CHLAMYDIA PNEUMONIAE IgA E.W.

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1 0123 CHLAMYDIA PNEUMONIAE IgA E.W. REF: K14CLA 96 Italiano p. 3 English p.12 M393 Rev.0 07/2005

2 INDICE / INDEX 1. INTRODUZIONE INTRODUCTION 2. USO PERVISTO INTENDED USE 3. PRINCIPIO DEL TEST PRINCIPLE OF THE ASSAY 4. MATERIALI MATERIALS 4.1 REAGENTI FORNITI REAGENTS SUPPLIED 4.2 ACCESSORI FORNITI MATERIALS SUPPLIED 4.3 MATERIALI ED ATTREZZATURE NECESSARI MATERIALS AND EQUIPMENT NEEDED Dosaggio Manuale Manual Test Dosaggio Automatico Automatic Test 5. MODALITA DI CONSERVAZIONE STABILITY AND STORAGE 6. PREPARAZIONE DEI REAGENTI REAGENT PREPARATION 6.1 MICROPIASTRA SENSIBILIZZATA COATED MICROPLATE 6.2 CONIUGATO CHLAMYDIA PNEUMONIAE ANTI-IgA CHLAMYDIA PNEUMONIAE ANTI-IgA CONJUGATE 6.3 CONTROLLI CONTROLS 6.4 DILUENTE CAMPIONE IgA IgA SAMPLE DILUENT 6.5 TAMPONE DI LAVAGGIO (20X CONC.) WASHING SOLUTION (20X CONC.) 6.6 SOLUZIONE TMB SUBSTRATO TMB SUBSTRATE SOLUTION 6.7 SOLUZIONE STOP - STOP SOLUTION 7. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION 7.1 DILUIZIONE DEI CAMPIONI SAMPLE DILUTION 8. PROCEDIMENTO ASSAY PROCEDURE 8.1 PREPARAZIONE DEL TEST TEST PREPARATION 8.2 MISURAZIONE MEASUREMENT 9. RISULTATI RESULTS 9.1 VALIDAZIONE DEL TEST ASSAY VALIDATION CRITERIA 9.2 CALCOLO DEI RISULTATI CALCULATION OF RESULTS 9.3 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI INTERPRETATION OF RESULTS RISULTATI IN UNITA RADIM (UR) RESULTS IN RADIM UNITS 10. CARACTERISTICHE DEL TEST SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS 10.1 PRECISIONE - PRECISION 10.2 SPECIFICITA DIAGNOSTICA DIAGNOSTIC SPECIFICITY 10.3 SENSIBILITA DIAGNOSTICA DIAGNOSTIC SENSITIVITY 10.4 POSSIBILI INTERFERENZE POSSIBLE INTERFERENCES 11. LIMITI DELLA PROCEDURA LIMITATIONS OF THE PROCEDURE 12. PRECAUZIONI ED AVVERTENZE PRECAUTIONS AND WARNINGS 12.1 SMALTIMENTO DISPOSAL CONSIDERATIONS 13. SCHEMA DEL DOSAGGIO ASSAY SCHEME M393 Rev.0 07/2005 Pag. 2/24

3 Test immunoenzimatico per la determinazione qualitativa degli anticorpi della classe IgA per Chlamydia Pneumoniae nel siero umano 1. INTRODUZIONE Solo per uso diagnostico in vitro Le Clamidie sono batteri immobili Gram-negativi e parassiti intracellulari obbligati che formano caratteristiche inclusioni all interno del citoplasma delle cellule infettate. Le Clamidie sono facilmente visibili al microscopio ottico. Si conoscono tre differenti specie di Clamidia patogene per l uomo: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae e Chlamydia psittaci, ed una specie patogena solo per gli animali (C. pecorum). Chlamydia trachomatis rappresenta la principale causa delle malattie a trasmissione sessuale in tutto il mondo ( milioni di casi) ed il numero di infezioni è in costante crescita. Le donne in gravidanza infettate da Chlamydia trachomatis possono trasmettere l infezione al bambino durante il parto, provocando congiuntiviti o polmoniti neonatali. I casi di infezione da Clamidia non trattati possono degenerare, nelle donne, in salpingiti croniche, aumentando il rischio di gravidanze extrauterine o di sterilità. Negli uomini la Chlamydia trachomatis è il principale agente eziologico delle uretriti nongonococciche. Uno dei problemi più gravi ed insidiosi che caratterizzano le infezioni da Clamidia è il frequente decorso asintomatico della malattia, che può dare origine ad infezioni croniche. In molti casi l infezione primaria non viene riconosciuta e vengono diagnosticate soltanto le sequele causate da infezioni ascendenti e persistenti. Specie Modalità d infezione Malattia Metodo diagnostico C. trachomatis Trasmissione diretta o sessuale: il sito primario di infezione è generalmente la mucosa degli occhi ed il tratto urogenitale. C. pneumoniae Infiltrazione delle mucose del tratto respiratorio. C. psittaci Inalazione di feci provenienti da uccelli infetti; contatto con organi interni di uccelli infetti Linfogranuloma venereo (LGV) Tracoma Congiuntivite da corpi inclusi nei neonati e negli adulti. Cerviciti, salpingiti, uretriti, epididimiti, proctiti e polmoniti nei neonati. Malattie respiratorie, endocarditi, malattie coronariche Ornitosi (Psittacosi) Sierologia PCR Microscopia L infezione può essere diagnosticata attraverso: Microscopia: colorazione Giemsa PCR Sierologia: determinazione degli antigeni mediante ELISA determinazione degli anticorpi mediante immunofluorescenza, EIA, ELISA M393 Rev.0 07/2005 Pag. 3/24

4 2. USO PREVISTO Il Chlamydia pneumoniae IgA E.W. è un kit per la determinazione qualitativa degli anticorpi specifici della classe IgA per Chlamydia pneumoniae nel siero umano. 3. PRINCIPIO DEL TEST La determinazione qualitativa degli anticorpi IgA per Chlamydia pneumoniae si basa sul principio ELISA. I pozzetti delle micropiastre contengono una fase solida con antigeni specifici della Chlamydia pneumoniae. Anticorpi specifici nel campione si legano agli antigeni immobilizzati nei pozzetti. Gli anticorpi del coniugato (perossidasi di rafano-anticorpi anti-iga umani) si legano ai complessi antigene (fase solida)-anticorpo (paziente) nei campioni positivi. Questi complessi vengono evidenziati da una colorazione blu dopo l incubazione con la soluzione TMB. L intensità di questa colorazione è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi specifici per la Chlamydia pneumoniae di classe IgA presenti nel campione. Fermando la reazione enzimatica con acido solforico si causa un cambiamento di colore dal blu al giallo che può essere misurato facilmente con un fotometro per l ELISA a 450 nm. 4. MATERIALI 4.1. Reagenti forniti MTP Micropiastra sensibilizzata con antigeni della Chlamydia pneumoniae (IgA): 12 strisce divisibili in 8 pozzetti, con adesi gli antigeni della Chlamydia pneumoniae; sigillate sotto vuoto, all interno di una busta d alluminio richiudibile. DIL Diluente campione IgA***: 1 flacone contenente 105 ml di tampone per diluire i campioni; ph 7.2 ± 0.2; color giallo; pronto all uso. STOP Soluzione Stop: 1 flacone contenente 15 ml di acido solforico, 0.2 mol/l, pronto all uso. WASH Tampone di Lavaggio (20x conc.)*: 1 flacone contenente 50 ml di un tampone concentrato 20 volte per il lavaggio dei pozzetti; ph 7.2 ± 0.2. CONJ Coniugato Chlamydia pneumoniae anti IgA**: 1 flacone contenente 20 ml di anticorpi di coniglio anti-iga umane, coniugati con perossidasi; color rosso; pronto all uso. TMBDSUBS Soluzione TMB Substrato: 1 flacone contenente 15 ml di 3,3`,5,5`- Tetrametilbenzidina (TMB); pronto all uso. POS Chlamydia pneumoniae IgA Controllo Positivo***: 1 flacone contenente 2 ml di soluzione di controllo pronta all uso; color giallo. C/O Chlamydia pneumoniae IgA Controllo Cut-off***: 1 flacone contenente 2 ml di soluzione di controllo pronta all uso; color giallo. NEG Chlamydia pneumoniae IgA Controllo Negativo***: 1 flacone contenente 2 ml di soluzione di controllo pronta all uso;color giallo. * contiene: 0.2 % Kathon ** contiene: 0.2 % Bronidox L *** contiene: 0.1 % Kathon e 0.095% Sodio Azide M393 Rev.0 07/2005 Pag. 4/24

5 4.2. Accessori forniti 1 supporto per micropiastre 2 pellicole adesive 1 istruzione per l uso 1 schema per la distribuzione ed identificazione di campioni e controlli 4.3. Materiali e attrezzature necessari Dosaggio Manuale Fotometro per micropiastre con filtri da 450/620 nm Incubatore a 37 C Lavatore per micropiastre Micropipette con punte monouso (10, 100, 200, 1000 Ql) Vortex-Mixer Provette monouso Supporto per provette Acqua deionizzata o distillata Timer Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l'applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC. Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori è responsabilità dell'utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. MODALITÀ DI CONSERVAZIONE I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta se conservati a 2-8 C. 6. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (20-25 C) prima dell uso! 6.1. Micropiastra sensibilizzata I pozzetti con adesi gli antigeni inattivati della Chlamydia pneumoniae sono separabili e sigillati sotto vuoto. I pozzetti, pronti all uso, devono essere conservati a 2-8 C. Riporre i pozzetti non utilizzati nel sacchetto con il gel essiccante di silice. Il prodotto è stabile fino alla data di scadenza indicata sull etichetta se conservato a 2-8 C Coniugato Chlamydia pneumoniae IgA Il flacone contiene 20 ml di anticorpi anti-iga umane coniugati con perossidasi di rafano, tampone, stabilizzanti, conservanti e un colorante inerte rosso. La soluzione è pronta per l uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 5/24

6 6.3. Controlli I flaconi del Controllo Positivo, Cut-off e Controllo Negativo contengono 2 ml di soluzione pronta all uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Diluente campione IgA Il flacone contiene 105 ml di tampone fosfato, stabilizzanti, conservanti e un colorante giallo inerte. La soluzione, pronta all uso, viene usata per diluire i campioni. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Tampone di lavaggio (20x conc.) Il flacone contiene 50 ml di un tampone concentrato, detergenti e conservanti. Una volta aperto, il Tampone concentrato é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C. Diluire il contenuto con acqua deionizzata o distillata (1 + 19), es.: 10 ml di Tampone di Lavaggio ml di acqua deionizzata o distillata. Una volta diluito, il tampone é stabile 5 giorni se conservato a temperatura ambiente. Se sono presenti cristalli, scioglierli in bagnomaria a 37 C prima di diluire. Nota: Preparare solo il volume di tampone di lavaggio necessario per l esecuzione del dosaggio Soluzione TMB Substrato Il flacone contiene 15 ml di 3,3`,5,5`-Tetrametilbenzidina (TMB) e perossido di idrogeno pronto all uso. Conservare al buio. La soluzione é incolore o celeste chiaro. Nel caso in cui diventasse blu significa che é contaminata e non puó essere piú usata. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C Soluzione Stop Il flacone contiene 15 ml di acido solforico, 0.2 mol/l, pronto all uso. Una volta aperto, il prodotto é stabile fino alla data di scadenza indicata sul flacone se conservato a 2-8 C. 7. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Usare campioni di siero umano. Se il test viene fatto entro 24 ore dal prelievo i campioni possono essere conservati a 2-8 C; altrimenti devono essere aliquotati e congelati tra C. Agitare bene i campioni scongelati prima di diluirli. Evitare cicli ripetuti di congelamento/scongelamento Diluizione dei campioni Prima del test, diluire i campioni con il diluente campione IgA. Per esempio, pipettare nelle provette 10 Ql di campione + 1 ml di diluente e mescolare bene (Vortex). I controlli sono pronti all uso e non necessitano di diluizione. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 6/24

7 8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparazione del test Leggere bene le istruzioni prima di iniziare il dosaggio. Per ottenere risultati validi é indispensabile seguire esattamente le istruzioni. La seguente procedura è stata validata per l esecuzione manuale. Per una esecuzione su strumentazione automatica si consiglia di incrementare il numero di lavaggi da 3 (tre) a 5 (cinque), ed il volume della soluzione di lavaggio da 300Ql a 350Ql. Stabilire innanzitutto lo schema di distribuzione ed identificazione di campioni e controlli sul foglio di lavoro fornito con il kit. Inserire i pozzetti necessari nel supporto micropiastre. Utilizzare almeno: 1 pozzetto (es. A1) per il bianco (blank) 1 pozzetto (es. B1) per il controllo negativo 2 pozzetti (es. C1+D1) per il controllo Cut-off 1 pozzetto (es. E1) per il controllo positivo. È consigliato effettuare il dosaggio in duplicato. Eseguire il test nell ordine stabilito dalle istruzioni, senza pause. Utilizzare puntali nuovi e puliti per ogni campione e controllo. Regolare l incubatore a 37 ± 1 C 1. Pipettare 100 Ql di ogni controllo e dei campioni diluiti nei relativi pozzetti. Usare il pozzetto A1 per il Bianco. 2. Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva. 3. Incubare 1 ora ± 5 min a 37 ± 1 C. 4. Al termine dell incubazione, togliere la pellicola ed aspirare il liquido dai pozzetti. Successivamente lavare i pozzetti tre volte con 300 Ql di tampone di lavaggio. Evitare che la soluzione trabocchi dai pozzetti. L intervallo tra il lavaggio e l aspirazione deve essere almeno di 5 sec. Dopo il lavaggio picchiettare delicatamente i pozzetti con l apertura verso il basso su una carta assorbente per togliere completamente il liquido. Attenzione: Il lavaggio é una fase critica. Un lavaggio non accurato determina una cattiva precisione del test ed un innalzamento falsato delle densità ottiche. 5. Pipettare 100Ql di Coniugato Chlamydia pneumoniae anti-iga in tutti i pozzetti, escludendo quello con il Bianco (Blank). Coprire i pozzetti con la pellicola adesiva. 6. Incubare 30 min a temperatura ambiente ( C). Non esporre a fonti di luce diretta. 7. Ripetere il lavaggio come indicato al punto Pipettare 100Ql di Soluzione TMB-substrato in tutti i pozzetti. 9. Incubare precisamente per 15 min a temperatura ambiente ( C) al buio. 10. Pipettare 100Ql di Soluzione Stop in tutti i pozzetti, nello stesso ordine della soluzione TMB. Durante l incubazione il colore cambia dal blu al giallo. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 7/24

8 Attenzione: Campioni con un risultato altamente positivo possono causare precipitati scuri del cromogeno! Questi precipitati influenzano la lettura della densità ottica. È consigliato diluire i campioni con soluzione fisiologica NaCl, esempio 1+1. Poi diluire normalmente con tampone diluente IgA. Il risultato in UR viene moltiplicato per due. 11. Misurare l assorbanza di tutti i pozzetti a 450/620 nm entro 30 min dall aggiunta della Soluzione Stop. Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM/SEAC, far riferimento al relativo manuale Misurazione Regolare il fotometro per le micropiastre (ELISA-Reader) a zero usando il Bianco (Blank) in A1. Se, per motivi tecnici, non é possibile regolare il fotometro sottrarre l assorbanza del Bianco da tutti i valori delle altre assorbanze in modo da ottenere risultati attendibili. Misurare l assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e inserire tutti i valori ottenuti nel foglio di lavoro. É raccomandato fare una misurazione delle densità ottiche a doppia lunghezza d onda utilizzando i 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile calcolare la media dei valori delle assorbanze di tutti i duplicati. 9. RISULTATI 9.1. Validazione del test Il test é valido se risponde ai seguenti criteri: Bianco in A1: Valore di assorbanza inferiore a Controllo negativo in B1: Valore di assorbanza inferiore a Controllo Cut-off in C1 e D1: Valore di assorbanza tra e Controllo positivo in E1: Valore di assorbanza più alto o uguale al valore del Cut-Off 9.2. Calcolo dei risultati Il Cut-Off e la media dei valori di assorbanza dei controlli Cut-off. Esempio: Valore di assorbanza del controllo Cut-off valore di assorbanza del controllo Cut-off 0.42 = 0.86/2= 0.43 Cut-Off = Interpretazione dei risultati * X I campioni con valore di assorbanza superiore al Cut-off + 10% sono da considerare Positivi. X I campioni con valore di assorbanza compreso nel range del Cut-off ± 10% non sono identificabili come positivi o negativi e quindi il risultato viene considerato Dubbio. In questo caso é raccomandato di ripetere il test dopo 2 o 4 settimane con un campione fresco. Se il risultato é ancora incerto il campione viene considerato Negativo. X I campioni con valore di assorbanza inferiore al Cut-off -10% sono da considerare Negativi. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 8/24

9 * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastra RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d onda: 450, 405, 620 nm, permettendo l ampliamento del range di lettura Risultati in Unità RADIM [UR] Assorbanza media del campione x 10 = [Unità RADIM = UR] Cut-Off Esempio: x 10 = 28 UR (Unità RADIM) 0.43 Cut-Off : 10 UR Dubbio: 9-11 UR Negativo: <9 UR Positivo: >11 UR 10. CARATTERISTICHE DEL TEST Precisione Riproducibilità: Interdosaggio n Media (UR) CV (%) Siero pos Siero pos Ripetibilità: Intradosaggio n Media (OD) CV (%) Siero pos Siero pos Specificità diagnostica La specificità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica é > 95% Sensibilità diagnostica La sensibilità diagnostica é la probabilità del test di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica é pari a 88.9% Possibili interferenze Campioni emolitici, lipemici ed itterici contenenti fino a 10 mg/ml di emoglobina, 5 mg/ml di trigliceridi e 0,2 mg/ml di bilirubina non hanno presentato fenomeni di interferenza nel presente test. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 9/24

10 11. LIMITI DELLA PROCEDURA Una contaminazione batterica o ripetuti cicli di congelamento-scongelamento possono alterare i valori delle assorbanze. La diagnosi di una malattia infettiva non deve essere fatta soltanto sulla base della risultanza di un unico test. Una diagnosi precisa deve prendere in considerazione anche l anamnesi, i sintomi del paziente e i dati derivanti dalle analisi sierologiche. I risultati sierologici provenienti da pazienti immunosoppressi e dai neonati hanno un valore limitato. L antigene di Chlamydia pneumoniae che è adeso sulle micropiastre è costituito da corpi elementari. In caso di sieri contenenti anticorpi nei confronti di LPS e MOMP non può essere esclusa una contaminazione crociata con Chlamydia trachomatis. 12. PRECAUZIONI E AVVERTENZE In ottemperanza alla direttiva Europea 98/79/EC l uso dei dispositivi medico-diagnostici in vitro è inteso da parte del fabbricante ad assicurare la congruenza, le prestazioni e la sicurezza del prodotto. Di conseguenza la procedura analitica, le informazioni, le precauzioni e le avvertenze contenute nelle istruzioni per l uso devono essere seguite scrupolosamente. L uso dei kit con analizzatori e attrezzature similari deve essere previamente convalidato. Qualunque cambiamento nel progetto, nella composizione o struttura e nella procedura analitica, così come qualunque uso dei kit in associazione ad altri prodotti non approvati dal fabbricante non è autorizzato; l utilizzatore stesso è responsabile di questi eventuali cambiamenti. Il fabbricante non è responsabile di falsi risultati e incidenti che possano essere causati da queste ragioni. Il fabbricante non è responsabile di qualunque risultato ottenuto attraverso l esame visivo dei campioni dei pazienti. Solo per uso diagnostico in-vitro. Tutti i componenti di origine umana impiegati nella produzione dei reagenti contenuti nel kit sono stati trovati non reattivi ad Anti-HIV-Ab, Anti-HCV-Ab e HBsAg. Nonostante ciò tutti i materiali devono comunque essere considerati potenzialmente contagiosi e infettivi. La sodio azide, contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare la formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Non scambiare reagenti e micropiastre di lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri fabbricanti insieme ai reagenti di questo kit. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza indicata sull etichetta. Utilizzare soltanto attrezzatura (puntali, dispensatori) e materiale di laboratorio puliti. Non scambiare i tappi dei flaconi in modo da evitare contaminazioni crociate. Richiudere bene i flaconi immediatamente dopo l uso per evitare fenomeni di evaporazione e contaminazione microbica dei reagenti. Una volta aperti e dopo relativo stoccaggio verificare i reagenti, prima dell uso, al fine di escludere una loro eventuale contaminazione microbica. Per evitare contaminazioni crociate e risultati erroneamente alti pipettare campioni e reagenti con molta precisione sul fondo dei pozzetti, evitando la formazione di schizzi. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 10/24

11 ATTENZIONE: Bronidox L, nella concentrazione usata, non presenta quasi alcun rischio di tossicità sulla pelle e sulle mucose. ATTENZIONE: L acido solforico irrita occhi e pelle! In caso di contatto sciacquare immediatamente con abbondante acqua e contattare un medico. Mantenere fuori dalla portata dei bambini Smaltimento In genere tutte le sostanze chimiche vengono considerate rifiuti tossici. Lo smaltimento di questo tipo di materiale viene regolato da leggi nazionali e regolamenti regionali. Per ulteriori informazioni contattare le autorità locali o le società autorizzate allo smaltimento dei rifiuti. 13. SCHEMA DEL DOSAGGIO Chlamydia pneumoniae IgA E.W. Preparazione Preparare campioni, controlli e reagenti come indicato. Stabilire lo schema di distribuzione ed identificazione di campioni e controlli sull apposito foglio fornito nel kit. Inserire la quantità di pozzetti necessari nel supporto per micropiastre. Procedimento Bianco (A1) NEG POS C/O Campione (diluito 1+100) NEG - 100Ql POS Ql - - C/O Ql - Campione (diluito 1+100) Ql Coprire la micropiastra con la pellicola Incubare per 1 ora ± 5 min a 37 C ± 1 C Lavare 3 x con 300Ql di tampone di lavaggio CONJ - 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql Coprire la micropiastra con la pellicola Incubare per 30 min a temperatura ambiente Lavare 3 x con 300Ql di tampone di lavaggio TMBDSUBS 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql Incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio STOP 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql Misurazione fotometrica a 450 nm (lunghezza d onda di riferimento: 620 nm) M393 Rev.0 07/2005 Pag. 11/24

12 Enzyme immunoassay for the qualitative determination of IgA-class antibodies against Chlamydia Pneumoniae in human serum 1. INTRODUCTION Only for in-vitro diagnostic use Chlamydiae are no mobile, Gram negative and obligatory intracellular growing bacteria which form characteristic inclusions within the cytoplasm of parasitized cells. They are easily visible in the light microscope. Three different Chlamydia species pathogenic for humans are known: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci, and one species only pathogenic for animals (C. pecorum). Chlamydia trachomatis is the most prevalent agent of sexually transmitted diseases worldwide ( million cases) and the number of infections is constantly growing. Pregnant women infected with C. trachomatis may transmit these bacteria during childbirth, causing conjunctivitis or pneumonia in newborns. Untreated cases of chlamydial infection can lead to chronic salpingitis, possibly resulting in ectopic pregnancy or infertility. In males, C. trachomatis is a major cause of non-gonococcal urethritis. A severe problem in Chlamydia infections is the frequent asymptomatic insidious course which may result in the initiation of chronic diseases. In many instances primary infections are not recognized and only the sequelae caused by ascended, persisting agents are diagnosed. Species Mechanism of infection Disease Diagnostics C. trachomatis Direct or sexual transmission: The primary site of infection usually is the mucous membrane of the eye or the urogenital tract Lymphogranuloma venereum (LGV) Trachoma Inclusion conjunctivitis of neonates and adults; Cervicitis, salpingitis, urethritis, epididymitis, proctitis and Serology PCR C. pneumoniae Infiltration of the mucous membrane of the respiratory tract C. psittaci Inhalation of feces from infected birds; contact with infected avian viscera pneumonia of newborns Respiratory diseases discussed: endocarditis, coronary heart diseases Ornithosis (Psittacosis) Microscopy Infection may be identified by Microscopy: Giemsa stain PCR Serology: Detection of antigens by ELISA Detection of antibodies by IF, EIA, ELISA M393 Rev.0 07/2005 Pag. 12/24

13 2. INTENDED USE The Chlamydia pneumoniae IgA E.W. is intended for the qualitative determination of IgA class antibodies against Chlamydia pneumoniae in human serum. 3. PRINCIPLE OF THE ASSAY The qualitative immunoenzymatic determination of IgA-class antibodies against Chlamydia pneumoniae is based on the ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) technique. Microtiter strip wells are precoated with Chlamydia pneumoniae antigens to bind corresponding antibodies of the specimen. After washing the wells to remove all unbound sample material horseradish peroxidase (HRP) labelled anti-human IgA conjugate is added. This conjugate binds to the captured Chlamydia pneumoniae-specific antibodies. The immune complex formed by the bound conjugate is visualized by adding Tetramethylbenzidine (TMB) substrate which gives a blue reaction product. The intensity of this product is proportional to the amount of Chlamydia pneumoniae-specific IgA antibodies in the specimen. Sulphuric acid is added to stop the reaction. This produces a yellow endpoint colour. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microwell plate reader. 4. MATERIALS 4.1. Reagents supplied MTP Chlamydia pneumoniae Coated Microplate (IgA): 12 breakapart 8- well snap-off strips coated with Chlamydia pneumoniae antigen; vacuum sealed, in resealable aluminium foil. DIL IgA Sample Diluent ***: 1 bottle containing 105 ml of ready to use buffer for sample dilution; ph 7.2 ± 0.2; coloured yellow. STOP Stop Solution: 1 bottle containing 15 ml of sulphuric acid, 0.2 mol/l; ready to use. WASH Washing Solution (20x conc.)*: 1 bottle containing 50 ml of a 20-fold concentrated buffer (ph 7.2 ± 0.2) for washing the wells. CONJ Chlamydia pneumoniae anti-iga Conjugate**: 1 bottle containing 20 ml of rabbit antibody anti-human IgA labelled with peroxidase; coloured red, ready to use. TMBDSUSB TMB Substrate Solution: 1 bottle containing 15 ml of 3,3',5,5'- tetramethylbenzidine (TMB); ready to use. POS Chlamydia pneumoniae IgA Positive Control***: 1 bottle containing 2 ml of a ready to use control solution; coloured yellow. C/O Chlamydia pneumoniae IgA Cut-off Control***: 1 bottle containing 2 ml of a ready to use control solution; coloured yellow. NEG Chlamydia pneumoniae IgA NegativeControl***: 1 bottle containing 2 ml of a ready to use control solution; coloured yellow. * contains: 0.2 % Kathon ** contains: 0.2 % Bronidox L *** contains: 0.1 % Kathon and 0.095% Sodium Azide M393 Rev.0 07/2005 Pag. 13/24

14 4.2. Materials supplied 1 Strip holder 2 Cover foils 1 Instruction for use 1 Distribution and identification plan for samples and controls 4.3. Materials and Equipment needed Manual Test ELISA microwell plate reader, equipped for the measurement of absorbance at 450/620nm Incubator 37 C Manual or automatic equipment for rinsing wells Micropipettes and disposable plastic tips (10, 100, 200, 1000 Ql) Vortex tube mixer Disposable tubes Pipe stand Deionised or (freshly) distilled water Timer AutomaticTest This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. STABILITY AND STORAGE The reagents are stable up to the expiry date stated on the label when stored at C. 6. REAGENT PREPARATION It is very important to bring all the reagents to room temperature (20 25 C) before starting the test run! 6.1. Coated Microplate The ready to use breakapart snap-off strips are coated with Chlamydia pneumoniae antigen. Store at C. The strips are vacuum sealed. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed in the aluminium foil along with the desiccant supplied. Once opened are stable until expiry date indicated on the label, if stored at 2 8 C Chlamydia pneumoniae anti-iga Conjugate The bottle contains 20 ml of a solution with anti-human-iga labelled with horseradish peroxidase, buffer, stabilizers, preservatives and an inert red dye. The solution is ready to use. Store at C. Once opened, it is stable until the expiry date indicated on the vial s label, if stored at 2 8 C. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 14/24

15 6.3. Controls Positive Control, Cut-off and Negative Control contain 2 ml of a solution ready to use. Store at C. Once opened, controls are stable until the expiry date indicated on the vial s label if stored at 2 8 C IgA Sample Diluent The bottle contains 105 ml of phosphate buffer, stabilizers, preservatives and an inert yellow dye. It is used for the dilution of the patient specimen. This ready to use solution has to be stored at C. Once opened, it is stable until the expiry date indicated on the vial s label, if stored at 2 8 C Washing Solution (20X conc.) The bottle contains 50 ml of a concentrated buffer, detergents and preservatives. Once opened the concentrate Washing Solution is stable until the expiry date indicated on the vial s label if stored at 2 8 C. Dilute washing solution with deionized or distilled water 1+19 (e.g. 10 ml of washing solution ml of deionized or distilled water). Once diluted, buffer will keep for 5 days if stored at room temperature. Crystals in the solution disappear by warming up to 37 C in a water bath. Note: Prepare only the volume of washing solution necessary for the assay s carrying out TMB Substrate Solution The bottle contains 15 ml of a tetramethylbenzidine/hydrogen peroxide system. The reagent is ready to use and has to be stored at C, away from the light. The solution should be colourless or could have a slight blue tinge. If the substrate turns into blue, it may have become contaminated and should be discharged. Once opened it is stable until the expiry date indicated on the vial s label if stored at 2 8 C Stop Solution The bottle contains 15 ml of 0.2 M sulphuric acid solution. This ready to use solution has to be stored at C. Once opened, it is stable until the expiry date indicated on the vial s label if stored at C. 7. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Human serum may be used. If the assay is performed within 24 hours after sample collection, the specimen should be kept at C; otherwise they should be aliquoted and stored deep-frozen ( C). If samples are stored frozen, mix thawed samples well before testing. Avoid repeated freezing and thawing Sample Dilution Before assaying, all samples should be diluted with IgA Sample Diluent. Dispense 10Ql of sample and 1mL of IgA Sample Diluent into tubes to obtain a dilution and thoroughly mix with a Vortex. Controls are ready to use and must not be diluted. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 15/24

16 8. ASSAY PROCEDURE 8.1. Test Preparation Please read the test protocol carefully before performing the assay. Result reliability depends on strict adherence to the test protocol as described. The following test procedure is only validated for manual procedure. If performing the test on ELISA automatic systems we recommend to increase the washing steps from three to five and the volume of washing solution from 300Ql to 350Ql to avoid washing effects. Prior to commencing the assay, the distribution and identification plan for all specimens and controls should be carefully established on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Please allocate at least: 1 well (e.g. A1) for the blank, 1 well (e.g. B1) for the negative control, 2 wells (e.g. C1+D1) for the cut-off control and 1 well (e.g. E1) for the positive control. It is recommended to perform the assay in duplicate. Perform all assay steps in the order given and without any appreciable delays between the steps. A clean, disposable tip should be used for dispensing each control and sample. Adjust the incubator to 37 ± 1 C. 1. Dispense 100Ql of controls and diluted samples into their respective wells. Leave well A1 for Blank. 2. Cover wells with the foil supplied in the kit. 3. Incubate for 1 hour ± 5 min at 37±1 C. 4. When incubation has been completed, remove the foil, aspirate the content of the wells and wash each well three times with 300Ql of Washing Solution. Avoid overflows from the reaction wells. The soak time between each wash cycle should be >5sec. At the end carefully remove remaining fluid by tapping strips on tissue paper prior to the next step! Note: Washing is critical! Insufficient washing results in poor precision and falsely elevated absorbance values. 5. Dispense 100Ql of Chlamydia pneumoniae anti-iga Conjugate into all wells except for the blank well (e.g. A1). Cover with foil. 6. Incubate for 30 min at room temperature ( C). Do not expose to direct sunlight. 7. Repeat step Dispense 100Ql of TMB Substrate Solution into all wells 9. Incubate for exactly 15 min at room temperature ( C) in the dark. 10. Dispense 100Ql of Stop Solution into all wells in the same order and at the same rate as for the TMB Substrate Solution. Any blue colour developed during the incubation turns into yellow. Note: Highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen! These precipitates have an influence when reading the optical density. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 16/24

17 Predilution of the sample with physiological sodium chloride solution, for example 1+1, is recommended. Then dilute the sample with IgA Sample Diluent and multiply the results in UR by Measure the absorbance of the specimen at 450/620nm within 30 min after addition of the Stop Solution. While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual Measurement Adjust the ELISA Microwell Plate Reader to zero using the Blank in well A1. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the Blank in well A1, subtract the absorbance value of well A1 from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results! Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record all the absorbance values measured in the distribution and identification plan. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. 9. RESULTS* 9.1. Assay Validation Criteria The assay is considered valid if the following criteria are met: Blank in A1: Absorbance value lower than Negative control in B1: Absorbance value lower than Cut-off control in C1 and D1: Absorbance value between and Positive control in E1: Absorbance value equal to or greater than the cut-off value Calculation of Results The cut-off is the mean absorbance value of the Cut-off control determinations. Example: Absorbance value Cut-off control absorbance value Cut-off control 0.42 = 0.86 / 2 = 0.43 Cut-off = Interpretation of Results X Samples with an absorbance value higher than the Cut-off +10% are considered as POSITIVE. X Samples with an absorbance value falling into the range of Cut-off ± 10% should not be considered as clearly positive or negative. The result should be considered in the GREY ZONE. It is recommended to repeat the test again 2-4 weeks later with a fresh sample. If results in the second test are again in the grey zone the sample has to be considered NEGATIVE. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 17/24

18 X Samples with an absorbance value lower than the Cut-off -10% are considered as NEGATIVE. * While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range Results in RADIM Units [UR] Patient (mean) absorbance value x 10 = [RADIM Units = UR] Cut-off Example: x 10 = 28 UR (RADIM Units) 0.48 Cut-off: 10 UR Grey zone: 9-11 UR Negative: <9 UR Positive: >11 UR 10. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS Precision Reproducibility: Interassay n Mean (UR) CV (%) Pos. Serum Pos. Serum Repeatability: Intraassay n Mean (OD) CV (%) Pos. Serum Pos. Serum Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. It is > 95 % Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. It is 88.9 % Possible Interferences Interferences with hemolytic, lipemic or icteric sera are not observed up to a concentration of 10 mg/ml hemoglobin, 5 mg/ml triglycerides and 0.2 mg/ml bilirubin. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 18/24

19 11. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. Diagnosis of an infectious disease should not be established on the basis of a single test result. A precise diagnosis should take into consideration clinical history, symptomatology as well as serological data. In immunsuppremized patients and newborns serological data only have restricted value. The Chlamydia pneumoniae antigen which is coated on the plates is comprised of elementary bodies. A cross reaction with Chlamydia trachomatis cannot be excluded with sera containing antibodies to LPS and MOMP. 12. PRECAUTIONS AND WARNINGS In compliance with European directive 98/79/EC the use of the in vitro diagnostic medical devices is intended by the manufacturer to secure suitability, performances and safety of the product. Therefore the test procedure, the information, the precautions and warnings in the instructions for use have to be strictly followed. The use of the test kits with analyzers and similar equipment has to be validated. Any change in design, composition and test procedure as well as for any use in combination with other products not approved by the manufacturer is not authorized; the user himself is responsible for such changes. The manufacturer is not liable for false results and incidents for these reasons. The manufacturer is not liable for any results by visual analysis of the patient samples. Only for in-vitro diagnostic use. All components of human origin used for the production of these reagents have been tested for anti-hiv antibodies, anti-hcv antibodies and HBsAg and have been found to be nonreactive. Nevertheless, all materials should still be regarded and handled as potentially infectious. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. Do not interchange reagents or strips of different production lots. No reagents of other manufacturers should be used along with reagents of this test kit. Do not use reagents after expiry date stated on the label. Use only clean pipette tips, dispensers, and lab ware. Do not interchange screw caps of reagent vials to avoid cross-contamination. Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After first opening and subsequent storage check conjugate and control vials for microbial contamination prior to further use. To avoid cross-contamination and falsely elevated results pipette patient samples and dispense reagents without splashing accurately to the bottom of wells. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 19/24

20 WARNING: In the used concentration Bronidox L has hardly any toxicological risk upon contact with skin and mucous membranes! WARNING: Sulphuric acid irritates eyes and skin. Upon contact with the eyes, rinse thoroughly with water and consult a doctor! Keep out of the reach of children Disposal Considerations Residues of chemicals and preparations are generally considered as hazardous waste. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose hazardous waste. M393 Rev.0 07/2005 Pag. 20/24

21 13. ASSAY SCHEME Chlamydia pneumoniae IgA E.W. Assay preparation Prepare samples, controls and reagents as described. Establish the distribution and identification plan for all specimens and controls on the result sheet supplied in the kit. Select the required number of microtiter strips or wells and insert them into the holder. Blank (e.g. A1) Assay procedure NEG POS C/O Sample (diluted 1+100) NEG - 100Ql POS Ql - - C/O Ql - Sample (diluted 1+100) Ql Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 1 h ± 5 min at 37 C ± 1 C Wash each well three times with 300Ql of washing solution CONJ - 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql Cover wells with foil supplied in the kit Incubate for 30 min at room temperature Wash each well three times with 300Ql of washing solution TMBDSUBS 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql Incubate for exactly 15 min at room temperature in the dark STOP 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql 100Ql Photometric measurement at 450 nm (reference wavelength: 620 nm) M393 Rev.0 07/2005 Pag. 21/24

22 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, UVWXYZ[, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF LOT codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / cdefcgh ijklgmnkh o ipjpqqrstph / Refarans veye sipariu numarsv / referenwní nebo objednací wíslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / ipjntep / parti / šarze Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / {QrjkQ mtp so} h / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic invitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / qfp in vitro efpqmd nfco jo / in vitro diagnostik kullanvm / pro pouzití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/7/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / ƒ Qpm CE rf ckfmknfcoh ke qtph IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzü üne göre CE iuareti / CE oznawení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / ˆ sp} nkšh 2-8 C / 2-8 C da saklayvnvz / skladovat p i 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / cpnp crš Œrnpf pig / tarafvndan üretilmiutir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bfkskqfcgh ctmešmkh Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / Šµ kšsršnrtnr nfh ke qtrh jo h / kullanvmda bauvurulacak bilgiler / Sledujte návod k pouzití 96 Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / ripjcrt qfp 96 nr n / 96 test için yeterli / dostawující pro 96 test M393 Rev.0 07/2005 Pag. 22/24

23 RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / µrjkµ mtp p µkmgµ h / Referans Targhi / referenwní datum RCNS Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / pmp Š n npf µr / ile karvutvrma / rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / pifkmf µ mk -pir npqµ mk mrjg / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M393 Rev.0 07/2005 Pag. 23/24

24 BIBLIOGRAFIA - LITERATURE Hoyme U.B., Spitzbart H. (1996). Past and current prevalence of Chlamydia trachomatis in women in Germany. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the third meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, Sept. p Paavonen J. (1996). Chlamydia trachomatis: A major cause of mucopurulent cervicitis and pelvic inflammatory disease in women. In: Sexually Transmitted Diseases. Advances in Diagnosis and Treatment. Curr. Probl. Dermatol. Elsner P., Eichmann A. (eds.), Basel, Karger, Vol. 24, pp Petersen E.E., Clad A. (1995). Genitale Chlamydieninfektionen. Deutsches Ärzteblatt 92, Heft 5, A Weström L. (1996). Consequences of genital Chlamydia infections in women. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the third meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, Sept. pp Weström L.V. (1996). Chlamydia and its effect on reproduction. J. Brit. Fertil. Soc. 1: RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.it -