FT4 EIA WELL REF KT7EW REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS. Italiano p. 3 English p. 12. M320 Rev.4 01/ Pag. 1/24

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1 FT4 EIA WELL REF KT7EW 96 Italiano p. 3 English p. 12 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS M320 Rev.4 01/ Pag. 1/24

2 Reag. Quant. MTP 1 x 96 CAL CONJ CTR WASH TMB SUBS STOP 6 x 1 ml 2 x 12 ml 2 x 1 ml 1 x 50 ml Conc. 1 x 15 ml 1 x 15 ml 1 x 14 ml Pronti per l'uso Ready for use Liofilizzato. Lyophilized Pronto per l'uso Ready for use Liofilizzato. Lyophilized Liquido Liquid Liquido Liquid Pronto per l'uso Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M320 Rev.4 01/2009 Pag. 2/24

3 DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELLA TIROXINA LIBERA (FT4) NEL SIERO UMANO. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE Il dosaggio della L-Tiroxina (T4) e della L-Triiodotironina (T3) fornisce utili informazioni sulla valutazione clinica della ghiandola tiroidea il cui stato funzionale nella maggioranza delle condizioni patologiche non può essere dedotto soltanto dall analisi della sua forma o dimensione. Disfunzioni della ghiandola tiroidea possono produrre un aumento o una diminuzione della secrezione di T4 e di T3, che influenzano il consumo di ossigeno, la produzione di energia e il metabolismo dei carboidrati, dei lipidi e delle proteine. I livelli sierici di T4 e T3 sono regolati da un meccanismo di feedback negativo che coinvolge il TSH. Una diminuzione di T4 o di T3 stimola la produzione di TSH e quindi la secrezione di ormoni tiroidei, mentre un aumento di T4 o di T3 ha l effetto opposto. Il T4 è sintetizzato dallo strato di cellule epiteliali dei follicoli tiroidei e viene accumulato nella ghiandola all interno della sostanza colloide. La scissione di questa sostanza, mediata dal TSH, provoca il rilascio del T4 nel circolo. Gli ormoni tiroidei vengono trasportati dalla tiroide agli organi bersaglio legati a proteine plasmatiche, quali la thyroxine-binding globulin (TBG), la thyroxinebinding prealbumin (TBPA) e l albumina. Una piccola parte di T4 (circa lo 0.03 % del totale) circola in forma libera (FT4) e si ritiene che tale frazione sia l ormone fisiologicamente attivo che penetra nelle cellule, stimola il metabolismo e controlla il feedback sull ipofisi. L FT4 rappresenta inoltre il principale precursore del T3. Il livello di FT4 è indipendente dalla concentrazione delle proteine leganti e pertanto è ben correlato con lo stato funzionale della tiroide. Un aumento o una diminuzione del legame del T4 da parte delle proteine leganti produce un aumento o una diminuzione della concentrazione di T4 totale senza conseguenti sintomi di ipertiroidismo o ipotiroidismo. Il dosaggio dell FT4 può essere quindi impiegato per discriminare i pazienti realmente iper- o ipotiroidei i cui valori di T4 totale risultino superiori o inferiori ai valori normali. Ad esempio, soggetti in terapia con estrogeni o contraccettivi orali, in gravidanza, o con livelli congenitamente elevati di proteine di trasporto presentano valori di FT4 nella norma. In pazienti con ridotta capacità legante delle proteine di trasporto (terapia con androgeni o farmaci che interferiscono con i siti leganti, quali salicilati, fenitoina, fenilbutazone, difenilidantoina) la concentrazione di FT4 apparirà egualmente nei limiti di normalità. Nei casi di sospetta malfunzionalità tiroidea che presentino valori borderline di FT4, è raccomandato il dosaggio dell FT3 e del TSH con metodi ad alta sensibilità. 2. PRINCIPIO DEL METODO M320 Rev.4 01/2009 Pag. 3/24

4 Il presente kit è basato sul metodo del dosaggio immunoenzimatico competitivo (EIA) ed impiega come fase solida pozzetti sensibilizzati con anticorpi specifici anti-t 4. Aggiungendo nei pozzetti il siero del paziente ed il coniugato (T 3 coniugato con perossidasi di rafano, metodo dell analogo), si ha la competizione tra T 4 sierica e coniugato per i siti leganti presenti sugli anticorpi. Tale competizione è attentamente calibrata in modo da perturbare il meno possibile l equilibrio ormone libero - ormone legato, permettendo quindi un dosaggio corretto della frazione libera nel campione in esame. Al termine dell'incubazione, il materiale non legato viene rimosso mediante aspirazione e lavaggio. L'attività enzimatica rimasta fissata sulla fase solida, sarà quindi inversamente proporzionale alla concentrazione di FT 4 presente nei calibratori e nei campioni, e viene evidenziata incubando i pozzetti con una soluzione di Cromogeno (Tetrametilbenzidina, TMB) in Tampone Substrato. L'intensità di colore sviluppato viene misurata mediante spettrofotometro a 450 nm e a 405 nm. 3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA' I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. Il kit deve essere conservato a 2-8 C. La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. Una volta aperto il kit è stabile 2 mesi a 2-8 C. 3.1 Reagenti Specifici MTP Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti divisibili singolarmente, sensibilizzati con anticorpi specifici anti-t 4 (coniglio). I pozzetti non utilizzati devono essere riposti a 2-8 C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente. CAL Calibratori: 6 flaconi (1 ml) di T 4 in matrice sierica. Liofilizzati. Ricostituire con 1 ml di acqua distillata. Dopo la ricostituzione, i calibratori possono essere conservati a 2-8 C per 2 mesi. Conservante: Neomicina. N.B.: verificare sempre l'esatta concentrazione sul foglio di C.Q. CTR Sieri di Controllo: 2 flaconi (1 ml) contenenti T 4 in matrice sierica, a due diverse concentrazioni. Liofilizzati. Ricostituire con 1 ml di acqua distillata. Dopo la ricostituzione, i calibratori possono essere conservati a 2-8 C per 2 mesi. Conservante: Neomicina. N.B.: verificare sempre l'esatta concentrazione sul foglio di C.Q. CONJ Coniugato Enzimatico: 2 flaconi (12 ml) di T 3 coniugata con perossidasi di rafano (HRPO), in tampone HEPES e stabilizzanti. Pronto per l'uso. Conservante: Neomicina. 3.2 Reagenti Comuni per tutti i kit della Linea Ormonale RADIM M320 Rev.4 01/2009 Pag. 4/24

5 WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata, REF SL01): 1 flacone (50 ml) di PBS e Tween 20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Portare il contenuto del flacone a 500 ml con H 2 O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli, ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. Dopo diluizione il tampone di lavaggio è stabile 30 giorni a 2-8 C. TMB Cromogeno: 1 flacone (15 ml) di Tetrametilbenzidina (TMB) in tampone citrato-fosfato e DMSO. Liquido. SUBS Tampone Substrato: 1 flacone (15 ml) di Tampone citrato-fosfato e H 2 O 2. Liquido. N.B.: Per ottenere la Soluzione Substrato, miscelare in parti uguali il Cromogeno con il Tampone Substrato utilizzando un flacone scuro e ben pulito; tenere la soluzione così preparata al riparo dalla luce. Dispensare la soluzione entro 1 ora dal momento della preparazione. STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 ml) di H 2 SO 4 1N. Pronto per l'uso. CPA Copripiastra adesivo Bustina di plastica trasparente con minigrip 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 4.1 Dosaggio Manuale Micropipette automatiche a punte intercambiabili a volume variabile. Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi. Agitatore per micropiastre regolabile a 1200 rpm. Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell'intervallo A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm. Carta millimetrata. H 2 O distillata. 4.2 Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. E possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 5/24

6 Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare l ottenimento di dati clinici non attendibili. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Accertarsi che tutta la strumentazione usata (vetreria, agitatore e lavatore per micropiastre, spettrofotometro, stufa termostatata, frigoriferi usati per la conservazione dei kit e dei campioni) sia perfettamente funzionante, adeguatamente calibrata e sia soggetta ad un regolare piano di manutenzione. Un uso non accurato di ognuno di questi strumenti può produrre errori metodologici che possono condizionare la riproducibilità e l affidabilità dei risultati ottenuti. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da M320 Rev.4 01/2009 Pag. 6/24

7 immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. 6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su siero. I campioni fortemente lipemici od emolizzati devono essere scartati. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 1 giorno; per periodi più lunghi conservarli a -20 C. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i campioni. 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO * Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. 7.1 Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori, Sieri di Controllo e Campioni. 7.2 Dispensare 50 µl di ciascun Calibratore, dei Sieri di Controllo e dei Campioni nei rispettivi pozzetti. 7.3 Dispensare 200 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti, eccetto quelli del Bianco. 7.4 Coprire la micropiastra con il foglio adesivo ed agitare delicatamente. 7.5 Incubare per 90±5 minuti a temperatura ambiente (18-25 C), in agitazione orbitale a 1200 rpm. 7.6 Rimuovere il foglio adesivo ed aspirare accuratamente la miscela di incubazione da tutti i pozzetti. 7.7 Lavare i pozzetti 4 volte con 350 µl di Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare completamente il liquido da tutti i pozzetti. 7.8 Dispensare 200 µl della soluzione Substrato-Cromogeno (vedi paragrafo reagenti). M320 Rev.4 01/2009 Pag. 7/24

8 7.9 Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (18-25 C), in agitazione orbitale a 1200 rpm, al riparo dalla luce troppo intensa Dispensare 100 µl di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow, utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere effettuata entro 20 minuti dal termine del dosaggio. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p CALCOLO DEI RISULTATI Al fine di ottenere una migliore sensibilità, il presente metodo utilizza una lettura spettrofotometrica a due lunghezze d'onda (450 e 405 nm). Per campioni con concentrazioni di FT 4 comprese tra 10 e 80 pg/ml dovrà essere utilizzata la misura a 450 nm; per campioni con livelli di FT 4 inferiori a 10 pg/ml, il calcolo dovrà essere effettuato sulle misure a 405 nm. Disegnare la curva di calibrazione su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le dosi dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative a ciascun campione si otterranno le corrispondenti concentrazioni di FT 4 in pg/ml. 9.1 Esempio di Calcolo I valori sotto riportati devono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione Assorbanza 450 nm FT 4 Assorbanza 405 nm FT 4 Calibratore 0 pg/ml > Calibratore 5 pg/ml > Calibratore 10 pg/ml === Calibratore 20 pg/ml === Calibratore 40 pg/ml === Calibratore 80 pg/ml === Campione pg/ml === 9.2 Valori Normali M320 Rev.4 01/2009 Pag. 8/24

9 I valori sierici di FT 4 di seguito riportati sono soltanto indicativi poiché influenzati da fattori contingenti quali clima, area geografica e dieta. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento. Valori normali: 7 18 pg/ml (9 23 pmoli/l) Ipotiroidismo: < 7 pg/ml ( < 9 pmoli/l) Ipertiroidismo: > 18 pg/ml ( > 23 pmoli/l) 9.3 Fattore di Conversione pmoli/l = (pg/ml : 777) x Criteri di accettazione Prima di procedere al calcolo dei risultati, verificare che la concentrazione del siero di controllo rientri nel range di accettazione descritto nel Foglio di Controllo Qualità. 10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Il presente metodo analitico ha mostrato le seguenti reazioni crociate: Crossreagente % di crossreazione 3 iodo-l-tirosina (MIT) 0 3, 5 diiodo-l-tirosina (DIT o T2) 0 3, 5 diiodo-l-tironina 0 3, 3, 5, triiodo-l-tironina (T3) 3.3% 3, 3, 5 triiodo-l-tironina (r T3) 6.4% 3, 3, 5, 5 tetraiodo-l-tironina (T4) > 100% 3, 3, 5, 5 tetraiodo-d-tironina (D-T4) > 100% 10.2 Sensibilità Analitica La sensibilità analitica è stata calcolata sulla curva di calibrazione ed espressa come minima dose significativamente distinguibile dalla risposta del Calibratore Zero (valore medio OD - 2 D.S.). Tale dose è risultata inferiore ad 1 pg/ml Sensibilità Funzionale La sensibilità funzionale, espressa come dose a cui corrisponde un CV intersaggio del 20%, è risultata inferiore ad 1,5 pg/ml Precisione La precisione é stata valutata misurando la ripetibilità e la riproducibilità (variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su sieri a differenti concentrazioni di FT 4. Ripetibilità (Intra-saggio) M320 Rev.4 01/2009 Pag. 9/24

10 Siero Media ± D.S. C.V. Replicati (pg/ml) % n. a 6.2 ± b 13.1 ± c 27.2 ± d 72.1 ± Riproducibilità (Inter-saggio) Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi (pg/ml) % n. a 11.5 ± b 26.2 ± c 69.9 ± Test di Diluizione Il dosaggio dell ormone libero è indipendente, entro un certo limite, dalla concentrazione delle proteine vettrici; il valore di FT 4 misurato in uno stesso campione a diverse diluizioni si mantiene infatti costante. Il test è stato eseguito in due modalità differenti: a) dispensando volumi decrescenti dello stesso campione; b) dispensando lo stesso volume del campione indiluito e diluito in una matrice non contenente proteine vettrici. a) b) Siero Volume Dose misurata pg/ml Siero Volume Dose misurata pg/ml # 1 50 μl 28.5 # 2 50 μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl 18.8 Siero Diluizione Dose misurata pg/ml Siero Diluizione Dose misurata pg/ml # 1 1/ # 2 1/1 28 1/ / / /2 23 1/ / /5 22 1/ LIMITI DEL DOSAGGIO M320 Rev.4 01/2009 Pag. 10/24

11 I risultati del dosaggio devono essere interpretati con cautela e convalidati da valutazioni cliniche ed ulteriori prove diagnostiche 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20 M320 Rev.4 01/2009 Pag. 11/24

12 ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF FREE THYROXINE HUMAN SERUM. FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS The dosage of L-thyroxine (T4) and L-triiodothyronine (T3) gives us useful information for the clinical evaluation of the thyroid gland as its functional state of the gland cannot be deduced only from its size and shape. Dysfunction of the thyroid gland may lead to either an increase or a decrease of T4 or T3 release affecting oxygen consumption, energy production, and carbohydrate, fat and protein metabolism. Blood levels of free thyroid hormones T4 and T3 are regulated by a negative feedback mechanism involving the TSH. A decrease of T4 or T3 stimulates the production of TSH and the release of thyroid hormones while an increase has the opposite effect. T4 is synthesized by the epithelial cell layer of the thyroid follicles and retained in the gland within the colloid substance. The breakdown of this substance is mediated by TSH and causes the release of T4 into the bloodstream. Thyroid hormones are transported from the thyroid gland to the target organs closely bound to plasma proteins including thyroxine-binding globulin (TBG), thyroxine binding prealbumin (TBPA) and albumin. A small fraction of T4 (FT4) is always free (about 0.03 % of total T4) and it is generally accepted that this free fraction is the physiologically active material believed to penetrate cell, induce stimulation of metabolism and control feedback via the pituitary. Furthermore, free T4 is the major precursor to T3. Free T4 level is independent from the binding protein concentration and, therefore, correlates well with the functional thyroid state. Increased T4 binding by serum proteins results in elevated total T4 concentrations without hyperthyroidism, while decreased T4 binding results in reduced total T4 concentration without hypothyroidism. The dosage of free T4 can be used to distinguish hyper and hypothyroidism in patients whose T4 total values are higher or lower than normal. For instance, in individuals taking estrogen preparations or oral contraceptives, in pregnancy or with a congenital high level of transport protein, the values of FT4 are normal. In borderline FT4 cases of suspected thyroid malfunction, Free T3 dosage or high sensitive TSH are recommended. 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This kit is based upon a competitive enzyme immunoassay (EIA). In its solid phase it uses wells coated with specific anti-t 4 antibodies. By adding in the wells the serum and conjugate (T 3 conjugated with horseradish peroxidase, analogmethod) of the patient we obtain a reaction between serum T 4 and conjugate on the binding sites present on the antibodies. This reaction is carefully calibrated in order to avoid disturbing as much as possible the balance between free and M320 Rev.4 01/2009 Pag. 12/24

13 binding hormone, therefore enabling a correct dosage of the free part of the sample. At the end of incubation, the unbound material is removed by aspiration/washing cycle. The enzymatic activity is fixed on the solid phase and, therefore, will be indirectly proportional to the FT 4 concentration present in the calibrators and samples as well as emphasized by incubating the wells with Chromogen solution (tetramethylbenzidine, TMB) in a Substrate-Buffer. Colorimetric reading will be performed by using a spectrophotometer at 450 nm and at 405 nm wavelength. 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY The reagents are sufficient for 96 wells. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each reagent is shown on the vial label. Once opened, the kit is stable at 2-8 C for 2 months. 3.1 Specific Reagents MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with specific anti-t 4 antibodies (rabbit). Store unused wells in the provided plastic bag and accurately sealed at 2-8 C CAL Calibrators: 6 vials (1 ml) of T 4 in serum matrix. Lyophilized. Reconstitute with 1 ml of distilled water. After reconstitution, the calibrators can be stored at 2-8 C for 2 months. Preservative: Neomycin. NOTE: refer to the C.Q. sheet, for exact concentrations. CTR Control serum: 2 vials of T 4 in serum matrix at two different concentrations. Lyophilized. Reconstitute with 1 ml of distilled water. After reconstitution, the control serum can be stored at 2-8 C for 2 months. Preservative: Neomycin. NOTE: refer to the C.Q. sheet, for exact concentrations. CONJ Enzyme Conjugate: 2 vials (12 ml) of T 3 conjugated to horseradish peroxidase (HRPO) in HEPES buffer and stabilizers. Ready for use. Preservative: Neomycin. 3.2 Common Reagents for all RADIM kits of the Hormones Lines WASH Washing Solution (concentrated REF SL01): 1 vial (50 ml) of PBS- Tween 20. Preservative: Thimerosal (< 0.05%). Take vial content to 500 ml with distilled H 2 O. In case of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37 C for a few minutes. Store the diluted Washing Solution for 30 days at 2-8 C. TMB Chromogen: 1 vial (15 ml) of Tetramethylbenzidine (TMB) with citratephosphate buffer and DMSO. Liquid. SUBS Substrate Buffer: 1 vial (15 ml) of Citrate-phosphate buffer and H 2 O 2. Liquid. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 13/24

14 NOTE: in order to obtain the Substrate Solution, mix equal volumes of Chromogen with Substrate Buffer by using a dark, thoroughly clean vial. Avoid direct light exposure and use within 1 hour from preparation. STOP Blocking Reagent: 1 vial (14 ml) of 1N H 2 SO 4. Ready for use. CPA Adhesive plate sealers Plastic bag 4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Test Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Graduated cylinders for reagent dilution. Microplate shaker adjustable at 1200 rpm. Aspiration pump or automated microplate washing device. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a A interval at 450 and 405 nm wavelength. Millimetric graph paper. Distilled H 2 O. 4.2 Automatic Test This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. It is possible to use common reagents (see 3.2) from different lots. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect: exact incubation times and quantities adding the reagents incubation times and temperature may cause incorrect clinical results. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 14/24

15 Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability of results obtained. In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that all the equipment used (glassware, dry heater, microplate shaker, microplate washers, spectrophotometer and fridge/freezers used for reagent and sample storage) is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Any deviation from the correct use of the equipment listed can produce errors in the methodology, this may affect the reproducibility and reliability of results obtained. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 15/24

16 6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum samples. Highly lipemic or hemolyzed samples must be discarded. Store samples at 2-8 C for 1 day; for longer periods it is advisable to freeze samples at -20 C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. 7. ASSAY PROCEDURE* Allow reagents and samples to warm up at room temperature. Mix the samples by inversion before use. 7.1 Prepare the wells for: Blank, Calibrators, Control Sera and Samples. 7.2 Pipette 50 µl of each Calibrator, Control Serum and Sample into the corresponding wells. 7.3 Pipette 200 µl of Enzyme Conjugate into all wells, except the Blank one. 7.4 Cover the microplates with the adhesive sheet and mix gently. 7.5 Incubate the microplates for 90±5 minutes at room temperature (18-25 C) on an orbital shake at 1200 rpm. 7.6 Remove the adhesive sheet and carefully aspirate the incubation mixture from all wells. 7.7 Wash the wells 4 times with 350 µl of diluted Washing Solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.8 Pipette 200 µl of Substrate-Chromogen solution (see reagent paragraph) into all wells. 7.9 Incubate for 15 minutes at room temperature (18-25 C) on an orbital shake at 1200 rpm. Avoid direct light exposure Pipette 100 µl of Blocking Reagent into all wells Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance values, read at 405 nm. Reading must be completed within 20 minutes from the end of the assay. * While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 8. ASSAY SCHEME: see p CALCULATION OF RESULTS In order to obtain a better sensitivity, the present method employs spectrophotometric reading at two wavelengths (450 and 405 nm). For samples with FT 4 concentrations ranging from 10 to 80 pg/ml, read at 450 nm wavelength; for samples with a FT 4 level lower than 10 pg/ml, read at 405 nm wavelength. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 16/24

17 Draw a calibration curve on millimetric graph paper, by plotting the calibrator concentration (x-axis) against the absorbance obtained for each calibrator (yaxis). Corresponding FT 4 concentrations in pg/ml are obtained by interpolating the absorbances of each sample on the calibration curve. 9.1 Example of Calculation The values shown below must be considered as an example and must not be used in place of experimental data. Description Absorbance at 450 nm FT 4 Absorbance at 405 nm FT 4 Calibrator 0 pg/ml > Calibrator 5 pg/ml > Calibrator 10 pg/ml === Calibrator 20 pg/ml === Calibrator 40 pg/ml === Calibrator 80 pg/ml === Sample pg/ml === 9.2 Normal Values The serum values of FT 4 reported below are indicative as influenced by factors such as climate, geographical area and diet. We suggest that each laboratory establishes its own normal range. Normal values: 7 18 pg/ml (9 23 pmoli/l) Hypothyroidism: < 7 pg/ml ( < 9 pmoli/l) Hyperthyroidism: > 18 pg/ml ( > 23 pmoli/l) 9.3 Conversion Factor pmoli/l = (pg/ml : 777) x Validation Criteria Before proceeding to calculation of results, make sure the control serum concentration is included within the value described on the Quality Control Sheet. 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY 10.1 Specificity The present method has given the following cross-reactions: M320 Rev.4 01/2009 Pag. 17/24

18 CROSSREAGENT % of cross-reaction 3 iodo-l-tyrosine (MIT) 0 3, 5 diiodo-l-tyrosine (DIT o T2) 0 3, 5 diiodo-l-tyronine 0 3, 3, 5, triiodo-l-tyronine (T3) 3.3% 3, 3, 5 triiodo-l-tyronine (r T3) 6.4% 3, 3, 5, 5 tetraiodo-l-tyronine (T4) > 100% 3, 3, 5, 5 tetraiodo-d-tyronine (D-T4) > 100% 10.2 Analytic Sensitivity Analytic sensitivity was calculated upon the calibration curve and expressed as the minimal dose showing a significant difference from the Zero Calibrator (mean value OD 2 S.D.). This dose was lower than 1 pg/ml Functional Sensitivity Functional sensitivity is expressed at a dose corresponding to a 20% inter-assay CV. This dose was lower than 1.5 pg/ml Precision Precision was evaluated determining the repeatability and the reproducibility of the assay (intra- and inter-assay variability), on sera at different FT 4 concentrations. Repeatability (Intra-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Replicates (pg/ml) % no a 6.2 ± b 13.1 ± c 27.2 ± d 72.1 ± Reproducibility (Inter-assay) Serum Mean ± S.D. C.V. Assays (pg/ml) % no. a 11.5 ± b 26.2 ± c 69.9 ± Dilution Test Within a certain limit, the dosage of the free hormone is independent from the carrier proteins; indeed the FT 4 value measured in the same sample at different dilutions is always constant. Two different methods were used: a) decreasing amounts of the same sample were pipetted; b) the same volume of undiluted and diluted sample in a matrix with no carrier proteins was pipetted. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 18/24

19 a) Serum Volume Measured dose pg/ml Serum Volume Measured dose pg/ml # 1 50 μl 28.5 # 2 50 μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl μl 18.8 b) Serum Dilution Measured dose pg/ml Serum Dilution Measured dose pg/ml # 1 1/ # 2 1/1 28 1/ / / /2 23 1/ / /5 22 1/ LIMITS OF THE ASSAY The results of the assay must be carefully interpreted and confirmed by clinical evaluations and further diagnostic tests. 12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20 M320 Rev.4 01/2009 Pag. 19/24

20 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE- Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití M320 Rev.4 01/2009 Pag. 20/24

21 96 RDATE Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS H 2 O Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο - απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda M320 Rev.4 01/2009 Pag. 21/24

22 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Pozzetti, wells Bianco, Blank CAL (0-5) CTR Campioni, Samples Reag CAL (0-5) µl CTR µl ---- Campioni, Samples µl CONJ µl 200 µl 200 µl Incubare, Incubate: 90±5' 1200 rpm T.A. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl. TMB + SUBS 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Incubare, Incubate: 15' 1200 rpm T.A. STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: nm. M320 Rev.4 01/2009 Pag. 22/24

23 BIBLIOGRAFIA-REFERENCES 1 - Larsen P.R. Triiodothyronine: review of recent studies of its physiology and pathophysiology in man. Metabolism 1972 Nov. Vol: 21 (11), p: Brown.J. Chopra I.J. Cornell J.S et al. Thyroid physiology in health and disease. ANNINTERNMED, 1974, 81/1 (68-81). 3 - Singer P.A., Nicoloff J.T., Estimation of the triiodothyronine secretion rate in euthyroid man. J. Clin. Endocr. Metab Jan. Vol: 35 (1), p Surks M.I. Schadlow A.R. Stock J.M. Oppenheimer J.H. Determination of iodothyronine absorption and conversion of L-thyroxine (T 4 ) to L- triiodothyronine (T 3 ) using turnover rate techniques. J.Clin.Invest 1973 Apr. Vol: 52 (4), p: Fleischer N. Burgus R. Vale W. Dunn T. Guillemin R. Preliminary observations on the effect of synthetic thyrotropin releasing factor on plasma thyrotropin levels in man. J.Clin.Endocrinol.Metab Jul, Vol: 31 (1), p: Sterling K. Refetoff S. Selenkow H.A. T 3 thyrotoxicosis, Thyrotoxicosis due to elevated serum triiodothyronine levels. Jama 1970 Jul 27, Vol: 213 (4), p: Hollander C.S. and Shenkman L., in B. Rothfeld ed, "Nuclear Medicine in Vitro" (Philadelphia: Lippincott, 1974). 8 - Ekins, R. : Measurements of free hormones in blood. Endocrine Reviews, 1990, 11 (1), Maberly G., Waite K., MA G., Soni N., and Eastman C. Binding characteristics of Thyroxin Binding Globulin in serum of normal, pregnant and severely III euthytoid patients. Clin. Chem. 1986, 32 (4), Midgley J. E. M. Direct and indirect free thyroxine assay methods: theory and practice. Clin. Chem. 2001, 47 (8), M320 Rev.4 01/2009 Pag. 23/24

24 RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -