 0.75 ml Pronti per l'uso, Ready for use BIO 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use CONJ 1 x 0.75 ml Conc. TMB SUBS 2 x 12 ml Pronto per l'uso, Ready for use STOP 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M342 Rev /2008 Pag. 2/32

3 PSA FREE EIA Istruzioni per l uso Kit per dosaggio immunoenzimatico USO Il Kit PSA FREE EIA è utilizzato per la determinazione quantitativa del PSA Free (Antigene Prostatico Specifico Libero) nel siero umano. SOMMARIO E SPIEGAZIONE DEL METODO Il PSA è una serin-proteasi glicoproteica a catena singola di 32 kda prodotta dall epitelio secretorio della ghiandola prostatica e con una specificità simile a quella della chimotripsina (1). Normalmente il PSA viene secreto nel liquido seminale e svolge un ruolo funzionale nella scissione delle proteine della vescicola seminale e nella liquefazione del coagulo seminale (2). Il flusso sanguigno in condizioni di normalità è caratterizzato da bassi valori di PSA e un incremento della sua concentrazione sierica può essere indice di patologie prostatiche quali l iperplasia prostatica benigna (BPH) e il cancro alla prostata. La determinazione del PSA è ampiamente utilizzata nella diagnosi e nel trattamento dei pazienti affetti da cancro della prostata per il quale rappresenta il maggior marker sierologico (3). E stato dimostrato che il PSA forma complessi stabili con varie antiproteasi e il principale dominio del PSA nel siero appare in forma complessata con la α 1 -antichimotripsina (PSA-ACT) (4). Tra individui differenti esistono tuttavia ampie variazioni nel rapporto tra il PSA libero e il complesso PSA-ACT. Alcuni studi hanno anche evidenziato che la concentrazione di PSA libero è maggiore nelle forme di patologia benigna rispetto al cancro della prostata (4,5). Il kit PSA FREE EIA è un dosaggio per la determinazione specifica del PSA Free senza cross-reazioni con il complesso PSA-ACT (6). PRINCIPIO DEL TEST Il kit PSA FREE EIA è un dosaggio immunologico non competitivo in fase solida basato sulla tecnica sandwich diretta. I calibratori, i sieri di controllo e i campioni dei pazienti vengono incubati insieme ad un anticorpo monoclonale anti-psa Free biotinilato e ad un anticorpo monoclonale anti-psa marcato con perossidasi di rafano (HRP) in pozzetti sensibilizzati con streptavidina. Dopo il lavaggio viene aggiunto ad ogni pozzetto il reagente substrato/cromogeno (perossido di idrogeno e 3, 3', 5, 5' tetrametilbenzidina), avviando così la reazione enzimatica. Durante la reazione enzimatica la presenza dell antigene è evidenziata dallo sviluppo di una colorazione blu. L intensità del colore è proporzionale alla quantità di PSA Free presente nei campioni. L intensità del colore viene misurata con uno spettrofotometro per micropiastre a 450 nm. Per ogni dosaggio viene quindi tracciata la curva di calibrazione riportando per ciascun calibratore il valore dell assorbanza in funzione della rispettiva concentrazione. Le concentrazioni di PSA Free dei campioni dei pazienti vengono lette sulla curva di calibrazione. M342 Rev /2008 Pag. 3/32

4 REAGENTI Ogni kit PSA FREE EIA contiene reagenti per 96 test. La data di scadenza del kit è indicata sull etichetta posta all esterno della scatola del kit. Non usare il kit oltre la data di scadenza. Non mescolare reagenti provenienti da kit di lotti differenti. Conservare il kit a 2-8 C. Non congelare il kit. I reagenti aperti rimangono stabili, in accordo a quanto riportato nella tabella seguente, a condizione che non vengano contaminati e che vengano custoditi nei contenitori originali sigillati e trattati secondo i termini stabiliti. Dopo l uso riportare immediatamente a 2-8 C. Componente Quantità Conservazione e stabilità dopo la prima apertura MTP Micropiastra 1 Piastra a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sulla piastra 12 x 8 pozzetti separabili sensibilizzati con streptavidina. Dopo l apertura, le strip non utilizzate dovranno essere rimesse immediatamente nella custodia di alluminio contenente l essiccante. Richiudere ermeticamente e tenere all asciutto. CAL Calibratori PSA Free 6 flaconi a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sui flaconi CAL 0 0 µg/l 1 x 0.75 ml CAL µg/l 1 x 0.75 ml CAL 2 1 µg/l 1 x 0.75 ml CAL 3 2 µg/l 1 x 0.75 ml CAL 4 5 µg/l 1 x 0.75 ml CAL 5 10 µg/l 1 x 0.75 ml PSA Free umano in tampone salino Tris-HCI contenente sieroalbumina bovina, un colorante giallo inerte e metil-isotiazolone (MIT) come conservante (0.01%). Pronto per l uso. CTR Siero di Controllo 2 flaconi a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sui flaconi Siero di Controllo 1 1 x 0.75 ml Siero di Controllo 2 1 x 0.75 ml PSA Free umano in tampone salino Tris-HCI contenente sieroalbumina bovina e metilisotiazolone (MIT) come conservante (0.01%). Pronto per l uso. M342 Rev /2008 Pag. 4/32

5 BIO Anti-PSA Free Biotina 1x15 ml a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sul flacone Anticorpo monoclonale di topo biotinilato anti-psa Free ad una concentrazione di circa 1.5 µg/ml. Contiene una tampone salino fosfato (ph 7.2), sieroalbumina bovina, immunoglobulina bovina, agenti bloccanti, Tween 20, un colorante blu inerte e metilisotiazolone (MIT) come conservante (0.01%). Pronto per l uso. CONJ Coniugato enzimatico, 1x 0.75 ml a 2-8 C fino alla data di Anti-PSA Free HRP scadenza indicata sul flacone Soluzione concentrata di anticorpi monoclonali di topo anti-psa coniugati con HRP, ad una concentrazione di circa 20 µg/ml. Contiene conservanti. Da mescolare con anti-psa Free Biotina prima dell uso. TMB SUBS TMB- Substrato 2 x 12 ml 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sul flacone Contiene perossido di idrogeno e 3, 3', 5, 5' di tetrametilbenzidina (TMB). Pronto per l uso. STOP Reagente Bloccante 1x15 ml 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sul flacone Contiene acido cloridrico (0.12 M). Pronto per l uso. WASH Soluzione di lavaggio 1 x 50 ml 2-8 C fino alla data di (concentrata) scadenza indicata sul flacone Tampone salino Tris-HCI e Tween 20. Contiene Germall II come conservante. Da diluire con acqua 1:25 prima dell uso. Indicazioni di instabilità Il TMB-Substrato dovrebbe apparire incolore oppure leggermente bluastro. Il colore bluastro indica una contaminazione del reagente che dovrebbe pertanto essere scartato. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: M342 Rev /2008 Pag. 5/32

6 Non mescolare reagenti di lotti differenti, se non espressamente indicato. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Accertarsi che tutta la strumentazione usata (vetreria, stufa termostatata, agitatore e lavatore di piastre, spettrofotometro, frigoriferi usati per la conservazione dei kit e dei campioni) sia perfettamente funzionante, adeguatamente calibrata e sia soggetta ad un regolare piano di manutenzione. Un uso non accurato di ognuno di questi strumenti può produrre errori metodologici che possono condizionare la riproducibilità e l affidabilità dei risultati ottenuti. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. M342 Rev /2008 Pag. 6/32

7 Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare la formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI l kit PSA FREE EIA deve essere utilizzato su siero. Raccogliere il sangue mediante prelievo venoso e separare il siero secondo le comuni procedure. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 24 ore e a -20 C per 12 mesi. Per periodi più lunghi conservare i campioni a -70 C o a temperature inferiori. I campioni non devono essere conservati in un frigorifero provvisto di un sistema di auto-scongelamento. Lasciare che i campioni si scongelino lentamente ad una temperatura di 2-8 C durante la notte e successivamente portare i campioni a temperatura ambiente prima del dosaggio. In seguito ad interventi effettuati sulla prostata è possibile osservare livelli elevati di PSA Free. Si raccomanda pertanto di effettuare il prelievo di sangue prima di eseguire l esplorazione rettale della prostata. Dopo la manipolazione chirurgica della prostata, come nell ago-biopsia o nella resezione transuretrale, si raccomanda di attendere almeno 6 settimane prima di eseguire il prelievo per il test del PSA Free (7). E stato dimostrato che il trattamento con Finasteride dell ipertrofia prostatica benigna (BPH) determina un abbassamento dei livelli di PSA Free (7). PROCEDIMENTO OPERATIVO* Materiali necessari ma non forniti Dosaggio Manuale 1. Agitatore per micropiastre Con agitazione regolabile da media a forte. Agitazione longitudinale di circa 200 giri/min, oscillazioni/min. 2. Lavatore per micropiastre Lavatore automatico per micropiastre in grado di eseguire da 1 a 6 cicli di lavaggio, oppure un dispositivo di lavaggio per micropiastre semiautomatico collegato ad una pompa da vuoto e a un sifone che trattenga il liquido aspirato. M342 Rev /2008 Pag. 7/32

8 3. Spettrofotometro per micropiastre Operante ad una lunghezza d onda di 450 nm in un intervallo di assorbanza compreso tra 0 a 3,0. 4. Pipette di precisione Con puntali di plastica intercambiabili per la dispensazione di volumi dell ordine dei microlitri e dei millilitri. E utile, ma non essenziale, una pipetta a 8 canali o un dispensatore con puntali di plastica usa e getta per la dispensazione di 100 ul. 5. Acqua distillata o deionizzata Per la preparazione della Soluzione di lavaggio. Dosaggio Automatico - Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. - Si garantisce l'applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC. - Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell'utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Note Operative 1 - La piena comprensione delle presenti istruzioni per l uso risulta necessaria al fine di assicurare un uso adeguato del kit PSA FREE EIA. I reagenti forniti unitamente al kit si possono utilizzare per 96 test. Non mescolare gli stessi reagenti provenienti da kit con numeri di lotto differenti. Non usare i reagenti del kit oltre la data di scadenza riportata all'esterno della confezione. 2 - I reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 C) prima del loro utilizzo. Il dosaggio deve essere effettuato soltanto in un intervallo di temperatura compreso tra C al fine di ottenere dei risultati accurati. I campioni congelati devono essere miscelati con cura dopo lo scongelamento. 3 - Prima della dispensazione dei calibratori, controlli e campioni dei pazienti si consiglia di contrassegnare le strip al fine di identificare con chiarezza i campioni durante e al termine del dosaggio. 4 - E essenziale lavare accuratamente le strip. Assicurarsi che ogni pozzetto sia riempito fino al limite superiore, che l'aspirazione del liquido dai pozzetti tra i vari cicli di lavaggio e alla fine di essi sia completa e che i pozzetti siano vuoti. In caso permangano residui della soluzione di lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettarla sulla carta assorbente. Lavatore automatico: fare riferimento alle istruzioni del produttore per la manutenzione ed effettuare il numero di cicli di lavaggio necessari prima e dopo ciascuna incubazione. Il dispositivo di lavaggio/aspirazione contenente la Soluzione di Lavaggio non dovrebbe essere lasciato inattivo per lunghi periodi, poiché gli aghi potrebbero ostruirsi determinando cosi una scarsa dispensazione ed aspirazione del liquido. 5 - Il TMB-Substrato è molto sensibile alla contaminazione. Per una stabilità ottimale del TMB-Substrato versare la quantità necessaria dal flacone originale in un altro M342 Rev /2008 Pag. 8/32

9 flacone perfettamente pulito o, preferibilmente, in una provetta in plastica per evitare contaminazioni del reagente. Per le singole pipette utilizzare puntali in plastica intercambiabili e puliti. 6 - Per ogni pipetta utilizzare puntali monouso in plastica puliti ed assicurarsi di impiegare una tecnica di dispensazione corretta nel caso di campioni e reagenti. Evitare il carry-over tenendo l'estremità del puntale della pipetta leggermente al di sopra del bordo del pozzetto ed evitare di toccare la strip in plastica oppure la superficie del liquido. Un appropriata tecnica di dispensazione riveste particolare importanza quando si usa la soluzione TMB- Substrato. Preparazione dei reagenti Soluzione di lavaggio Stabilità del reagente dopo preparazione 2 settimane a 2-25 C in un contenitore sigillato Versare 50 ml di Soluzione di Lavaggio in un contenitore pulito e diluire 1:25 aggiungendo 1200 ml di acqua distillata o deionizzata per ottenere una soluzione di lavaggio tamponata. Coniugato enzimatico 3 settimane a 2-8 C Preparare la quantità necessaria di Coniugato enzimatico mescolando 50 µl di Coniugato enzimatico concentrato, Anti-PSA Free-HRP, con 1 ml di Anti-PSA Free Biotina per strip (fare riferimento alla tabella sottostante e al procedimento operativo). N Strip Coniugato Anti-PSA Free -HRP Anti- PSA Free Biotina (µl) (ml) M342 Rev /2008 Pag. 9/32

10 Per la preparazione del Coniugato enzimatico usare una bottiglia di vetro o di plastica pulita. Alternativa: versare il contenuto del Coniugato, Anti-PSA Free-HRP, nel flacone di Anti-PSA Free biotina e mescolare delicatamente. Assicurarsi che tutto il Coniugato sia stato versato nel flacone della Biotina anti-psa Free. NOTA: La Soluzione di coniugato preparata rimane stabile per 3 settimane a 2-8 C. Non preparare una quantità di Coniugato superiore a quella da utilizzarsi entro questo periodo ed assicurarsi che venga conservata in modo appropriato. PROCEDURA DI DOSAGGIO* Eseguire ogni dosaggio in duplicato per i calibratori, i sieri di controllo e i campioni di pazienti. Eseguire una curva di calibrazione per ogni dosaggio. Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 C) prima dell uso. 1. Iniziare con la preparazione della Soluzione di lavaggio e del Coniugato enzimatico. È importante usare contenitori puliti. Attenersi scrupolosamente alle istruzioni. 2. Trasferire il numero necessario di strip su un supporto per micropiastre. Riporre immediatamente le strip rimanenti nella custodia di alluminio contenente l essiccante e richiudere con cura. Lavare ogni strip una volta con la Soluzione di lavaggio. Non lavare un numero di strip superiore a quelle che potranno essere utilizzate entro 30 minuti. 3. Dispensare 50 µl di ogni Calibratore, Siero di controllo (CTR1, CTR2) e campione nei rispettivi pozzetti, secondo lo schema sotto riportato: ecc. A Cal 0 Cal 4 Camp. 1 B Cal 0 Cal 4 Camp. 1 C Cal 1 Cal 5 Camp. 2 D Cal 1 Cal 5 Camp. 2 E Cal 2 CTR1 Ecc. F Cal 2 CTR1 G Cal 3 CTR2 H Cal 3 CTR2 4. Aggiungere 100 µl di Coniugato in ogni pozzetto usando una pipetta di precisione da 100 µl (o una pipetta di precisione a 8 canali da 100 µl). Per evitare effetti di trascinamento tenere la punta della pipetta appena al di sopra della parte superiore del pozzetto ed evitare di toccare la strip in plastica o la superficie del liquido. 5. Incubare le strip per 1 ora (± 10 min) a temperatura ambiente (20-25 C) in agitazione costante, utilizzando un agitatore per micropiastre. 6. Lavare ogni strip per 6 volte seguendo la procedura di lavaggio descritta al punto 4 delle Note Operative. 7. Aggiungere 100 µl di TMB-Substrato in ogni pozzetto secondo la procedura di dispensazione descritta al punto 4. Il TMB-Substrato deve essere dispensato nei M342 Rev /2008 Pag. 10/32

11 pozzetti il più velocemente possibile, senza che intercorrano più di 5 minuti tra la dispensazione nel primo e nell ultimo pozzetto. 8. Incubare per 30 minuti (± 5 min) a temperatura ambiente, con agitazione costante. Evitare l esposizione diretta alla luce solare. 9. Aggiungere 100 µl di Reagente Bloccante. Miscelare e leggere l assorbanza a 450 nm in uno spettrofotometro per micropiastre entro 15 minuti dalla dispensazione del Reagente Bloccante. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 32 Range di dosaggio Il kit PSA FREE EIA permette la determinazione di concentrazioni comprese nell intervallo tra 0.03 e 10 µg/l. Nel caso in cui siano attese concentrazioni di PSA Free al di sopra dell intervallo di dosaggio, si raccomanda di diluire i campioni con siero umano maschile normale prima di eseguire il test. NOTA: Il siero usato per la diluizione deve essere dosato al fine di determinare il PSA Free endogeno (vedere "Calcolo dei risultati "). Controllo di Qualità I Sieri di Controllo 1 e 2 possono essere impiegati per la validazione dei dosaggi. Il range dei risultati attesi viene indicato sulle etichette dei flaconi. Nel caso vengano ottenuti valori al di fuori dei range specificati, si dovrebbe effettuare un controllo completo dei reagenti, delle performance del lettore e si dovrebbe ripetere il dosaggio. Ogni laboratorio può inoltre preparare i propri pool di sieri a diversi livelli di concentrazione, che possono essere impiegati come controlli interni al fine di assicurare la precisione del dosaggio. Materiale di riferimento Come Standard di riferimento può essere utilizzato il Primo Standard Internazionale 96/668. I valori assegnati ai Calibratori e ai Sieri di Controllo sono stati ottenuti su Standard di riferimento interni i cui valori sono sovrapponibili al Primo Standard Internazionale. CALCOLO DEI RISULTATI* Nel caso venga impiegato uno spettrofotometro per micropiastre che utilizzi un programma di calcolo dati integrato, fare riferimento al manuale d uso dello spettrofotometro e creare un programma usando la concentrazione indicata sull'etichetta di ogni calibratore. M342 Rev /2008 Pag. 11/32

