BORDETELLA PERTUSSIS IgG E.W.

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1 BORDETELLA PERTUSSIS IgG E.W. REF K15BPG 96 Italiano p. 3 English p.12 M397 Rev.1 02/2008

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. MTP 1 x 96 Pronti per l'uso, Ready for use DIL 1 x 105 ml Pronto per l'uso, Ready for use STOP 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use WASH 1 x 50 ml Conc. CONJ 1 x 20 ml Pronto per l'uso, Ready for use TMB SUBS 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use POS 1 x 2 ml Pronto per l'uso, Ready for use C/O 1 x 2 ml Pronto per l'uso, Ready for use NEG 1 x 2 ml Pronto per l'uso, Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo "The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website "Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση "In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden". "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse "Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M397 Rev.1 02/2008 Pag. 2/24

3 Test immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi della classe IgG per Bordetella pertussis nel siero o plasma umano 1. INTRODUZIONE Solo per uso diagnostico in vitro Le Bordetelle sono batteri aerobi obbligati (di circa μm di spessore ed 1 μm di lunghezza), Gram-negativi, asporigeni e capsulati. Il genere Bordetella è costituito da B. pertussis e B. parapertussis, che infettano l uomo, e da B. bronchiseptica e B. avium, che sono responsabili di infezioni enzootiche in diverse specie di animali domestici e selvatici. B. pertussis è il classico agente eziologico della pertosse, mentre la B. parapertussis è responsabile nel 5-20% dei casi di una forma più lieve e spesso asintomatica di pertosse. B. bronchiseptica solo raramente (ad es. nei casi in cui vi è uno stretto contatto con gli animali) può avere significato patogeno per l uomo come agente opportunista secondario in infezioni miste (bronchiti, polmoniti, ferite infette). La pertosse o tosse convulsa è un infezione batterica delle vie respiratorie. E una malattia dell infanzia altamente contagiosa, che raramente compare in età adulta, e che viene trasmessa attraverso l aerosol (goccioline di saliva e secrezioni nasali). B. pertussis ha la capacità di aderire all epitelio ciliato dell apparato respiratorio. Frammenti della parete cellulare batterica (Esotossina = Citotossina tracheale, TCT) sono in grado di inibire il movimento delle cilia nella mucosa tracheale. Dopo un periodo di incubazione, che dura da una a tre settimane, la malattia si sviluppa attraverso tre stadi, descritti nella tabella sottostante. La letalità raggiunge lo 0.6% e riguarda prevalentemente i bambini nei primi sei mesi di vita (oltre il 70% dei casi), per i neonati e i bambini prematuri la percentuale è ancora più elevata (1-2%). In Africa, accanto al virus del morbillo, la B. pertussis è la principale causa dell alta mortalità infantile. La diffusione della malattia è estesa a tutto il mondo. La contrazione della malattia è seguita dall acquisizione di un immunità naturale che è di lunga durata, ma non permanente. In molti Paesi viene raccomandato un programma di vaccinazione attiva che fornisce un efficacia protettiva del 90%, lungo un periodo di tempo esteso dai tre ai dodici anni. Generalmente la preparazione immunogena viene somministrata in combinazione con il tossoide difterico e tetanico. Specie Malattia Sintomi Modalità d infezione B. pertussis Pertosse 1. Stadio catarrale: sintomi di un raffreddore con febbre lieve (1-2 settimane) 2. Stadio convulsivo: acuto, tosse spasmodica; ad una profonda inspirazione segue un colpo di tosse con lingua protrusa (2-6 settimane) 3. Stadio di convalescenza: attenuazione della malattia con sintomi di una bronchite (fino a 6 settimane) Infezione altamente contagiosa, trasmessa mediante aerosol L uomo è l unico serbatoio della B. pertussis Tempo di incubazione: 1-3 settimane M397 Rev.1 02/2008 Pag. 3/24

4 L identificazione del batterio responsabile dell infezione può essere effettuata attraverso: Microscopia: Identificazione su colture, Immunofluorescenza (IF) Sierologia: Determinazione della produzione di anticorpi mediante ELISA Una diagnosi precisa è necessaria per eseguire un adeguato trattamento dei pazienti, per l isolamento dei bambini a rischio non vaccinati e per la differenziazione della pertosse da patologie atipiche e da infezioni croniche. 2. USO PREVISTO Il Bordetella pertussis IgG E.W. è un kit per la determinazione qualitativa degli anticorpi di classe IgG specifici per Bordetella pertussis e la sua tossina nel siero o plasma (citrato) umano. 3. PRINCIPIO DEL TEST La determinazione immunoezimatica qualitativa degli anticorpi di classe IgG nei confronti della Bordetella pertussis si basa sul principio ELISA. I pozzetti della micropiastra contengono una fase solida con adesi la tossina ed antigeni della Bordetella pertussis. Anticorpi specifici presenti nel campione si legano agli antigeni immobilizzati nei pozzetti. Gli anticorpi del coniugato (anticorpi anti-igg umane con perossidasi di rafano) si legano ai complessi antigene (fase solida)-anticorpo (paziente) nei campioni positivi. Questi complessi vengono evidenziati da una colorazione blu dopo l incubazione con la soluzione TMB. L intensità di questa colorazione è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi di classe IgG specifici per la Bordetella pertussis presenti nel campione. Bloccando la reazione enzimatica con acido solforico si causa un cambiamento di colore dal blu al giallo che può essere misurato facilmente con un fotometro per micropiastre ELISA a 450 nm. 4. MATERIALI 4.1. Reagenti forniti MTP Micropiastra sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti (12x8) divisibili, con adesi la tossina ed antigeni della Bordetella pertussis; sigillata sotto vuoto, all interno di una busta d alluminio richiudibile. DIL Diluente campione IgG***: 1 flacone contenente 105 ml di tampone per diluire i campioni; ph 7.2 ± 0.2, color giallo; pronto all uso. STOP Soluzione Stop: 1 flacone contenente 15 ml di acido solforico, 0.2 mol/l, pronto all uso. WASH Tampone di Lavaggio (20x)*: 1 flacone contenente 50 ml di un tampone concentrato 20 volte per il lavaggio dei pozzetti; ph 7.2 ± 0.2. CONJ Coniugato Enzimatico**: 1 flacone contenente 20 ml di anticorpi di coniglio anti-igg umane, coniugati con perossidasi; color rosso; pronto all uso. TMB SUBS Soluzione TMB-Substrato: 1 flacone contenente 15 ml di 3,3`,5,5`- Tetrametilbenzidina (TMB); pronto all uso. POS Controllo Positivo***: 1 flacone contenente 2 ml di soluzione di controllo pronta all uso; color giallo. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 4/24

5 C/O NEG Controllo Cut-off***: 1 flacone contenente 2 ml di soluzione di controllo pronta all uso; color giallo. Controllo Negativo***: 1 flacone contenente 2 ml di soluzione di controllo pronta all uso; color giallo. * contiene: 0.2 % Kathon ** contiene: 0.2 % Bronidox L *** contiene: 0.1 % Kathon e 0.09% Sodio Azide 4.2. Accessori forniti 1 supporto per micropiastre 2 pellicole adesive 1 istruzione per l uso 1 schema per la distribuzione ed identificazione di campioni e controlli 4.3. Materiali e attrezzature necessari Dosaggio Manuale Fotometro per micropiastre con filtri da 450/620 nm Incubatore a 37 C Lavatore per micropiastre Micropipette con punte monouso (10, 100, 200, 1000 µl) Vortex-Mixer Provette monouso Supporto per provette Acqua deionizzata o distillata Timer Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l'applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC. Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori è responsabilità dell'utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta se conservati a 2-8 C. 6. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C) prima dell uso! 6.1. Micropiastra sensibilizzata I pozzetti con adesi la tossina ed antigeni della Bordetella pertussis sono separabili e sigillati sotto vuoto. I pozzetti, pronti all uso, devono essere conservati a 2-8 C. Riporre i pozzetti non utilizzati nel sacchetto con il gel essiccante di silice. Il prodotto è stabile fino alla data di scadenza indicata sull etichetta se conservato a 2-8 C. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 5/24

6 6.2. Coniugato Enzimatico Il flacone contiene 20 ml di anticorpi anti-igg umane coniugati con perossidasi di rafano, tampone, stabilizzanti, conservanti e un colorante inerte rosso. La soluzione è pronta per l uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Controlli I flaconi del Controllo Positivo, Cut-off e Controllo Negativo contengono 2 ml di soluzione pronta all uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Diluente Campione IgG Il flacone contiene 105 ml di tampone fosfato, stabilizzanti, conservanti e un colorante giallo inerte. La soluzione, pronta all uso, viene usata per diluire i campioni e deve essere conservata a 2-8 C. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Tampone di lavaggio (20x) Il flacone contiene 50 ml di un tampone concentrato, detergenti e conservanti. Una volta aperto, il tampone concentrato é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C. Diluire il contenuto con acqua deionizzata o distillata (1 + 19), es.: 10 ml di Tampone di Lavaggio ml di acqua deionizzata o distillata. Una volta diluito, il tampone é stabile 5 giorni se conservato a temperatura ambiente. Se sono presenti cristalli, scioglierli in bagnomaria a 37 C prima di diluire. Nota: Preparare solo il volume di tampone di lavaggio necessario per l esecuzione del dosaggio Soluzione TMB-Substrato Il flacone contiene 15 ml di 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno pronto all uso. Conservare al buio ad una temperatura di 2-8 C. La soluzione é incolore o celeste chiaro. Nel caso in cui diventasse blu significa che é contaminata e non puó essere piú usata. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Soluzione Stop Il flacone contiene 15 ml di acido solforico 0.2 mol/l, pronto all uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C. 7. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Usare campioni di siero o plasma (citrato) umano. Se il test viene eseguito entro 5 giorni dal prelievo i campioni devono essere conservati a 2-8 C, altrimenti devono essere aliquotati e congelati a C. Agitare bene i campioni scongelati prima di diluirli. Evitare cicli ripetuti di congelamento/ scongelamento Diluizione dei campioni Prima del test diluire i campioni con il diluente campione IgG. Per esempio, pipettare nelle provette 10 µl di campione + 1 ml di diluente e mescolare bene (Vortex). I controlli sono pronti all uso e non necessitano di diluizione. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 6/24

7 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparazione del test Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il dosaggio. Per ottenere risultati validi é indispensabile seguire esattamente le istruzioni. Per l esecuzione manuale del test seguire la procedura di seguito riportata. Stabilire innanzitutto lo schema di distribuzione ed identificazione di campioni e controlli sul foglio di lavoro fornito con il kit. Inserire i pozzetti necessari nel supporto micropiastre. Utilizzare almeno: 1 pozzetto (es. A1) per il bianco (blank) 1 pozzetto (es. B1) per il controllo negativo 2 pozzetti (es. C1+D1) per il controllo cut-off 1 pozzetto (es. E1) per il controllo positivo È consigliato effettuare il dosaggio in duplicato. Eseguire il test nell ordine stabilito dalle istruzioni, senza pause. Utilizzare puntali nuovi e puliti per ogni campione e controllo. Regolare l incubatore a 37 ± 1 C. 1. Dispensare 100 µl di ogni controllo e dei campioni diluiti nei relativi pozzetti. Usare il pozzetto A1 per il bianco. 2. Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva. 3. Incubare 1 ora ± 5 min a 37 ± 1 C. 4. Al termine dell incubazione, togliere la pellicola ed aspirare il liquido dai pozzetti. Successivamente lavare i pozzetti tre volte con 300 µl di tampone di lavaggio. Evitare che la soluzione trabocchi dai pozzetti. L intervallo tra il lavaggio e l aspirazione deve essere almeno di 5 sec. Dopo il lavaggio picchiettare delicatamente i pozzetti con l apertura verso il basso su una carta assorbente per togliere completamente il liquido. Attenzione: Il lavaggio é una fase critica. Un lavaggio non accurato determina una cattiva precisione del test ed un innalzamento falsato delle densità ottiche. 5. Dispensare 100µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti, escludendo quello con il bianco (Blank). Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva. 6. Incubare 30 min a temperatura ambiente ( C). Non esporre a fonti di luce diretta. 7. Ripetere il lavaggio come indicato al punto Dispensare 100µl di Soluzione TMB-substrato in tutti i pozzetti. 9. Incubare precisamente per 15 min a temperatura ambiente ( C) al buio. 10. Dispensare 100µl di Soluzione Stop in tutti i pozzetti, mantenendo lo stesso ordine e lo stesso tempo di dispensazione utilizzato per la soluzione TMB. Durante l incubazione il colore cambia dal blu al giallo. Attenzione: Campioni con un risultato altamente positivo possono causare precipitati scuri del cromogeno! Questi precipitati influenzano la lettura della densità ottica. È consigliato diluire i campioni con soluzione fisiologica NaCl, esempio 1+1. Poi diluire normalmente con il diluente campione IgG. Il risultato in UR viene moltiplicato per due. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 7/24

8 11. Misurare l assorbanza di tutti i pozzetti a 450/620 nm entro 30 min dall aggiunta della Soluzione Stop. Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM/SEAC, far riferimento al relativo manuale Misurazione Regolare il fotometro per le micropiastre (ELISA-Reader) a zero usando il Bianco (Blank) in A1. Se, per motivi tecnici, non é possibile regolare il fotometro sottrarre l assorbanza del Bianco da tutti i valori delle altre assorbanze in modo da ottenere risultati attendibili. Misurare l assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e inserire tutti i valori ottenuti nel foglio di lavoro. É raccomandato fare una misurazione delle densità ottiche a doppia lunghezza d onda utilizzando i 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile calcolare la media dei valori delle assorbanze di tutti i duplicati. Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastra RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d onda: 450, 405, 620 nm, permettendo l ampliamento del range di lettura. 9. RISULTATI 9.1. Validazione del test Il test é valido se risponde ai seguenti criteri: Bianco in A1: Valore di assorbanza inferiore a Controllo negativo in B1: Valore di assorbanza inferiore a Controllo cut-off in C1 e D1: Valore di assorbanza tra e Controllo positivo in E1: Valore di assorbanza più alto o uguale al valore del Cut-off 9.2. Calcolo dei risultati Il Cut-off è la media dei valori di assorbanza dei controlli Cut-off. Esempio: Valore di assorbanza del controllo Cut-off valore di assorbanza del controllo Cut-off 0.37 = 0.76/2= 0.38 Cut-Off = Interpretazione dei risultati I campioni con valore di assorbanza superiore al Cut-off + 10% sono da considerare Positivi. I campioni con valore di assorbanza compreso nel range del Cut-off ± 10% non sono identificabili come positivi o negativi e quindi il risultato viene considerato Dubbio. In questo caso si raccomanda di ripetere il test dopo 2 o 4 settimane con un campione fresco. Se il risultato é ancora incerto il campione viene considerato Negativo. I campioni con valore di assorbanza inferiore al Cut-off -10% sono da considerare Negativi. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 8/24

9 Risultati in Unità RADIM [UR] Assorbanza media del campione x 10 Cut-Off = [Unità RADIM = UR] Esempio: x 10 = 32 UR (Unità RADIM) 0.38 Cut-Off : 10 UR Dubbio: 9-11 UR Negativo: <9 UR Positivo: >11 UR 10. CARATTERISTICHE DEL TEST Precisione Riproducibilità: Inter-saggio n Media (UR) CV (%) Siero pos Ripetibilità: Intra-saggio n Media (OD) CV (%) Siero pos Specificità diagnostica La specificità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica é pari a 94% Sensibilità diagnostica La sensibilità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica é pari a 97.6% Possibili interferenze Campioni emolitici, lipemici ed itterici contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, 5 mg/ml di trigliceridi e 0.2 mg/ml di bilirubina non hanno mostrato fenomeni di interferenza nel presente test. 11. LIMITI DELLA PROCEDURA Una contaminazione batterica o ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono alterare i valori delle assorbanze. La diagnosi di una malattia infettiva non deve essere fatta soltanto sulla base della risultanza di un unico test. Una diagnosi precisa deve prendere in considerazione anche l anamnesi, i sintomi del paziente e i dati derivanti dalle analisi sierologiche. I risultati sierologici provenienti da pazienti immunosoppressi e dai neonati hanno un valore limitato. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 9/24

10 12. PRECAUZIONI E AVVERTENZE In ottemperanza alla direttiva Europea 98/79/CE l uso dei dispositivi medico-diagnostici in vitro è inteso da parte del fabbricante ad assicurare la congruenza, le prestazioni e la sicurezza del prodotto. Di conseguenza la procedura analitica, le informazioni, le precauzioni e le avvertenze contenute nelle istruzioni per l uso devono essere seguite scrupolosamente. L uso dei kit con analizzatori e attrezzature similari deve essere previamente convalidato. Qualunque cambiamento nel progetto, nella composizione o struttura e nella procedura analitica, così come qualunque uso dei kit in associazione ad altri prodotti non approvati dal fabbricante non è autorizzato; l utilizzatore stesso è responsabile di questi eventuali cambiamenti. Il fabbricante non è responsabile di falsi risultati e incidenti che possano essere causati da queste ragioni. Il fabbricante non è responsabile di qualunque risultato ottenuto attraverso l esame visivo dei campioni dei pazienti. Solo per uso diagnostico in-vitro. Tutti i componenti di origine umana impiegati nella produzione dei reagenti contenuti nel kit sono stati trovati non reattivi agli anticorpi anti-hiv ed anti-hcv e all HBsAg. Nonostante ciò tutti i materiali devono comunque essere considerati e trattati come se fossero potenzialmente infettivi. La sodio azide, contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare la formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua durante l eliminazione dei reagenti. Non scambiare reagenti e micropiastre di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri fabbricanti insieme ai reagenti di questo kit. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza indicata sull etichetta. Utilizzare soltanto attrezzatura (puntali, dispensatori) e materiale di laboratorio puliti. Non scambiare i tappi dei flaconi in modo da evitare contaminazioni crociate. Richiudere bene i flaconi immediatamente dopo l uso per evitare fenomeni di evaporazione e contaminazione microbica. Una volta aperti e dopo relativo stoccaggio verificare i reagenti, prima dell uso, al fine di escludere una loro eventuale contaminazione microbica. Per evitare contaminazioni crociate e risultati erroneamente alti dispensare campioni e reagenti con molta precisione sul fondo dei pozzetti, evitando la formazione di schizzi. Il kit è destinato esclusivamente all utilizzo da parte di personale specializzato, che conosce perfettamente le tecniche di lavoro. ATTENZIONE: Bronidox L, nella concentrazione usata, non presenta quasi alcun rischio di tossicità sulla pelle e sulle mucose. ATTENZIONE: L acido solforico irrita occhi e pelle! In caso di contatto sciacquare immediatamente con abbondante acqua e contattare un medico. Mantenere fuori dalla portata dei bambini Smaltimento In genere i residui delle sostanze chimiche e delle preparazioni vengono considerati rifiuti pericolosi. Lo smaltimento di questo tipo di materiale viene regolato da leggi nazionali e regolamenti regionali. Per ulteriori informazioni contattare le autorità locali o le società autorizzate allo smaltimento dei rifiuti. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 10/24

11 SCHEMA DEL DOSAGGIO Bordetella pertussis IgG E.W. Preparazione Preparare campioni, controlli e reagenti come indicato. Stabilire lo schema di distribuzione ed identificazione di campioni e controlli sull apposito foglio fornito nel kit. Inserire la quantità di pozzetti necessari nel supporto per micropiastre. Procedimento Bianco (A1) Campione NEG POS C/O (diluito 1+100) NEG - 100µl POS µl - - C/O µl - Campione (diluito 1+100) µl Coprire la micropiastra con la pellicola Incubare per 1 ora ± 5 min a 37 C ± 1 C Lavare 3 x con 300µl di tampone di lavaggio CONJ - 100µl 100µl 100µl 100µl Coprire la micropiastra con la pellicola Incubare per 30 min a temperatura ambiente Lavare 3 x con 300µl di tampone di lavaggio TMB SUBS 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio STOP 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Misurazione fotometrica a 450 nm (lunghezza d onda di riferimento: 620 nm) M397 Rev.1 02/2008 Pag. 11/24

12 Enzyme immunoassay for the qualitative determination of IgG-class antibodies against Bordetella pertussis in human serum or plasma 1. INTRODUCTION Only for in-vitro diagnostic use Bordetella species are non-spore-forming encapsulated bipolar, coccoid (pale-staining) Gramnegative bacilli (about µm thick and 1 µm long). The genus consists of the human parasites B. pertussis and B. parapertussis, and B. bronchiseptica and B. avium which cause enzootic infections in various wild and domestic animal species. B. pertussis is the classical exciter of pertussis and exists only in ill people; B. parapertussis causes 5-20% of a milder and often clinical unapparent form of pertussis. B. bronchiseptica has seldomly (eg close contact with animals) human pathogenic significance as opportunistic secondary exciter in mixed infections (bronchitis, pneumonia, wound infection). Pertussis or whooping cough is a bacterial infection of the respiratory system. It is a highly contagious childhood disease which appears seldomly under adults. It is transmitted by respiratory contact. B. pertussis has the ability to stick to the cilia of the epidermal cells of the respiratory system. Fragments of the bacterial cell wall (ExoToxin = tracheal Cytotoxine, TCT) inhibit the movement of the cilia in the tracheal mucosa. After an incubation time of one to three weeks the disease runs through three stages (s. table below). The lethality is 0.6 % and concerns babies in the first six months with more than 70%. For newborn and premature infants it is higher (1-2%). In Africa beside measle virus B. pertussis is the main reason for high infant mortality. The distribution of the disease is worldwide. Clinical pertussis is followed by natural acquired immunity which is long-lasting but not permanent. In most countries an active vaccination is recommended which leads to 90% protection for three to twelve years. Usually the immunization preparation is combined with diphtheria and tetanus toxoids. Species Disease Symptoms Mechanism of Infection Bordetella pertussis Pertussis; whooping cough 1. Stadium catarrhale: symptoms of a cold with slight fever (1-2 weeks) 2. Stadium convulsivum: severe, spasmodic coughing; after deep inspiration follows a coughing with protruded tongue (2-6 weeks) 3. Stadium decrementi: Ease of disease with symptoms of a bronchitis (up to 6 weeks) Highly contagious droplet infection Humans are the only reservoir of B. pertussis Incubation time: 1-3 weeks M397 Rev.1 02/2008 Pag. 12/24

13 The presence of the bacterium responsible for infection may be identified by: Microscopy: identification on cultures, IF Serology: Detection of antibody production by ELISA Precise diagnosis is needed for effective treatment of patients, for isolation of unvaccinated infants at risk, and for differentiation of pertussis from atypical diseases and chronic infections. 2. INTENDED USE The Bordetella pertussis IgG E.W. is intended for the qualitative determination of IgG class antibodies against Bordetella pertussis and Bordetella pertussis toxin in human serum or plasma (citrate). 3. PRINCIPLE OF THE ASSAY The qualitative immunoenzymatic determination of IgG-class antibodies against Bordetella pertussis is based on the ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) technique. Microtiter strip wells are precoated with Bordetella pertussis/toxin antigens to bind corresponding antibodies of the specimen. After washing the wells to remove all unbound sample material horseradish peroxidase (HRP) labelled anti-human IgG conjugate is added. This conjugate binds to the captured Bordetella pertussis/toxin specific antibodies. The immune complex formed by the bound conjugate is visualized by adding tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product. The intensity of this product is proportional to the amount of Bordetella pertussis/toxin specific IgG antibodies in the specimen. Sulphuric acid is added to stop the reaction. This produces a yellow endpoint colour. Absorbance at 450nm is read using an ELISA microwell plate reader. 4. MATERIALS 4.1. Reagents supplied MTP Coated Microplate: 1 microplate with 96 breakable wells (12x8) coated with Bordetella pertussis toxin and antigens; vacuum sealed, in resealable aluminium foil. DIL Sample Diluent IgG***: 1 bottle containing 105 ml of ready to use buffer for sample dilution; ph 7.2 ± 0.2; coloured yellow. STOP Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml of sulphuric acid, 0.2 mol/l; ready to use. WASH Washing Solution (20x)*: 1 bottle containing 50 ml of a 20-fold concentrated buffer (ph 7.2 ± 0.2) for washing the wells. CONJ Enzyme Conjugate**: 1 bottle containing 20 ml of rabbit antibody antihuman IgG labelled with peroxidase; coloured red, ready to use. TMB SUSB TMB-Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml of 3,3',5,5'- tetramethylbenzidine (TMB); ready to use. POS Positive Control***: 1 bottle containing 2 ml of a ready to use control solution; coloured yellow. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 13/24

14 C/O NEG Cut-off Control***: 1 bottle containing 2 ml of a ready to use control solution; coloured yellow. Negative Control***: 1 bottle containing 2 ml of a ready to use control solution; coloured yellow. * contains: 0.2 % Kathon ** contains: 0.2 % Bronidox L *** contains: 0.1 % Kathon and 0.09% Sodium Azide 4.2. Materials supplied 1 Strip holder 2 Cover foils 1 Instruction for use 1 Distribution and identification plan for samples and controls 4.3. Materials and Equipment needed Manual Test ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450/620nm Incubator 37 C Manual or automatic equipment for rinsing wells Micropipettes and disposable plastic tips (10, 100, 200, 1000 µl) Vortex tube mixer Disposable tubes Test tube rack Deionized or (freshly) distilled water Timer AutomaticTest This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. STABILITY AND STORAGE The reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at C. 6. REAGENT PREPARATION It is very important to bring all the reagents to room temperature (20 25 C) before starting the test run! 6.1. Coated Microplate The ready to use breakapart snap-off strips are coated with Bordetella pertussis toxin and antigens. Store at C. The strips are vacuum sealed. Immediately after removal of strips, the M397 Rev.1 02/2008 Pag. 14/24

15 remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied and stored at 2 8 C. Once opened they are stable until expiry date indicated on the label, if stored at 2 8 C Enzyme Conjugate The bottle contains 20 ml of a solution with anti-human-igg labelled with horseradish peroxidase, buffer, stabilizers, preservatives and an inert red dye. The solution is ready to use. Store at C. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label, if stored at 2 8 C Controls Positive, Cut-off and Negative Control contain 2 ml of a ready to use solution. Store at C. Once opened, controls are stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C Sample Diluent IgG The bottle contains 105 ml of phosphate buffer, stabilizers, preservatives and an inert yellow dye. It is used for the dilution of the patient specimen. This ready to use solution has to be stored at C. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label, if stored at 2 8 C Washing Solution (20x) The bottle contains 50 ml of a concentrated buffer, detergents and preservatives. Once opened the concentrated Washing Solution is stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C. Dilute washing solution with deionized or distilled water 1+19 (e.g. 10 ml of washing solution ml of deionized or distilled water). Once diluted, buffer will keep for 5 days if stored at room temperature. Crystals in the solution disappear by warming up to 37 C in a water bath. Note: Prepare only the volume of washing solution necessary to carry out the assay TMB-Substrate Solution The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be stored at C, away from the light. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into blue, it may have become contaminated and should be thrown away. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C Stop Solution The bottle contains 15 ml of 0.2 mol/l sulphuric acid solution, ready to use. The solution has to be stored at C. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial label if stored at 2 8 C. 7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Use human serum or plasma (citrate) samples with this assay. If the assay is performed within 5 days after sample collection, the specimen should be kept at C; otherwise they should be aliquoted and stored deep-frozen (-20 to -70 C). If samples are stored frozen, mix thawed samples well before testing. Avoid repeated freezing and thawing. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 15/24

16 7.1. Sample Dilution Before assaying, all samples should be diluted with Sample Diluent IgG. Dispense 10µl of sample and 1mL of Sample Diluent IgG into tubes to obtain a dilution and thoroughly mix with a vortex. Controls are ready to use and must not be diluted. 8. ASSAY PROCEDURE 8.1. Test Preparation Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described. The following procedure should be observed to perform the manual test. Prior to commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and controls should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Please allocate at least: 1 well (e.g. A1) for the blank 1 well (e.g. B1) for the negative control 2 wells (e.g. C1+D1) for the cut-off control 1 well (e.g. E1) for the positive control. It is recommended to perform the assay in duplicate. Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. A clean, disposable tip should be used for dispensing each control and sample. Adjust the incubator to 37 ± 1 C. 1. Dispense 100µl of controls and diluted samples into their respective wells. Leave well A1 for blank. 2. Cover wells with the foil supplied in the kit. 3. Incubate for 1 hour ± 5 min at 37±1 C. 4. When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times with 300µl of Washing Solution. Avoid overflows from the reaction wells. The soak time between each wash cycle should be >5 sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue paper prior to the next step! Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values. 5. Dispense 100µl of Enzyme Conjugate into all wells except for the blank well (e.g. A1). Cover with foil. 6. Incubate for 30 min at room temperature ( C). Do not expose to direct sunlight. 7. Repeat step Dispense 100µl of TMB-Substrate Solution into all wells 9. Incubate for exactly 15 min at room temperature ( C) in the dark. 10. Dispense 100µl of Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB-Substrate Solution. Any blue colour developed during the incubation turns into yellow. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 16/24

17 Note: Highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen! These precipitates have an influence when reading the optical density. Predilution of the sample with physiological sodium chloride solution, for example 1+1, is recommended. Then dilute the sample with dilution buffer and multiply the results in UR by Measure the absorbance of the specimen at 450/620nm within 30 min after addition of the Stop Solution. While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual Measurement Adjust the ELISA Microwell Plate Reader to zero using the Blank in well A1. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the Blank in well A1, subtract the absorbance value of well A1 from all other measured absorbance values in order to obtain reliable results! Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record all the absorbance values in the distribution and identification plan. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. 9. RESULTS 9.1. Run Validation Criteria The assay is considered valid if the following criteria are met: Blank in A1: Absorbance value lower than Negative control in B1: Absorbance value lower than Cut-off control in C1 and D1: Absorbance value between and Positive control in E1: Absorbance value equal to or greater than the cut-off value Calculation of Results The cut-off is the mean absorbance value of the Cut-off control determinations. Example: Absorbance value Cut-off control absorbance value Cut-off control 0.37 = 0.76 / 2 = 0.38 Cut-off = 0.38 M397 Rev.1 02/2008 Pag. 17/24

18 9.3. Interpretation of Results Samples with an absorbance value higher than the Cut-off +10% are considered as POSITIVE. Samples with an absorbance value falling into the range of Cut-off ± 10% should not be considered as clearly positive or negative. The result should be considered in the GREY ZONE. It is recommended to repeat the test again 2-4 weeks later with a fresh sample. If results in the second test are again in the grey zone the sample has to be considered NEGATIVE. Samples with an absorbance value lower than the Cut-off -10% are considered as NEGATIVE Results in RADIM Units [UR] Patient (mean) absorbance value x 10 Cut-off = [RADIM Units = UR] Example: x 10 = 32 UR (RADIM Units) 0.38 Cut-off: 10 UR Grey zone: 9-11 UR Negative: <9 UR Positive: >11 UR 10. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS Precision Reproducibility: Inter-assay n Mean (UR) CV (%) Pos. Serum Repeatability: Intra-assay n Mean (OD) CV (%) Pos. Serum Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. It is 94%. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 18/24

19 10.3. Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. It is 97.6% Possible Interferences Interferences with hemolytic, lipemic or icteric sera are not observed up to a concentration of 10 mg/ml hemoglobin, 5 mg/ml triglycerides and 0.2 mg/ml bilirubin. 11. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. Diagnosis of an infectious disease should not be established on the basis of a single test result. A precise diagnosis should take into consideration clinical history, symptomatology as well as serological data. In immunsuppremized patients and newborns serological data only have restricted value. 12. PRECAUTIONS AND WARNINGS In compliance with European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed. The use of the test kits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples. Only for in-vitro diagnostic use. All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-hiv antibodies, anti-hcv antibodies and HBsAg and have been found to be nonreactive. Nevertheless, all materials should still be regarded and handled as potentially infectious. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. Do not interchange reagents or strips of different production lots. No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit. Do not use reagents after expiry date stated on the label. Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware. Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination. Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to further use. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 19/24

20 To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense reagents without splashing accurately to the bottom of wells. This kit is only designed for qualified personnel who are familiar with good laboratory practise. WARNING: In the used concentration Bronidox L has hardly any toxicological risk upon contact with skin and mucous membranes! WARNING: Sulphuric acid irritates eyes and skin. Upon contact, rinse thoroughly with water and consult a doctor! Keep out of the reach of children Disposal Considerations Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste. M397 Rev.1 02/2008 Pag. 20/24

21 ASSAY SCHEME Bordetella pertussis IgG E.W. Test preparation Prepare samples, controls and reagents as described. Establish the distribution and identification plan for all specimens and controls on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Assay procedure Blank Sample NEG POS C/O (e.g. A1) (diluted 1+100) NEG - 100µl POS µl - - C/O µl - Sample (diluted 1+100) µl Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 1 h ± 5 min at 37 C ± 1 C Wash each well three times with 300µl of washing solution CONJ - 100µl 100µl 100µl 100µl Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 30 min at room temperature Wash each well three times with 300µl of washing solution TMB SUBS 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Incubate for exactly 15 min at room temperature in the dark STOP 100µl 100µl 100µl 100µl 100µl Photometric measurement at 450 nm (reference wavelength: 620 nm) M397 Rev.1 02/2008 Pag. 21/24

22 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / Reference or order code / Référence ou numéro de commande / Referencia o número de pedido / Referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / Lot / Lot / Lote / Lote / Charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / Expiry date / Date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic invitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/7/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik / Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / Consult instructions for use / Consulter le mode opératoire / Consultar las instrucciones de uso / Consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití 96 Sufficiente per 96 test / Sufficient for 96 tests / Suffisant pour 96 déterminations / Suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů M397 Rev.1 02/2008 Pag. 22/24

23 RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / Reconstitute with / Reconstituer avec / Reconstituir con / Reconstituir com / Rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / Deionized or distilled water / Eau deionisée ou distillée / Agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M397 Rev.1 02/2008 Pag. 23/24

24 BIBLIOGRAFIA - LITERATURE Wong, K.H., and S.K.Skelton Preparation of filamentous hemagglutinin from Bordetella pertussis and assay for serum antibodies to filamentous hemagglutinin and pertussis toxin for clinical and public health lab. J.Clin.Microbiol. 27: Zachrisson, G., I. Krantz, T. Lagergard, P. Larsson, R. Sekura, N. Sigurs, S. Taranger, and B. Trollfors Humoral antibody response to pertussis toxin in patient with clinical pertussis measured by an enzyme-linked immunosorbent assay. Eur. J. Clin. Microbiol. 7: Granstrom, M.,G. Granstrom, A. Lindtors Serologic diagnosis of whooping cough by an enzyme-linked immunosorbent assay using fimbrial hemagglutinin as antigen. J.Infect.Dis. 146: RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -