MORBILLO IgG EIA WELL REF K7MG. Italiano p. 3 English p. 12. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 1/24

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1 MORBILLO IgG EIA WELL REF K7MG 96 Italiano p. 3 English p. 12 M129 Rev.8 04/2008 Pag. 1/24

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. Stato fisico, Physical state MTP 1 x 96 Pronti per l'uso Ready for use WASH 1 x 50 ml Conc. DIL NEG POS C/O CONJ TMB STOP 1 x 20 ml Conc. 1 x 2 ml Pronto per l'uso Ready for use 1 x 2 ml Pronto per l'uso Ready for use 1 x 2.5 ml Pronto per l'uso Ready for use 1 x 14 ml Pronto per l'uso Ready for use 2 x 15 ml Pronto per l'uso Ready for use 1 x 14 ml Pronto per l'uso Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M129 Rev.8 04/2008 Pag. 2/24

3 DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI VIRUS DEL MORBILLO NEL SIERO O PLASMA UMANO. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE Il virus del Morbillo (VM) è un virus altamente contagioso che provoca un'infezione non grave soprattutto nei bambini e nei giovani adulti; ha distribuzione mondiale, e causa l'infezione acuta una sola volta nella vita dell'individuo. Il VM appartiene alla famiglia dei Paramyxoviridae. Il virione è circondato da un doppio strato lipidico, all'interno del quale sono racchiuse le glicoproteine a protezione dell'unico filamento di RNA. I virioni sono altamente polimorfi, assumendo anche forme filamentose ed irregolari. Il virus possiede un'attività emoagglutinante associata alla proteina EA (ad elevato potere immunogeno), ed un'attività emolitica associata alla proteina F. La trasmissione del virus è mediata da goccioline di aerosol e da secrezioni respiratorie che penetrano nei tratti respiratori superiori e quindi nelle stazioni linfonodali di drenaggio, in cui inizia la replicazione. L'invasione del sistema reticolo endoteliale attraverso il sangue caratterizza la viremia primaria. Circa cinque giorni dopo, il VM invade la cute, i visceri, i reni e la vescica (viremia secondaria). A questo punto si ha iperplasia linfoide e numerosi infiltrati di cellule infiammatorie mononucleate. La sintomatologia iniziale (dopo giorni di incubazione) consiste in febbre, malessere generale, rinite, congestione e congiuntivite, seguito da un esantema transitorio con aspetto maculare e comparsa delle chiazze di Koplik nella mucosa buccale. Al 14 giorno compare il tipico esantema macropopulare che coinvolge il volto, il collo, il tronco e gli arti, e si ha un innalzamento dei titoli anticorpali. L'esantema dura non più di 3-4 giorni, poi recede autonomamente fino a scomparire del tutto. In caso contrario si possono sospettare complicazioni, come polmonite o encefaliti. La diagnosi sierologica è importante soprattutto in presenza di forme atipiche di morbillo, non facilmente diagnosticabili in altro modo, o nella diagnosi differenziale di tutte le infezioni della pelle e delle mucose di origine sconosciuta (es.: rosolia, scarlattina, esantemi di diversa eziologia, infezioni da ECHO virus, infezioni dell'apparato respiratorio e del sistema nervoso centrale). Il test è anche indicato per monitorare lo stato immunitario pre- o post-vaccinazione del paziente. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA) ed utilizza come marcatore enzimatico la perossidasi. Durante la prima incubazione, gli anticorpi anti-vm della classe IgG eventualmente presenti nel siero in esame, si legano all'antigene VM adeso alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene eliminato il materiale non legato; in una successiva incubazione gli anticorpi anti- M129 Rev.8 04/2008 Pag. 3/24

4 IgG umane, coniugati alla perossidasi, reagiscono con il complesso precedentemente formatosi tra antigene e anticorpo anti-vm. Dopo ulteriore lavaggio viene aggiunta tetrametilbenzidina (TMB) incolore che, reagendo con la perossidasi presente, produce un composto colorato. La reazione di sviluppo del colore è bloccata con l'aggiunta di H 2 SO 4 e l'intensità del colore, misurata mediante spettrofotometro a 450 e a 405 nm, è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi IgG anti-vm presenti nei controlli e nei campioni in esame. 3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA' I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. Il kit deve essere conservato a 2-8 C. La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. Una volta aperto il kit è stabile 2 mesi a 2-8 C. 3.1 Reagenti Specifici MTP Micropiastra sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti, divisibili singolarmente, sensibilizzati con antigene del Virus del Morbillo purificato ed inattivato. I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2-8 C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente. POS Controllo Positivo: 1 flacone (2 ml) di siero umano reattivo per IgG anti-vm. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l'uso. C/O Controllo Cut-off: 1 flacone (2.5 ml) di siero umano reattivo per IgG anti-vm. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l'uso e colorato in azzurro. CONJ Coniugato Enzimatico: 1 flacone (14 ml) di anticorpi monoclonali (topo) Anti-IgG umane, coniugati con perossidasi di rafano (HRPO), in matrice sierica e stabilizzanti. Conservante: Neomicina. Pronto per l'uso e colorato in rosa. 3.2 Reagenti Comuni per i kit delle Linee To.R.C.H. M.S.T., Malattie dell infanzia, Patologia Gastroenterica e Morbo Celiaco WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata): 1 flacone (50 ml) di PBS- Tween-20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Al momento dell'uso diluire la quantità necessaria 1:20 con H 2 O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. Dopo diluizione il tampone di lavaggio è stabile 30 giorni a 2-8 C. DIL Diluente dei Campioni (concentrato): 1 flacone (20 ml) di matrice sierica e stabilizzanti, colorato in rosso. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Al momento dell'uso diluire 1:20 con la soluzione di lavaggio già diluita. Il diluente così preparato è stabile 30 giorni a 2-8 C. NEG Controllo Negativo: 1 flacone (2 ml) di siero umano non reattivo per IgG anti-vm. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto per l'uso e colorato in rosso. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 4/24

5 TMB Cromogeno: 2 flaconi (15 ml) di Tetrametilbenzidina (TMB) in tampone citrato-fosfato, DMSO e H 2 O 2. Pronto per l uso. STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 ml) di H 2 SO 4 1N. Pronto per l'uso. CPA Copripiastra adesivo Bustina di plastica trasparente con minigrip 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 4.1 Dosaggio Manuale Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile. Stufa termostatata a 37±2 C. Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi. Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell'intervallo A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm. H 2 O distillata. 4.2 Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. E possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 5/24

6 Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare l ottenimento di dati clinici non attendibili. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione. Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente funzionante. L utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente possibile misclassificazione degli stessi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente funzionante. L incubazione a temperature diverse da 37±2 C può dare luogo a perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata. Assicurarsi che l agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente funzionante. L agitazione in condizione diverse dall atteso può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione. Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a temperature diverse dall atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 6/24

7 Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. 6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma umano. Campioni moderatamente lipemici non influenzano i risultati del dosaggio; campioni fortemente lipemici o emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di filamenti di fibrina può interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano perfettamente limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati per un periodo non superiore ad una settimana se correttamente mantenuti a 2-8 C, a-20 C per tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Prima dell'uso, diluire i campioni 1:300 con il Diluente dei Campioni precedentemente preparato (es. 10 µl di campione µl di diluente). 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO * Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 7/24

8 7.1 Preparare i pozzetti necessari al dosaggio, prevedendo la determinazione in duplicato per i Sieri di Controllo ed in singolo per il Bianco ed i Campioni. 7.2 Dispensare 100 µl dei Sieri di Controllo e Campioni precedentemente diluiti, nei rispettivi pozzetti. N.B.: i Sieri di Controllo non devono essere diluiti. 7.3 Dispensare 100 µl di Diluente Campioni diluito nel pozzetto del Bianco. 7.4 Incubare per 60±5 minuti a 37±2 C, coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.5 Effettuare 3 lavaggi con un volume di 350 µl per pozzetto, impiegando la Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i pozzetti. 7.6 Dispensare 100 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti. 7.7 Incubare per 30±2 minuti a 37±2 C, coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.8 Lavare i pozzetti come al punto Dispensare 100 µl di Cromogeno in tutti i pozzetti Incubare per 10 minuti a 37±2 C o 15 minuti a temperatura ambiente (18-25 C), al riparo dalla luce Dispensare 100 µl di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow, utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p CALCOLO DEI RISULTATI * Considerare la densità ottica di ciascun controllo negativo, cut-off e positivo. Confrontando la densità ottica dei campioni con la densità ottica del controllo cutoff (valore soglia) si determina la reattività o non reattività verso gli anticorpi IgG anti-vm. I campioni con valori di densità ottica inferiori a quello relativo al controllo Cut-off sono da considerare non reattivi per gli anticorpi IgG anti-vm. Campioni con valori di densità ottica superiori al controllo Cut-off sono da considerare reattivi per gli anticorpi IgG anti-vm. I campioni con valori di densità ottica compresi tra il controllo Cut-off ± 10% sono da considerare di incerta interpretazione e devono pertanto essere ridosati. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 8/24

9 * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura. 9.1 Esempio di calcolo I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione D.O. 450 nm Controllo Negativo Controllo Cut-off Controllo Positivo Campione Il campione dosato risulta essere positivo agli anticorpi IgG anti-vm. 9.2 Controllo dei valori attesi Prima di procedere al calcolo dei risultati verificare che le assorbanze dei controlli rispettino i seguenti valori: Descrizione Valore atteso Controllo Negativo < Controllo Positivo > Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio. 9.3 Interpretazione dei Risultati I campioni non reattivi sono da considerare negativi per gli anticorpi IgG anti- VM. I campioni reattivi sono da considerare positivi per gli anticorpi IgG anti-vm. I campioni di incerta interpretazione devono essere dosati nuovamente per conferma. Successivi prelievi dello stesso paziente possono essere comparati tra loro solo se inseriti nello stesso dosaggio; in questo caso un aumento del 60% della densità ottica del secondo campione può essere considerato come significativo di una infezione recente od in atto. Si consiglia in tal caso, la ricerca delle IgM specifiche. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 9/24

10 10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Clinica La specificità clinica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo di soggetti non immuni da infezione di VM, risultando pari a 94.1% Sensibilità Clinica La sensibilità clinica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo di soggetti con infezione pregressa di VM, risultando pari a 91.2% Precisione La precisione é stata valutata misurando la ripetibilità e la riproducibilità (variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su 3 sieri a differenti concentrazioni di IgG anti-vm. Ripetibilità (Intra-saggio) Siero Media ± D.S. C.V. Replicati (D.O. 450 nm) % n. a 542 ± b 909 ± c 1613 ± Riproducibilità (Inter-saggio) Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi (D.O. 450 nm) % n. a ± b ± c ± M129 Rev.8 04/2008 Pag. 10/24

11 11. LIMITI DEL DOSAGGIO E' da tenere presente che, per definire lo stato immunitario di un paziente verso il VM, la presenza di anticorpi di tipo IgG a qualsiasi livello non esclude la possibilità di un'infezione in atto, mentre il dosaggio degli anticorpi specifici di tipo IgM si rivela di fondamentale importanza per la diagnosi precoce dell'infezione acuta e per la diagnosi differenziale. Un tempestivo intervento in caso di malattia in atto, permette di ridurre notevolmente i rischi che ne conseguono. Raramente è stata evidenziata una risposta eterotipica di anticorpi IgG anti-vm relativa ad altre situazioni patologiche o fisiologiche; comunque, i risultati del dosaggio devono essere interpretati con cautela e convalidati da valutazioni cliniche specifiche ed ulteriori prove diagnostiche. 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20 M129 Rev.8 04/2008 Pag. 11/24

12 ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUALITATIVE DETERMINATION OF ANTI MEASLES VIRUS IgG ANTIBODIES IN HUMAN SERUM OR PLASMA. FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS The Measles virus is highly contagious and causes a non-serious infection, especially in children and young adults. It has a worldwide distribution and acute infection takes place only once in the life of the infected individual. The Measles virus is a member of the Paramyxoviridae family. The virion is enveloped in a bimolecular lipid layer enclosing the glycoproteins, for the protection of a singlestranded RNA. The highly pleiomorphic virions may be found in various shapes, often filamentous and irregular. The virus is characterized by a hemoagglutinating activity, associated to the EA protein (highly immunogenic) as well as a hemolytic activity, associated to the F protein. Viral transmission is mediated by aerosol droplets as well as respiratory secretions which penetrate the upper respiratory tract and thence the lymph node drainage areas, where replication starts. Primary viremia is characterized by an invasion of the reticuloendothelial system, through the blood. Approximately 5 days later, the Measles virus reaches: skin, viscera, kidneys and urinary bladder (secondary viremia), with lymph node hyperplasia and numerous infiltrating, mononucleated inflammatory cells. After days of incubation, the initial symptoms are as follows: fever, malaise, rhinitis, congestion, conjunctivitis, followed by a transient macular exanthema and appearance of Koplik's spots in the mucous membrane of the mouth. Upon the 14th day, a typical macropapular rash on face, neck, trunk and limbs will be observed; in addition, the antibody titer will reach its peak. The rash lasts no more than 3-4 days, after which it autonomously regresses, until it totally disappears. Complications such as pneumonia or encephalitis may arise. Serological diagnosis assumes a special importance in atypical forms of measles, which are not easily diagnosed in other ways. It is also useful in differentiating from other forms of infections involving skin and mucous membranes ( ex. rubella, scarlet fever, rashes of different etiologies, ECHO virus infections as well as infections of the respiratory route and the CNS). The test may also be used to monitor pre- and post-vaccination immunological status of the patient. 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where horseradish peroxidase is used as enzyme conjugate. During the first incubation, the sample anti-measles IgG antibodies, if present, are bound to the Measlesantigen coated wells. A wash cycle eliminates all unbound material. In the incubation that follows, a second antibody (anti-human IgG conjugated with horseradish peroxidase) will bind to the Measles-antigen-antibody complex. After M129 Rev.8 04/2008 Pag. 12/24

13 a further wash cycle a colorless Chromogen solution (tetramethylbenzidine, TMB) in a substrate-buffer is added to the wells, where it yields a colored compound, by reacting with the peroxidase enzyme. Color development will be stopped by adding H 2 SO 4. The color intensity, measured in a spectrophotometer at 450 and at 405 nm, will thus be directly proportional to the anti-measles IgG antibody concentration in controls and samples. 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY The reagents are sufficient for 96 wells. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each reagent is shown on the vial label. Once opened, the kit is stable at 2-8 C for 2 months. 3.1 Specific Reagents MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with purified and inactivated Measles virus antigens. Keep unused wells at 2-8 C in the provided plastic bag and accurately sealed. POS Positive Control: 1 vial (2 ml) of human serum reactive for anti-vm IgG. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Ready for use. C/O Cut-off Control: 1 vial (2.5 ml) of human serum reactive for anti-vm IgG. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Ready for use and blue-colored. CONJ Enzyme Conjugate : 1 vial (14 ml) of mouse monoclonal antihuman IgG with horseradish peroxidase (HRPO) in serum matrix with stabilizers. Preservative: Neomycin. Ready for use and pink-colored. 3.2 Common Reagents for kits of the following Lines: To.R.C.H. S.T.D., Child Disease, Gastroenteric Disease and Celiac Disease WASH Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 ml) of PBS-Tween 20. Preservative: Thimerosal (<0.05%). Just before use, dilute the needed amount 1:20 with distilled H 2 O. In case of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37 C for a few minutes. Store the diluted Washing Solution for 30 days at 2-8 C. DIL Sample Diluent (concentrated): 1 vial (20 ml) of serum matrix and stabilizers, red-colored. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Just before use, dilute 1:20 with the previously diluted Washing Solution. Store the diluted Sample Diluent for 30days at 2-8 C. NEG Negative Control: 1 vial (2 ml) of human serum non-reactive for anti- VM IgG. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Ready for use and red-colored. TMB Chromogen: 2 vials (15 ml) of Tetramethylbenzidine (TMB) with citrate-phosphate buffer, DMSO and H 2 O 2. Ready for use. STOP Blocking Reagent: 1 vial (14 ml) of 1N H 2 SO 4. Ready for use. CPA Adhesive plate sealers Plastic bag M129 Rev.8 04/2008 Pag. 13/24

14 4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Test Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Dry Heater, adjustable at 37±2 C. Graduated cylinders for reagent dilution. Aspiration pump or automated well washing device. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a A interval at 450 nm and 405 nm. Distilled H 2 O. 4.2 Automatic Test This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect: exact incubation times and quantities adding the reagents incubation times and temperature may cause incorrect clinical results. Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability of results obtained. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 14/24

15 In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order. Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order. Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The incubation temperature different from 37±2 C may cause a sensitivity losses and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature. Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order. Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the equipment used is in perfect working order. Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in perfect working order. The storage at different suggested temperature may cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 15/24

16 Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. 6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum or plasma samples. Moderately lipemic samples do not influence the results; highly lipemic or hemolyzed samples may affect the results. The presence of fibrin filaments could interfere with the assay; make sure that samples are always perfectly clear before testing. Keep samples properly stored at 2-8 C for 1 week; for longer periods it is advisable to freeze samples at -20 C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. Before use, dilute samples 1:300 with diluted Sample Diluent (see REAGENTS). Example: 10 µl sample µl diluent. 7. ASSAY PROCEDURE* Allow the reagents and samples to warm up at room temperature. Mix samples by inversion before use. 7.1 Prepare the wells in duplicate for Controls and in single for Blank and Samples. 7.2 Pipette 100 µl of Controls and diluted Samples into the corresponding wells. Note: Controls must not be diluted. 7.3 Pipette 100 µl of diluted Sample Diluent into the Blank well. 7.4 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and incubate the wells for 60±5 minutes at 37±2 C. 7.5 Wash the wells 3 times with 350 µl of diluted Washing Solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.6 Add 100 µl of Enzyme Conjugate into all wells. 7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and incubate the wells for 30±2 minutes at 37±2 C. 7.8 Wash the wells as described in point Pipette 100 µl of Chromogen into all wells Incubate the wells for 10 minutes at 37±2 C or 15 minutes at room temperature (18-25 C). Avoid direct light exposure Pipette 100 µl of Blocking Reagent into all wells Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting M129 Rev.8 04/2008 Pag. 16/24

17 the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from the end of the assay. * While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 8. ASSAY SCHEME: see p CALCULATION OF RESULTS* The optical density of each negative, positive and cut-off control must be considered. The presence or absence of anti-measles IgG antibodies is defined by comparing the sample absorbance with the absorbance of the Cut-off Control (threshold value). Samples with optical density lower than the cut-off control are to be considered non-reactive for anti-measles IgG antibodies. Samples with optical density higher than the cut-off control are to be considered reactive for anti- Measles IgG antibodies. Samples with absorbance values ranging within ± 10% of the cut-off control are to be considered questionable and should be retested for confirmation. * While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. 9.1 Calculation example The following values must be taken as an example and should not be used in place of experimental data. Description O.D. 450 nm Negative Control Cut-off Control Positive Control Sample The tested sample comes out positive for anti-measles IgG antibodies. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 17/24

18 9.2 Control of expected values Before proceeding to calculation of results, make sure the control absorbances are included within the following ranges: Description Expected Value Negative Control < Positive Control > If the values obtained are not within the expected range, it will be necessary to repeat the assay. 9.3 Interpretation of Results Non-reactive samples are to be considered negative for anti-measles IgG antibodies. Reactive samples are to be considered positive for anti-measles IgG antibodies. Questionable samples must be critically evaluated or repeated for confirmation. Subsequent blood-drawls of the same patient can be compared only if tested in the same assay. In this case, a 60% absorbance increase in the 2nd sample can be considered a significant indication of a recent or in progress infection. If so, test for specific IgM. 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY 10.1 Clinical Specificity The clinical specificity of the method was evaluated over a representative group of individuals with no immunity against VM IgG infection. The result was 94.1% Clinical Sensitivity The clinical sensitivity of the method was evaluated over a representative group of individuals having undergone past VM IgG infection. The result was 91.2% Precision Precision was evaluated determining the repeatability and the reproducibility of the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at different anti-vm IgG concentrations. Repeatability (Intra-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Replicates (O.D. 450 nm) % no. a 542 ± b 909 ± c 1613 ± M129 Rev.8 04/2008 Pag. 18/24

19 Reproducibility (Inter-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Assays (O.D. 450 nm) % no. a ± b ± c ± LIMITS OF THE ASSAY In defining the immunity level of a patient against Measles, the presence of IgG class antibodies, at any level, does not exclude the possibility of an ongoing infection. Therefore, specific IgM antibody testing is essential for an early diagnosis of acute infections as well as in differential diagnosis. In case of illness, a rapid intervention will considerably reduce the risks. A heterotypic response of anti-measles IgG antibodies has been observed on rare occasions, in other pathological or physiological conditions. However the results of the assay must be carefully interpreted and confirmed by clinical evaluations and further diagnostic tests. 12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20 M129 Rev.8 04/2008 Pag. 19/24

20 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití 96 Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için M129 Rev.8 04/2008 Pag. 20/24

21 yeterli / dostačující pro 96 testů RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M129 Rev.8 04/2008 Pag. 21/24

22 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/300 Reag. POS C/O NEG Pozzetti Wells Bianco Blank POS C/O NEG Campioni, Samples µl ---- Campioni, Samples µl DIL 100 µl Incubare, Incubate: 37±2 C, 60±5 min. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 3 x 350 µl. CONJ 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 37±2 C, 30±2 min. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 3 x 350 µl. TMB 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: 37±2, 10'; o, or T.A./R.T., 15'. STOP 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: nm. M129 Rev.8 04/2008 Pag. 22/24

23 BIBLIOGRAFIA - REFERENCES 1 - Chiodi, F., V.-A. Sundqvist, E. Norrby, M. Mavra, and H. Link Measles IgM antibodies in cerebrospinal fluid and serum in subacute sclerosing panencephalitis. J. Med. Virol. 18: Connolly, J.H., M. Haire, and D.S.M. Hadden Measles immunoglobulins in subacute sclerosing panencephalitis. Br. Med. J. 1: Cremer, N.E., C.K. Cossen, G. Shell, J. Diggs, D. Gallo, and N.J. Schmidt Enzyme immunoassay versus plaque neutralization and other methods for determination of immune status to measles and varicella-zoster viruses and versus complement fixation for serodiagnosis of infection with these viruses. J. Clin. Microbiol. 21: Forghani, B., and N.J. Schmidt Antigen requirements, sensitivity and specificity of enzyme immunoassays for measles and rubella viral antibodies. J. Clin. Microbiol. 9: Graves, M., D.E. Griffin, R.T. Johnson, R.L. Hirsch, I. Lindo De Soriano, S. Roedenbeck, and A. Vaisberg Development of antibody to measles virus polypeptides during complicated and uncomplicated measles virus infections. J. Virol. 49: Kahane, S., V. Goldstein, and I. Sarov Detection of IgG antibodies specific for measles virus by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Intervirology 12: Kiessling, W.R., W.W. Hall, L.L. Yung, and V. der Meulen Measles-virusspecific immunoglobulin-m response in subacute sclerosing panencephalitis. Lancet i: Kleiman, M.B., C.K.L. Blackburn, S.E. Zimmermann, M.L.V. French, and L.J. Wheat Rapid diagnosis of measles using enzyme-linked immunosorbent assay for measles immunoglobulin M. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1: Lievens, A.W., and P.A. Brunell Specific immunoglobulin M enzyme-linked immunosorbent assay for confirming the diagnosis of measles. J. Clin. Microbiol. 24: Massaro, A.R., A.M. Agliano, and R. Grillo Immunoglobulin M specific for measles in serum and cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis and other neurological disease. J. Neurol. 217: M129 Rev.8 04/2008 Pag. 23/24

24 RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.it -