12 Per il calcolo automatico dei risultati del kit PSA Free EIA si consiglia di impiegare uno dei seguenti metodi: Curva spline-cubica. Il calibratore 0 dovrebbe essere incluso nella curva con il valore di 0 µg/l. Curva spline-smoothed. Il calibratore 0 dovrebbe essere utilizzato in qualità di bianco della micropiastra. Interpolazione punto-punto. Il calibratore 0 dovrebbe essere incluso nella curva con il valore di 0 µg/l Curva quadratica. Il calibratore 0 dovrebbe essere incluso nella curva con il valore di 0 µg/l. NOTA: Non si dovrebbe impiegare alcuna regressione 4-parametrica o lineare * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l ampliamento del range di lettura. Per una valutazione manuale dei risultati, disegnare una curva di calibrazione riportando sul grafico i valori di assorbanza (A) ottenuti per ogni calibratore rispetto alla corrispondente concentrazione di PSA Free (in µg/l). Vedere la figura sotto riportata. Le concentrazioni di PSA Free non note possono essere quindi lette interpolando sulla curva di calibrazione il valore medio di assorbanza relativa a ciascun campione. Esempio dei risultati Campione Valori del Calibratore Valore medio di assorbanza (A) CAL 0 0 µg/l CAL µg/l CAL 2 1 µg/l CAL 3 2 µg/l CAL 4 5 µg/l CAL 5 10 µg/l PSA Free (µg/l) Campione A Campione B M342 Rev /2008 Pag. 12/32

13 PSA Free μg/l Nota: La curva sopra riportata costituisce un esempio. Non impiegare questa curva o la tabella soprastante per determinare i risultati del dosaggio. Calcolo dei risultati con campioni diluiti Se in un primo dosaggio alcuni campioni forniscono livelli di PSA Free superiori ai 10 µg/l, i campioni dovrebbero essere diluiti 1/10 con un siero umano maschile normale e testati nuovamente fino ad ottenere una concentrazione di PSA Free corretta. Nota: Il siero usato per la diluizione deve essere dosato al fine di determinare il PSA Free endogeno. La concentrazione di PSA Free del campione non diluito si calcola nel modo seguente: Diluizione 1/10: 10 x ([PSA Free] Campione diluito - (0.9 x [PSA Free] Siero maschile normale )) LIMITI DELLA PROCEDURA Il livello di PSA Free non può essere impiegato come marker assoluto della presenza o assenza di una patologia maligna. I risultati del test dovrebbero essere interpretati solo unitamente ad altre indagini e procedure per la diagnosi della malattia e per il trattamento dei pazienti. Il dosaggio del PSA Free non dovrebbe sostituire nessun esame clinico prescritto. I calibratori del kit PSA FREE EIA non possono essere usati per effettuare il test di recupero del PSA Free. Per eseguire il test di recupero si consiglia di utilizzare campioni di pazienti con elevate concentrazioni di PSA Free. Anticorpi anti-reagenti (anticorpo umano anti-topo (HAMA) o anticorpi eterofili) presenti nel campione del paziente possono occasionalmente interferire con il dosaggio, anche se specifici agenti bloccanti sono inclusi nelle soluzioni tampone. VALORI ATTESI I dosaggi del PSA Free possono essere usati unitamente ad un test equimolare, quale il PSA EIA per il PSA totale, allo scopo di stabilire il rapporto del PSA Free/PSA totale. I campioni di siero di 52 uomini con iperplasia prostatica benigna (BPH) e di M342 Rev /2008 Pag. 13/32

14 77 uomini con cancro alla prostata (PCa) sono stati analizzati usando i kit PSA EIA e PSA FREE EIA: Diagnosi Rapporto PSA Free/PSA Totale Rapporto PSA Free/PSA Totale (n) Mediana Min. Max. Media (95% intervallo di confidenza) BPH (52) ( ) PCa (77) ( ) L ottimizzazione della sensibilità o della specificità del metodo determina la scelta del cut-off da utilizzare nella pratica clinica. La sensibilità (% di PCa rivelata correttamente) e la specificità (% di BPH rivelata correttamente) associate a differenti cut-off del rapporto FPSA/TPSA sono qui di seguito indicate: FPSA/TPSA cut-off Specificità clinica (BPH> cut-off) Sensibilità clinica ( PCa cut-off ) n % 95% intervallo di confidenza n % 95% intervallo di confidenza (52) (77) (52) (77) (52) (77) Si raccomanda ad ogni laboratorio di verificare l applicabilità dei valori attesi, sopra indicati, al proprio gruppo di pazienti e alle performance del dosaggio (7). CARATTERISTICHE METODOLOGICHE Andamento Dose-Risposta e profilo di precisione Di seguito sono riportati una tipica curva di calibrazione ed un profilo di precisione ottenuti con il kit PSA FREE EIA. Il profilo di precisione è stato ottenuto mediante la dispensazione casuale dei calibratori in una micropiastra, n = 8. Profilo di precisione PSA FREE EIA PSA Free µg/l M342 Rev /2008 Pag. 14/32

15 Precisione La precisione totale è stata determinata in accordo con le linee guida EP5-A (8) del NCCLS utilizzando quattro livelli di pool di siero umano congelato contenenti determinate aliquote aggiunte di PSA Free e sei diverse combinazioni di reagenti presenti nel kit PSA FREE EIA. Ogni campione è stato dispensato in maniera casuale (n=2/analisi) e dosato due volte al giorno per 20 giorni. Campione Replicati Media (µg/l) DS Intra-saggio (µg/l) CV % Intra-saggio DS Inter-saggio (µg/l) CV % Inter-Saggio PSA Free PSA Free PSA Free PSA Free Sensibilità La sensibilità del kit PSA FREE EIA è < 0.03 µg/l ed è definita come la concentrazione corrispondente alla media dei valori di assorbanza calcolata per il Calibratore Zero + 2 deviazioni standard secondo la formula: 2 x SD CAL x 0.3 µg/l OD CAL OD CAL 0 Test di Recupero Campioni di siero sono stati preparati addizionando aliquote di campioni ad elevate concentrazioni di PSA Free a campioni di siero maschile normale. Il recupero dell antigene è compreso nell intervallo del ±15% dei valori attesi. Nota: Non eseguire i test di recupero utilizzando i calibratori del kit. Effetto Gancio Non è stato osservato alcun effetto gancio in campioni con concentrazioni > 5000 µg/l. Linearità Campioni di pazienti sono stati diluiti con siero maschile normale ed analizzati. I valori ottenuti rientrano nel ±10% dei valori attesi. M342 Rev /2008 Pag. 15/32

16 Specificità Il kit PSA FREE EIA si basa sull utilizzo di due anticorpi monoclonali di topo, il PSA30 e il PSA66, diretti contro due distinti epitopi presenti sul PSA Free. Questa combinazione di anticorpi fornisce al dosaggio la specificità per il PSA FREE, mostrando una reattività crociata <1% con il complesso PSA-ACT (6). Per determinare le possibili fonti di interferenza è stata utilizzata la linea-guida EP7-P della NCCLS (9). Non si è osservata alcuna interferenza testando, alle concentrazioni indicate, le sostanze riportate di seguito. Concentrazioni senza interferenze significanti (+10%) Lipemia (Intralipid ) Bilirubina, non coniugata Emoglobina 10 mg/ml 0.4 mg/ml 5 mg/ml CORRELAZIONI Il kit PSA FREE EIA (Cod. KMT11IW) è stato correlato con il kit PSA FREE IEMA WELL (Cod. KMT9IW). Sono stati dosati 127 campioni di siero umano maschile ad una concentrazione compresa tra 0-9 µg/l e l analisi della regressione lineare dei risultati ha fornito la seguente correlazione: [PSA FREE EIA] Cod.KMT11IW = 1,02 x [ PSA FREE IEMA WELL] Cod.KMT9IW r = 0.99 GARANZIE I dati relativi alle performance del kit qui presentati sono stati ottenuti usando il procedimento operativo indicato. Qualsiasi cambiamento o modifica del procedimento non raccomandata da Radim S.p.A. può influire sui risultati, rispetto ai quali Radim S.p.A. non fornisce alcuna garanzia, sia essa espressa, implicita o legale, inclusa l implicita garanzia di commerciabilità e di idoneità all uso. LEGENDA DEI SIMBOLI: vedi p. 30 M342 Rev /2008 Pag. 16/32

17 FREE PSA EIA Instructions for use Enzyme immunometric assay kit INTENDED USE The FREE PSA EIA kit is intended for the quantitative determination of Free PSA (Prostate Specific Antigen) in human serum. SUMMARY AND EXPLANATION OF THE ASSAY PSA is a 32 kda single chain glycoprotein serine protease with a chymotrypsin like specificity produced by the secretory epithelium of the prostate gland (1). PSA is normally secreted into the seminal fluid and plays a functional role in the cleavage of the seminal vesicle proteins and the liquefaction of the seminal coagulum (2). Only low levels of PSA are normally present in the blood stream, and increasing serum concentrations indicate prostatic pathology, including benign prostatic hyperplasia and cancer of the prostate. Determination of PSA is now widely used for detection and management of patients with prostatic cancer and considered as the superior serological marker for cancer of the prostate (3). PSA has been shown to form stable complexes with different antiproteases and the dominating portion of PSA in patient serum occurs in complex with α 1 - antichymotrypsin (PSA-ACT) (4). However there are large variations in the relation between Free PSA and PSA-ACT complex between different individuals. A number of studies have found that the proportion of Free PSA is higher in benign prostatic disease as compared to prostatic cancer (4, 5). The FREE PSA EIA is an assay for specific determination of Free PSA without cross reactivity with PSA-ACT complex (6). PRINCIPLE OF THE TEST The FREE PSA EIA is a solid-phase, non-competitive immunoassay based upon the direct sandwich technique. Calibrators, controls and patient samples are incubated together with biotinylated Anti-Free PSA monoclonal antibody and horseradish peroxidase (HRP) labeled Anti-PSA monoclonal antibody in Streptavidin coated microplate strips. After washing, buffered Substrate/Chromogen reagent (hydrogen peroxide and 3, 3', 5, 5' tetra-methylbenzidine) is added to each well and the enzyme reaction is allowed to proceed. During the enzyme reaction a blue colour will develop if antigen is present. The intensity of the colour is proportional to the amount of Free PSA present in the samples. The colour intensity is determined in a microplate spectrophotometer at 450 nm. Calibration curves are constructed for each assay by plotting absorbance value versus the concentration for each calibrator. The Free PSA concentration of patients samples are then read from the calibration curve. M342 Rev /2008 Pag. 17/32

18 REAGENTS Each FREE PSA EIA kit contains reagents for 96 tests. The expiry date of the kit is stated on the label on the outside of the kit box. Do not use the kit beyond the expiry date. Do not mix reagents from different kit lots. Store the kit at 2-8 C. Do not freeze. Opened reagents are stable according to the table below provided they are not contaminated, stored in resealed original containers and handled as prescribed. Return to 2-8 C immediately after use. Component Quantity Storage and stability after first opening MTP Microplate 1 Plate 2-8 C until expiry date stated on the plate 12 x 8 breakable wells coated with Streptavidin. After opening, immediately return unused strips to the aluminium pouch, containing desiccant. Reseal carefully to keep dry. CAL Free PSA Calibrators 6 vials 2-8 C until expiry date stated on the vials CAL 0 0 μg/l 1 x 0.75 ml CAL μg/l 1 x 0.75 ml CAL 2 1 μg/l 1 x 0.75 ml CAL 3 2 μg/l 1 x 0.75 ml CAL 4 5 μg/l 1 x 0.75 ml CAL 5 10 μg/l 1 x 0.75 ml Human Free PSA in a Tris-HCl buffered salt solution containing bovine serum albumin, an inert yellow dye and 0.01% methyl-isothiazolone (MIT) as preservative. Ready for use. CTR Control Serum 2 vials 2 8 C until expiry date stated on the vials Control Serum 1 1 x 0.75 ml Control Serum 2 1 x 0.75 ml Human Free PSA in a Tris-HCl buffered salt solution containing bovine serum albumin and 0.01% methylisothiazolone (MIT) as preservative. Ready for use. M342 Rev /2008 Pag. 18/32

19 BIO Biotin Anti-Free PSA 1 x 15 ml 2-8 C until expiry date stated on the vial Biotin Anti-Free PSA monoclonal antibody from mouse, approximately 1.5 µg/ml. Contains Phosphate buffered saline (ph 7.2), bovine serum albumin, bovine immunoglobulin, blocking agents, Tween 20, an inert blue dye and 0.01% methylisothiazolone (MIT) as preservative. Ready for use. CONJ Enzyme Conjugate 1 x 0.75 ml 2-8 C until expiry HRP Anti-Free PSA date stated on the vial Stock solution of HRP Anti-PSA monoclonal antibody from mouse, approximately 20 µg/ml. Contains preservatives. To be mixed with Biotin Anti-Free PSA prior to use. TMB SUBS TMB Substrate 2 x 12 ml 2-8 C until expiry date stated on the vial Contains buffered hydrogen peroxide and 3, 3, 5, 5 tetramethyl-benzidine (TMB). Ready for use. STOP Blocking Reagent 1 x 15 ml 2-8 C until expiry date stated on the vial Contains 0.12 M hydrochloric acid. Ready for use. WASH Washing Solution 1 x 50 ml 2-8 C until expiry (concentrate) date stated on the vial A Tris-HCl buffered salt solution with Tween 20. Contains Germall II as preservative. To be diluted with water 25 times before use. Indications of instability The TMB HRP-Substrate should be colourless or slightly bluish. A blue colour indicates that the reagent has been contaminated and should be discarded. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix reagents of different lots, if not otherwise indicated. Do not use reagents beyond their expiry date. M342 Rev /2008 Pag. 19/32

20 Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect: exact incubation times and quantities adding the reagents incubation times and temperature may cause incorrect clinical results. In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that all the equipment used (glassware, incubators, plate shakers, plate washers, spectrophotometers and fridge/freezers used for reagent and sample storage) is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Any deviation from the correct use of the equipment listed can produce errors in the methodology, this may affect the reproducibility and reliability of results obtained. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous M342 Rev /2008 Pag. 20/32

21 special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING FREE PSA EIA is intended for use with serum. Collect blood by venipuncture and separate the serum according to common procedures. Samples can be stored at 2-8 C for 24 hours and at -20 C for 12 months. For longer periods store samples at - 70 C or below. Samples should not be stored in a self-defrosting freezer. Allow frozen samples to thaw slowly, preferably at 2-8 C over night and then bring the samples to room temperature before analysis. Elevated levels of Free PSA may be expected following manipulation of the prostate. It is therefore recommended that blood be drawn before digital rectal examination. Following surgical manipulation of the prostate, such as needle biopsy or transurethral resection it is recommended to wait than 6 weeks before drawing blood for Free PSA testing (7). It should be taken into account that Finasteride treatment of BPH have been shown to decrease Free PSA levels (7). PROCEDURE Materials required but not supplied with the kit Manual Test 1. Microplate shaker Shaking should be medium to vigorous. Longitudinal shaking approximately 200 strokes/min, oscillations /min. 2. Microplate wash device Automatic platewash capable of performing 1 and 6 washing cycles, or a semi manual microplate washing device connected to vacuum pump or water-jet vacuum and a liquid trap for retaining aspirated liquid. 3. Microplate spectrophotometer With a wavelength of 450 nm and an absorbance range of 0 to Precision pipettes With disposable plastic tips for dispensing microlitre and millilitre volumes. An 8-channel pipette or respenser pipette with disposable plastic tips for delivery of 100 µl is useful but not essential. 5. Distilled or deionized water For preparation of Wash Solution. Automatic Test This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. M342 Rev /2008 Pag. 21/32

22 Procedural notes 1. A thorough understanding of this package insert is necessary to ensure proper use of the FREE PSA EIA kit. The reagents supplied with the kit are intended for use as an integral unit. Do not mix identical reagents from kits having different lot numbers. Do not use the kit reagents after the expiry date printed on the outside of the kit box. 2. Reagents should be allowed to reach room temperature (20-25 C) prior to use. The assay should only be performed at temperatures between C to obtain accurate results. Frozen specimens should be brought to room temperature slowly and must be gently but thoroughly mixed after thawing. 3. Before starting to pipette calibrators, controls and patient specimens it is advisable to mark the strips to be able to clearly identify the samples during and after the assay. 4. A careful washing procedure of the strips is essential. Ensure that each well is filled up completely to the top edge and that the aspiration of the wells between and after the washing cycles is complete and the wells are dry. If there is liquid left in the wells, invert the plate and tap it carefully against absorbing paper. Automatic strip washer: Follow the manufacturer s instructions for maintenance and perform the required number of wash cycles prior to and after each incubation step. The aspiration/wash device should not be left standing with the Wash Solution for long periods as the needles may get clogged, giving poor liquid delivery and suction. 5. The TMB-Substrate is very sensitive for contamination. For optimal stability of the TMB-Substrate, pour the required amount from the vial to a carefully cleaned vial or preferably a disposable plastic tube to avoid contamination of the reagent. Be sure to use clean disposable plastic pipette tips (or respenser pipette tip). 6. Be sure to use clean disposable plastic pipette tips and a proper pipetting technique when handling samples and reagents. Avoid carry-over by holding the pipette tip slightly above the top of the well and avoid touching the plastic strip or surface of the liquid. A proper pipetting technique is of particular importance when handling the TMB HRP-Substrate solution. Preparation of reagents Washing Solution Stability of prepared reagent 2 weeks at 2 25 C in a sealed container Pour the 50 ml Wash Concentrate into a clean container and dilute 25- fold by adding 1200 ml of distilled or deionized water to give a buffered Wash Solution. M342 Rev /2008 Pag. 22/32

23 Conjugate working solution 3 weeks at 2 8 C Prepare the required quantity of Conjugate working solution by mixing 50 µl of Conjugate, HRP-Anti Free PSA, with 1 ml of Biotin Anti-Free PSA per strip (see table below and the Protocol Sheet). No. of Conjugate, HRP Anti-PSA Free Biotin Anti-PSA Free Strips (µl) (ml) Be sure to use a clean plastic or glass bottle for preparation of the Antibody Solution. Alternative: Pour the content of the Conjugate, HRP Anti-Free PSA into the vial of Biotin Anti-Free PSA and mix gently. Make sure that all of the Conjugate is transferred to the vial of Biotin Anti-Free PSA. NOTE: The Conjugate working solution is stable for 3 weeks at 2 8 C. Do not prepare more Conjugate working solution than will be used within this period and make sure that it is stored properly. ASSAY PROCEDURE* Perform each determination in duplicate for calibrators, controls and patient samples. A calibration curve should be run with each assay. All reagents and samples must be brought to room temperature (20 25 C) before use. 1. Start to prepare Wash Solution and Conjugate working solution. It is important to use clean containers. Follow the instructions carefully. 2. Transfer the required number of microplate strips to a strip frame. (Immediately return the remaining strips to the aluminium pouch containing a desiccant and reseal carefully). Wash each strip once with the Wash Solution. Do not wash more strips than can be handled within 30 min. 3. Pipette 50 µl of each Free PSA Calibrators, controls (CTR1, CTR2) and patient samples (unknowns) into the strip wells according to the following scheme: M342 Rev /2008 Pag. 23/32

24 etc. A Cal 0 Cal 4 Unk 1 B Cal 0 Cal 4 Unk 1 C Cal 1 Cal 5 Unk 2 D Cal 1 Cal 5 Unk 2 E Cal 2 CTR1 Etc. F Cal 2 CTR1 G Cal 3 CTR2 H Cal 3 CTR2 4. Add 100 µl of Conjugate working solution to each well using a 100 µl precision pipette (or an 8-channel 100 µl precision pipette). Avoid carry-over by holding the pipette tip slightly above the top of the well and avoid touching the plastic strip or the surface of the liquid. 5. Incubate the frame containing the strips for 1 hour (± 10 min) at room temperature (20-25 C) with constant shaking of the plate using a microplate shaker. 6. Wash each strip 6 times, using the wash procedure described in Procedural notes item Add 100 µl of TMB-Substrate to each well using the same pipetting procedure as in item 4. The TMB-Substrate should be added to the wells as quickly as possible and the time between the addition to the first and last well should not exceed 5 min. 8. Incubate for 30 min (± 5 min) at room temperature with constant shaking. Avoid direct sunlight. 9. Add 100 µl of blocking reagent. Mix and read the absorbance at 450 nm in a microplate spectrophotometer within 15 minutes after addition of blocking reagent. * While using for the procedure a Radim and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. ASSAY SCHEME: see p. 32 Measurement range The FREE PSA EIA measures concentrations between 0.03 and 10 µg/l. If Free PSA concentrations above the measuring range are to be expected, it is recommended to dilute samples with normal human male serum prior to analysis. NOTE: The serum used for dilution should also be measured in order to determine the endogenous Free PSA concentration (see Calculation of results ). M342 Rev /2008 Pag. 24/32

25 Quality control FREE PSA Control 1 and 2 may be used for validation of the assay series. Ranges of expected results are indicated on the vial labels. If values outside of the specified range are obtained, a complete check of reagents and reader performance should be made and the analysis repeated. Each laboratory may in addition prepare its own serum pools at different levels, which can be used as internal controls in order to assure the precision of the assay. Reference material The 1 st International Standard 96/668 may be used as a reference standard. Values for FREE PSA Calibrators and Controls were assigned against a set of inhouse reference standards whose values are traceable to the 1 st International Standard. CALCULATION OF RESULTS* If a microplate spectrophotometer reader with built-in data calculation program is used refer to the manual for the plate reader and create a program using the concentration stated on the labels of each of the FREE PSA Calibrators. For automatic calculation of Free PSA results it is recommended to use either of the following methods: Cubic spline curve fit method. Calibrator 0 should be included in the curve with the value 0 µg/l. Spline smoothed curve fit method. Calibrator 0 should be used as plate blank. Interpolation with point-to-point evaluation. Calibrator 0 should be included in the curve with the value 0 µg/l. Quadratic curve fit method. Calibrator 0 should be included in the curve with the value 0 µg/l. NOTE: 4-parametric or linear regression should not be used. * While using a Radim and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. For manual evaluation, a calibration curve is constructed by plotting the absorbance (A) values obtained for each Free PSA calibrator against the corresponding Free PSA concentration (in µg/l), see figure below. The unknown Free PSA concentrations can then be read from the calibration curve using the mean absorbance value of each patient specimen. M342 Rev /2008 Pag. 25/32

26 Example of results Specimen Calibrator values Mean abs value (A) CAL 0 0 µg/l CAL µg/l CAL 2 1 µg/l CAL 3 2 µg/l CAL 4 5 µg/l CAL 5 10 µg/l Free PSA (µg/l) Specimen A Specimen B PSA Free μg/l Example (do not use this curve or table above to determine actual assay results). Calculation of results with diluted samples If samples in an initial analysis give Free PSA levels higher than 10 µg/l the samples should be diluted 1/10 with normal male human serum and reanalysed to obtain the accurate Free PSA concentration. NOTE: The sample used for dilution should also be measured in order to determine the endogenous Free PSA concentration. The Free PSA concentration of the undiluted sample is calculated as: Dilution 1/10: 10 x ([Free PSA] Diluted sample - (0.9 x [Free PSA] normal male serum )) LIMITATIONS OF THE PROCEDURE The level of Free PSA alone should not be used as evidence for the presence or absence of malignant disease. The results of the test should be interpreted only in conjunction with other investigations and procedures in the diagnosis of disease and M342 Rev /2008 Pag. 26/32

27 the management of patients. The Free PSA test should not replace any established clinical examination. The calibrators of the FREE PSA EIA kit should not be used for recovery studies of Free PSA. For recovery studies it is recommended to use a highly elevated patient sample. Anti-reagent antibodies (human anti-mouse antibody (HAMA) or heterophilic antibodies) in the patient sample may occasionally interfere with the assay, even though specific blocking agents are included in the buffer. EXPECTED VALUES Free PSA measurements may be used in conjunction with an equimolar test such as PSA EIA for total PSA in order to generate the ratio of Free PSA/Total PSA. Serum specimens from 52 men objectively diagnosed with benign prostate hyperplasia (BPH) and 77 men diagnosed with prostate cancer (PCa) were analysed using PSA EIA and Free PSA EIA: Diagnosis (n) FPSA/TPSA FPSA/TPSA Median Min. Max. Mean (95% confidence interval) BPH (52) ( ) PCa (77) ( ) The choice of a cut-off to be used in clinical practice depends upon the clinical application, i.e. whether optimised sensitivity or specificity is desired. Sensitivities (% PCa correctly detected) and Specificities (% BPH correctly detected) for different FPSA/TPSA ratio cut-offs are shown below: FPSA/TPSA cut-off Clinical specificity (BPH> cut-off) Clinical sensitivity ( PCa cut-off ) n % 95% confidence interval n % 95% confidence interval (52) (77) (52) (77) (52) (77) It is recommended that each laboratory investigate the transferability of the above expected values to its own patient population and assay performance (7). PERFORMANCE CHARACTERISTICS Dose-response and precision profile A typical calibration curve and precision profile obtained with the FREE PSA EIA kit are shown below. The precision profile is based on random pipetting of calibrators into one microplate plate, n=8. M342 Rev /2008 Pag. 27/32

28 Precision profile Free PSA EIA Free PSA μg/l Precision Total precision was calculated according to NCCLS guideline EP5-A (8) using four levels of frozen pooled human serum containing added Free PSA and six different FREE PSA EIA reagent combinations. Each sample was randomly pipetted (n=2/analysis) and analysed twice each day over 20 days. Sample Replicates Mean (µg/l) Within-run SD (µg/l) Within-run CV % Between-day SD (µg/l) Between-day CV % Free PSA Free PSA Free PSA Free PSA Detection limit The detection limit of the FREE PSA EIA is < 0.03 µg/l defined as the concentration corresponding to the mean of the absorbance values of the Free PSA calibrator 0 plus 2 standard deviations according to formula: 2 x SD CAL x 0.3 μg/l OD CAL OD CAL 0 Recovery Spiked serum samples were prepared by adding aliquots of samples with highly elevated Free PSA to normal male serum samples. The recovery of the antigen was within ± 15% of the expected values. Note: Recovery studies should not be performed using the kit calibrators. M342 Rev /2008 Pag. 28/32

29 Hook effect No hook effect has been noticed with samples up to > 5000 µg/l. Linearity Patient samples were diluted with normal male human serum and analysed. The obtained values were within ± 10% of the expected values. Specificity The FREE PSA EIA is based on two mouse monoclonal antibodies, PSA30 and PSA66, directed against two distinct epitopes exposed in Free PSA. This antibody combination provides an assay specific for Free PSA showing <1% cross-reactivity to the PSA-ACT complex (6). The NCCLS guideline EP7-P (9) was followed to determine possible sources of interference. The following substances and concentrations were tested and found not to interfere with the test. Lipemia (Intralipid ) 10 mg/ml Bilirubin, unconjugated 0.4 mg/ml Hemoglobin 5 mg/ml Concentration with no significant (± 10%) interference Method comparison The FREE PSA EIA (Code KMT11IW) was compared to the FREE PSA IEMA WELL (Code KMT9IW). One hundred twenty-seven male human serum samples ranging in values from 0 9 µg/l were measured and linear regression analyses of the results yielded: [Free PSA EIA] Code KMT11IW =1.02 x[free PSA IEMA WELL] Code KMT9IW r =0.99 WARRANTY The performance data presented here were obtained using the assay procedure indicated. Any change or modification of the procedure not recommended by Radim S.p.A. may affect the results, in which Radim S.p.A. disclaims all warranties expressed, implied or statutory including the implied warranty of merchantability and fitness for use. SYMBOLS LEGEND: see p. 30 M342 Rev /2008 Pag. 29/32

30 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF LOT codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN- VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/7/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE- Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití 96 Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M342 Rev /2008 Pag. 30/32

31 BIBLIOGRAFIA REFERENCES 1. Wang MC, Valenzuela LA, Murphy GP, Chu TM (1979). Purification of a human prostate specific antigen. Invest Urol 17: Lilja H. (1985). A kallikrein-like serine protease in prostatic fluid cleaves the predominant seminal vesicle protein. J Clin Invest 76: Haese A., Becker C., Diamandis E., and Lilja H., (2002) Adenocarcinoma of the Prostate In: Tumor Markers. Physiology, Pathobiology, Technology, and Clinical applications. Eds. Diamandis et al., AACC Press, Washington, pp Lilja H., Christensson A., Dahlén U., Matikainen M-T., Nilsson O., Pettersson K., Lövgren T. (1991). Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with α 1 -antichymotrypsin. Clin Chem 37: Christensson A., Björk T., Nilsson O., Dahlén U., Matikainen M-T., Cockett ATK, Abrahamsson PA, Lilja H. (1993). Serum prostate specific antigen complexed to α 1 -antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. J Urology 150: Nilsson O., Peter A. Andersson I., Nilsson K., Grundström B., and Karlsson B. Antigenic determinants of prostatespecific antigen (PSA) and development of assays specific for different forms of PSA. Br J Cancer 75(6): , Price C. P., Allard J., Davies G., Dawnay A., J Duffy M., France M., Mandarino G., Milford Ward A., Patel B., Sibley P. and Sturgeon C. (2001) Pre-and postanalytical factors that may influence use of serum prostate specific antigen and its isoforms in a screening programme for prostate cancer. Ann Clin Biochem; 38: National Committee for Clinical Laboratory Standards, Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices. Approved Guideline EP5-A (1999). 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards, National Evaluation Protocols for Interference Testing, Evaluation protocol Number 7, Vol. 6, No 13, August (1986). M342 Rev /2008 Pag. 31/32

32 SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Prediluizione del campione facoltativa, Optional sample predilution: 1/10 Lavare e Aspirare, Wash and Aspirate: 1 x 350 µl. Pozzetti, Wells CAL CTR Campioni, Samples Reag. CAL 50 µl CTR µl Campioni, Samples µl CONJ sol. di lavoro, working sol. 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 1h (±10 min) T.A. (20-25 C), in agitazione - Shaking Aspirare e Lavare, Aspirate and Wash: 6 x 350 µl. TMB SUBS 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 30' (±5 min) T.A. (20-25 C) in agitazione - Shaking STOP 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: 450 nm RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -