Anti TRANSGLUTAMINASI IgG

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1 Anti TRANSGLUTAMINASI IgG EIA WELL R REF K10TG 96 Italiano p. 3 English p. 12 M412 Rev.1 04/2008 Pag. 1/24

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag. Quant. Stato fisico, Physical state MTP 1 x 96 Pronti per l'uso Ready for use WASH 1 x 50 ml Conc. DIL CAL CONJ CTR TMB STOP 1 x 100 ml 5 x 2 ml 1 x 14 ml 2 x 2 ml 2 x 15 ml 1 x 14 ml Pronto per l'uso Ready for use Pronti per l'uso Ready for use Pronto per l'uso Ready for use Pronti per l'uso Ready for use Pronto per l'uso Ready for use Pronto per l'uso Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M412 Rev.1 04/2008 Pag. 2/24

3 DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG ANTI-TRANSGLUTAMINASI TISSUTALE NEL SIERO O PLASMA UMANO. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE La malattia celiaca è un affezione cronica caratterizzata sul piano clinico da una gamma estremamente variabile di disturbi digestivi (malassorbimento intestinale, diarrea), da ritardo della crescita e a volte da dermatite erpetiforme. A livello anatomo-patologico, la malattia è accompagnata da atrofia dei villi della mucosa dell intestino tenue, ipertrofia delle cripte ed ipercellularità della mucosa. Come conseguenza del malassorbimento intestinale possono manifestarsi stati di deplezione di fattori nutritivi, causa ad esempio di anemia, dovuta a carenza di acido folico e vitamina B12. Inoltre individui con celiachia da lungo tempo, presentano un rischio elevato di sviluppare il linfoma delle cellule T. La frequenza delle malattia celiaca in Italia ed in Europa è stata stimata essere pari a 1/200-1/300 su un ampia casistica di popolazione pediatrica. Tale incidenza risulta essere più elevata nella sindrome di Down e nel diabete giovanile insulinodipendente. La malattia celiaca si instaura a seguito di una intolleranza, mediata da meccanismi immunologici, nei confronti di proteine di alcuni cereali. In particolare la gliadina, frazione proteica solubile in alcool del glutine, è considerata la principale responsabile della tossicità della farina di grano nei confronti della mucosa intestinale dei pazienti celiaci. Finora la determinazione di anticorpi IgG e IgA anti-gliadina (ELISA) e la determinazione delle IgA antiendomisio (IFA) sono state considerate i principali parametri sierologici per la diagnosi della malattia celiaca. Nel 1977, è stato descritto da DIETERICH l enzima Transglutaminasi tissutale (TGA) come il principale auto-antigene endomisiale, utilizzante la gliadina come substrato, verso cui sono diretti gli anticorpi IgA anti-endomisio. Numerosi studi effettuati successivamente hanno confermato l elevata coincidenza nei celiaci di anticorpi anti-transglutaminasi di classe IgA e IgG, determinate mediante tecniche ELISA e le IgA anti-endomisio determinate in immunofluorescenza. Il dosaggio degli anticorpi di classe IgG assume particolare rilevanza nei casi di ridotta presenza di IgA, come nei bambini al di sotto dei 4 anni e nei pazienti con deficit di IgA. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimatico (ELISA) ed utilizza come marcatore enzimatico la perossidasi. Durante la prima incubazione, gli autoanticorpi anti-transglutaminasi della classe IgG, eventualmente presenti nel siero in esame, si legano alla Transglutaminasi (ricombinante umana da Baculovirus) adesa alla superficie dei pozzetti. Tramite lavaggio viene eliminato il materiale non legato; in una successiva incubazione gli anticorpi anti-igg umane, coniugati alla perossidasi, reagiscono con il complesso precedentemente M412 Rev.1 04/2008 Pag. 3/24

4 formatosi tra antigene ed anticorpo anti-transglutaminasi. Dopo ulteriore lavaggio, viene aggiunta tetrametilbenzidina (TMB) incolore che, reagendo con la perossidasi presente, produce un composto colorato. La reazione di sviluppo del colore è bloccata con l'aggiunta di H 2 SO 4 e l'intensità del colore, misurata mediante spettrofotometro a 450 nm, è direttamente proporzionale alla concentrazione di anticorpi IgG anti-transglutaminasi presenti nei calibratori, nei controlli e nei campioni in esame. 3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA' I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. Il kit deve essere conservato a 2-8 C. La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. Una volta aperto il kit è stabile 1 mese a 2-8 C. 3.1 Reagenti Specifici MTP Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti, separabili singolarmente, sensibilizzati con Transglutaminasi ricombinante umana da Baculovirus. I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2-8 C nella custodia di alluminio accuratamente sigillata. CAL Calibratori: 5 flaconi contenenti IgG anti-transglutaminasi in matrice sierica, alle seguenti concentrazioni: 0, 7, 25, 50 e 100 U/mL. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronti all uso e colorati in rosso. CTR Sieri di Controllo: 2 flaconi contenenti IgG anti-transglutaminasi in matrice sierica, a differenti diluizioni. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronti all uso e colorati in rosso. CONJ Coniugato Enzimatico: 1 flacone (14 ml) di anti-igg umane coniugate con perossidasi di rafano (HRPO) in matrice sierica e stabilizzanti. Conservante: Mertiolato (0.01%). Pronto per l'uso. DIL Diluente dei Campioni : 1 flacone (100 ml) di matrice sierica e stabilizzanti, colorato in rosso. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Pronto all uso. 3.1 Reagenti Comuni per i kit delle Linee To.R.C.H. M.S.T., Malattie dell infanzia, Patologia Gastroenterica e Morbo Celiaco WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata): 1 flacone (50 ml) PBS-Tween 20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Al momento dell'uso diluire la quantità necessaria 1:20 con H 2 O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. Dopo diluizione il tampone di lavaggio è stabile 30 giorni a 2-8 C. TMB Cromogeno: 2 flaconi (15 ml) di Tetrametilbenzidina (TMB) in tampone citrato-fosfato, DMSO e H 2 O 2. Pronto per l uso. STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 ml) di H2SO4 1N. Pronto per l'uso. CPA Copripiastra adesivo Bustina di plastica trasparente con minigrip 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO M412 Rev.1 04/2008 Pag. 4/24

5 4.1 Dosaggio Manuale Micropipette automatiche a puntali intercambiabili a volume variabile. Agitatore per micropiastre, regolabile a 1200 rpm. Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi. Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell'intervallo A ad una lunghezza d'onda di 450 e 405 nm. Carta millimetrata. H 2 O distillata. 4.2 Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. E possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare l ottenimento di dati clinici non attendibili. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una M412 Rev.1 04/2008 Pag. 5/24

6 buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Assicurarsi che la pompa di aspirazione oppure l apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre sia perfettamente funzionante. Un lavaggio non accurato delle micropiastre può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione. Assicurarsi che lo spettrofotometro per micropiastre sia perfettamente funzionante. L utilizzo di uno spettrofotometro non calibrato o con filtri non puliti, può comportare un errore nella lettura dei campioni, con conseguente possibile misclassificazione degli stessi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Assicurarsi che la stufa termostatata (se necessaria) sia perfettamente funzionante. L incubazione a temperature diverse da 37±2 C può dare luogo a perdita di sensibilità e/o a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata. Assicurarsi che l agitatore per micropiastre (se necessario) sia perfettamente funzionante. L agitazione in condizione diverse dall atteso può dare luogo a misclassificazione dei campioni. E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione. Assicurarsi che la strumentazione utilizzata per la conservazione dei campioni e/o del dispositivo sia perfettamente funzionante. La conservazione a temperature diverse dall atteso, può dare luogo a denaturazione biologica dei materiali (reattivi e/o campioni). E necessario un adeguato piano di manutenzione di tale strumentazione e un controllo periodico della temperatura registrata. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da M412 Rev.1 04/2008 Pag. 6/24

7 immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. La sodio azide contenuta come conservante in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo altamente esplosive. Per evitare l formazione e l'accumulo di tali composti far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. 6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio è effettuato su siero e plasma umano. Campioni fortemente lipemici o emolizzati possono alterare i risultati. La presenza di filamenti di fibrina può interferire nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano perfettamente limpidi prima di dosarli. I campioni possono essere conservati per un periodo non superiore ad una settimana se correttamente mantenuti a 2-8 C, a - 20 C per tempi più lunghi. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i campioni. Prima dell'uso, diluire i campioni 1:100 con il Diluente dei Campioni (es. 10 µl di campione µl di diluente). 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO * Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. 7.1 Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori, Sieri di Controllo e Campioni. 7.2 Dispensare 100 µl di Calibratori, Sieri di Controllo e Campioni precedentemente diluiti, nei rispettivi pozzetti. N.B.: i Calibratori ed i Sieri di Controllo non devono essere diluiti. 7.3 Dispensare 100 µl di Diluente Campioni diluito nel pozzetto del Bianco. 7.4 Incubare per 60±5 minuti in agitazione a 1200 rpm a temperatura ambiente (18-25 C), coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.5 Effettuare 4 lavaggi con un volume di 350 µl per pozzetto, impiegando la Soluzione di Lavaggio diluita. Aspirare accuratamente il liquido da tutti i pozzetti. M412 Rev.1 04/2008 Pag. 7/24

8 7.6 Dispensare 100 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti. 7.7 Incubare per 30±2 minuti in agitazione a 1200 rpm a temperatura ambiente (18-25 C), coprendo la micropiastra con il copripiastra adesivo fornito nel kit. 7.8 Lavare i pozzetti come al punto Dispensare 100 µl di Cromogeno in tutti i pozzetti Incubare per 10 minuti in agitazione a 1200 rpm a temperatura ambiente (18-25 C), al riparo dalla luce Dispensare 100 µl di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). Nel caso di estinzione in overflow, utilizzare la lettura spettrofotometrica a 405 nm. La lettura deve essere effettuata entro 15 minuti dal termine del dosaggio. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p CALCOLO DEI RISULTATI * Disegnare la curva su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le concentrazioni dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative ai sieri di controllo e a ciascun campione, si otterranno le corrispondenti concentrazioni di IgG anti-transglutaminasi, espresse in U/mL. * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura. 9.1 Esempio di Calcolo I valori sotto riportati debbono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione Assorbanza 450 nm IgG anti- Transglutaminasi Calibratore 0 U/mL Calibratore 7 U/mL Calibratore 25 U/mL M412 Rev.1 04/2008 Pag. 8/24

9 Calibratore 50 U/mL Calibratore 100 U/ml Siero Controllo Negativo U/ml Siero Controllo Positivo U/ml Campione U/mL Campione U/mL Interpolando sulla curva di calibrazione, i campioni dosati risultano avere rispettivamente un titolo di IgG anti-tranglutaminasi di 1.80 e 44.2 U/mL. 9.2 Criteri di Accettazione Prima di procedere al calcolo dei risultati verificare che le dosi dei controlli rientrino nei range riportati sul Certificato di Controllo Qualità allegato al kit. Se i valori ottenuti non rispecchiano quelli attesi, è necessario ripetere il dosaggio. 9.3 Interpretazione dei Risultati I sieri di soggetti non celiaci presentano valori di IgG anti-transglutaminasi inferiori a 7 U/ml. I campioni con valori di IgG compresi tra 5-7 U/ml sono da considerare di dubbia interpretazione e devono essere dosati nuovamente per conferma. Valori normali: 5 U/ml Zona grigia: 5-7 U/ml Valori patologici: 7 U/ml 10. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Clinica La specificità clinica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo di soggetti non celiaci, risultando pari a 100% Sensibilità Clinica La sensibilità clinica del metodo è stata valutata su un campione rappresentativo di soggetti positivi agli anticorpi IgG anti-transglutaminasi, risultando pari a 95% Specificità Analitica Il presente metodo analitico non ha mostrato interferenze con sieri positivi a patologie autoimmuni sistemiche Sensibilità Analitica La sensibilità analitica del metodo è definita come minima dose significativamente distinguibile dal calibratore zero. E stata valutata dispensando 10 replicati del calibratore zero e leggendo la media delle D.O.+2 D.S. sulla curva di calibrazione. La sensibilità analitica è risultata pari a 0.24 U/ml Precisione M412 Rev.1 04/2008 Pag. 9/24

10 La precisione é stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed inter-saggio su 3 sieri a differenti concentrazioni di IgG anti-tranglutaminasi. Intra-saggio Sieri Media D.S. C.V. Replicati (U/ml) A % 10 A % 10 A % 10 Inter-saggio Sieri Media D.S. C.V. Dosaggio (U/ml) A % 12 A % 12 A % Accuratezza L accuratezza è stata valutata effettuando prove di Parallelismo e Recupero. Si è ritenuto indispensabile effettuare le prove su un numero vasto di campioni considerando sia la variabilità che l eterogeneità degli anticorpi di classe G presente nei sieri come fattori che influenzano la risposta e la concordanza tra atteso e misurato. Test di Parallelismo La prova di parallelismo è stata effettuata considerando due sieri a concentrazione nota di anticorpi IgG anti-transglutaminasi diluiti nello Zero standard. Atteso Misurato % S : : : Atteso Misurato % S : : : M412 Rev.1 04/2008 Pag. 10/24

11 Test di Recupero Il test di Recupero è stato allestito considerando due sieri a concentrazione nota diluiti secondo un rapporto 1:2 con i punti della curva standard. Atteso Misurato % S U (1/2) U (1/2) U (1/2) Atteso Misurato % S U (1/2) U (1/2) U (1/2) LIMITI DEL DOSAGGIO Come per qualsiasi procedura analitica la diagnosi di un paziente non può essere fatta in base al risultato di un singolo dosaggio. I risultati ottenuti da questo metodo immunoenzimatico contribuiscono alla diagnosi ma non ne costituiscono l unico elemento nella pratica clinica. 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20 ENZYME IMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETECTION OF TISSUE TRANSGLUTAMINASE IgA ANTIBODIES IN HUMAN SERUM OR PLASMA. 1. CLINICAL APPLICATIONS FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY M412 Rev.1 04/2008 Pag. 11/24

12 The celiac disease is a chronic pathology, characterized by several gastroenterological disorders (intestinal malabsorption, diarrhea), as well as growth retardation and dermatitis herpetiformis. Anatomically speaking, celiac disease is accompanied by villous atrophy of the small bowel mucosa, hypertrophic crypts and also excessive amounts of mucosal cells. The intestinal malabsorption can lead to depauperation of nutrient factors, as anemia caused by deficiency of folic acid and vitamin B12. Moroever subjects with celiac disease for long time have a high risk to develop the cell T lymphoma. In Italy and in Europe the celiac disease frequency is 1/200-1/300, estimated on wide casuistry of paediatric population. This incidence is higher in the Down syndrome and in the juvenile-onset diabetes. The celiac disease is an intolerance to some cereal proteins, mediated by immunological mechanisms. Particularly the gliadin, which is an alcohol soluble proteic fraction of gluten, is the main responsable for the wheatmeal toxicity in gluten/sensitive subjects. Up to now the main diagnosis of celiac disease was obteined by quantitative testing of both antigliadin IgG and IgA antibodies (ELISA) and of anti-endomysium IgA antibodies (IFA). In 1977, DIETERICH described the tissue Transglutaminase enzyme (TGA) as the main endomysial auto-antigen. As substrate this enzyme uses the gliadin, which represents the target of anti-endomysium IgA antibodies. Subsequent several studies have confirmed the high correlation between the antitransglutaminase IgA antibodies, performed by ELISA methods, and the antiendomysium IgA antibodies, performed by IFA methods. Anti-Transglutaminase IgG antibodies test has significance in case of a reduce presence of IgA such as in children under 4 years old and IgA deficit desease 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This kit is based upon an enzyme immunoassay method (ELISA), where horseradish peroxidase is used as enzyme tracer. During the first incubation, the sample anti-transglutaminase IgG antibodies, if any, are bound to the Transglutaminase (human recombinant from Baculovirus) coated wells. A wash cycle eliminates unbound material. In the incubation that follows, a second antibody (conjugated with horseradish peroxidase) will bind to the Transglutaminase-antigen-antibody complex. After a further wash cycle the colorless tetramethylbenzidine (TMB) is added to the wells, where it yields a colored compound, by reacting with the peroxidase enzyme. Color development will be stopped by adding H 2 SO 4.The color intensity, measured in a spectrophotemeter at 450 nm, will thus be directly proportional to the antitransglutaminase IgG antibody concentration in calibrators, control sera and samples. 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT> PREPARATION AND STABILITY The reagents are sufficient for 96 wells. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each reagent is shown on the vial label. M412 Rev.1 04/2008 Pag. 12/24

13 Once opened the kit is stable at 2-8 C for 1 month. 3.1 Specific Reagents MTP Coated Microplate: 1 microplate for 96 breakable wells, coated with human recombinant Transglutaminase from Baculovirus. Keep unused wells at 2-8 C in the provided plastic bag and accurately sealed. CAL Calibrators: 5 vials containing anti-transglutaminase IgG in serum matrix, at the following concentrations: 0, 7, 25, 50 and 100 U/mL. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Ready for use and red colored. CTR Controls: 2 vials containing anti-transglutaminase IgG in serum matrix, at different concentrations. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Ready for use and red colored. CONJ Enzyme Conjugate: 1 vial (14 ml) of anti human IgG conjugated to horseradish peroxidase (HRPO) in serum matrix and stabilizers. Preservative: Thimerosal (< 0.01%). Ready for use. DIL Sample Diluent :1 vial (100 ml) of serum matrix with stabilizers, redcolored. Preservative: NaN 3 (< 0.1%). Ready for use. 3.2 Common Reagents for kits of the following Lines: To.R.C.H. S.T.D., Child Disease, Gastroenteric Disease and Celiac Disease WASH Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 ml) of PBS-Tween 20. Preservative: Thimerosal (< 0.05%). Just before use, dilute the needed amount 1:20 with distilled H 2 O. In case of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37 C for a few minutes. Store the diluted Washing Solution for 30 days at 2-8 C. TMB Chromogen: 2 vials (15 ml) of Tetramethylbenzidine (TMB) with citratephosphate buffer, DMSO and H 2 O 2. Ready for use. STOP Blocking Reagent: 1 vial (14 ml) of 1N H 2 SO 4. Ready for use. CPA Adhesive plate sealers Plastic bag 4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Test Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Microplate shaker, adjustable at 1200 rpm. Graduated cylinders for reagent dilution. Aspiration pump or automated well washing device. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a A interval at 450 nm and 405 nm. Millimetric graph paper. Distilled H 2 O. 4.2 Automatic Test M412 Rev.1 04/2008 Pag. 13/24

14 This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. It is possible to mix common reagents (see 3.2) from different lots. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify in any way the "Assay Procedure". If you not respect: exact incubation times and quantities adding the reagents incubation times and temperature may cause incorrect clinical results. Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability of results obtained. In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that the aspiration pump or automated well washing device is in perfect working order. Inadequate rinsing of wells may cause an incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order. Ensure that the microplate spectrophotometer is in perfect working order. The use of a not calibrated spectrophotometer or not clean filters may cause a wrong reading samples with consequent incorrect samples classifications. Ensure that all the equipment used is in perfect working order. Ensure that the dry heater (if necessary) is in perfect working order. The incubation temperature different from 37±2 C may cause a sensitivity losses and/or biological denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature. M412 Rev.1 04/2008 Pag. 14/24

15 Ensure that the microplate shaker (if necessary) is in perfect working order. Incorrect agitation may cause wrong samples classifications. Ensure that the equipment used is in perfect working order. Ensure that all the equipment used for samples storage and/or the system is in perfect working order. The storage at different suggested temperature may cause biological material denaturation (samples and/or reagents). Ensure that the equipment used is in perfect working order and periodically check the recorded temperature. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. 6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum or plasma samples. Highly lipemic or hemolyzed samples may affect the results. The presence of fibrin filaments could interfere with the assay; make sure that samples are always perfectly clear before testing. Keep samples properly stored at 2-8 C for 1 week; for longer periods it is M412 Rev.1 04/2008 Pag. 15/24

16 advisable to freeze samples at -20 C. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. Before use, dilute samples 1:100 with Sample Diluent (example: 10 µl sample µl Sample Diluent). 7. ASSAY PROCEDURE * Allow reagents and samples to warm up at room temperature. Mix samples by inversion before use. 7.1 Prepare the wells for: Blank, Calibrators, Controls and Samples. 7.2 Pipette 100 µl of Calibrators, Controls and diluted Samples into the corresponding wells. Note: Calibrators and Controls must not be diluted. 7.3 Pipette 100 µl of Sample Diluent into the Blank well. 7.4 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and incubate for 60±5 minutes at 1200 rpm at room temperature (18-25 C). 7.5 Wash the wells 4 times with 350 µl of diluted Washing Solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.6 Add 100 µl of Enzyme Conjugate into all wells. 7.7 Cover the microplate with adhesive sheet (supplied with the kit) and incubate for 30±2 minutes at 1200 rpm at room temperature (18-25 C). 7.8 Wash the wells as described in point Pipette 100 µl of Chromogen into all wells Incubate the wells for 10 minutes at 1200 rpm at room temperature (18-25 C). Avoid direct light exposure Pipette 100 µl of Blocking Reagent into all wells Read the absorbance of the wells with a preferably bichromatic spectrophotometer at 450 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument at zero with the Blank well). In case of overflow absorbance values, read at 405 nm. Reading must be completed within 15 minutes from the end of the assay. * While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. 8. ASSAY SCHEME: see p CALCULATION OF RESULTS * Draw a calibration curve on millimetric graph-paper, by plotting the calibrator concentrations (x-axis) against their relative absorbances (y-axis). Corresponding anti-transglutaminase IgG concentrations in U/mL are obtained by interpolating the absorbances of each sample on the calibration curve. M412 Rev.1 04/2008 Pag. 16/24

17 * While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. 9.1 Calculation Example The following values must be considered as an example and should not be used in place of experimental data. Description Absorbance 450 nm Anti- Transglutaminase IgG Calibrator 0 U/mL Calibrator 7 U/mL Calibrator 25 U/mL Calibrator 50 U/mL Calibrator 100 U/ml Negative Control Serum U/ml Positive Control Serum U/ml Sample U/mL Sample U/mL By interpolation, the tested sample will have an anti-transglutaminase IgG titer of 1.80 and 44.2 U/mL. 9.2 Validation Criteria Before proceeding in calculating the results, make sure the control concentrations are included within the values described on the Quality Control sheet. If the values obtained are not as expected, it will be necessary to repeat the assay. 9.3 Interpretation of Results Subjects samples without celiac disease show anti-transglutaminase IgG levels below 7 U/ml. The samples with IgG levels included in the range 5-7 U/ml should be considered border line and should be repeated to confirm the results. Normal values: Border line: Pathological values: 5 U/ml 5-7 U/ml 7 U/ml 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY 10.1 Clinical Specificity M412 Rev.1 04/2008 Pag. 17/24

18 The clinical specificity of the method was evaluated on a representative group of patients diagnosed as free from coelic disease. The result is 100% Clinical Sensitivity The clinical sensitivity of the method was evaluated on a representative group of individuals suffering from coelic disease. The result is 95% Analytical Specificity This analitycal method shows no interferences with patients positive for autoimmune disease Analytical Sensitivity The analytical sensitivity is expressed as the minimal dose showing a significant difference from the zero calibrator. It has been checked by pipetting 10 replicates of zero calibrator and reading O.D. mean value + 2 S.D. upon the calibration curve. This dose is 0.24 U/mL Precision Precision has been evaluated determining the repeatability and the reproducibility of the assay (intra- and inter-assay variability), on 3 sera at different anti- Transglutaminase IgG concentrations. Repeability (Intra-assay) Serum Mean S.D. C.V. Replicates (U/ml) A % 10 A % 10 A % 10 Reproducibility (Inter-assay) Serum Mean S.D. C.V. Assay (U/ml) A % 12 A % 12 A % Accuracy Accuracy of the method has been checked by the recovery and parallelism tests. Recovery test Two sera at known concentration of IgG were diluted 1:2 with the calibrators and tested Expected Measured % S U(1/2) M412 Rev.1 04/2008 Pag. 18/24

19 +25(1/2) (1/2) Expected Measured % S U(1/2) (1/2) (1/2) Parallelism test Two sera with high IgG content were tested at different dilutions with the Zero standard: Expected Measured % S : : : Expected Measured % S : : : LIMITATION OF THE PROCEDURE As with all diagnostic tests, a definite clinical diagnosis should not be based on the results of a single test, but should only be made by the physician after all clinical and laboratory findings have been evaluated 12. SYMBOLS LEGEND: see p. 20 M412 Rev.1 04/2008 Pag. 19/24

20 SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / reference or order code / Référence ou numéro de commande / referencia o número de pedido / referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / referenční nebo objednací číslo Lotto / lot / Lot / lote / lote / charge / παρτίδα / parti / šarže Data di scadenza / expiry date / date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento / Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / in vitro diagnostik kullanım / pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / marcação-ce segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE- Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / keep at 2-8 C / conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / produzido por / Fabricante / produkt der / κατασκευάζεται από / tarafından üretilmiştir / výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / consult instructions for use / consulter le mode opératoire / consultar las instrucciones de uso / consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití M412 Rev.1 04/2008 Pag. 20/24

21 96 RDATE Sufficiente per 96 test / sufficient for 96 tests / suffisant pour 96 déterminations / suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / dostačující pro 96 testů Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia / Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / referenční datum RCNS H 2 O Ricostituire con / reconstitute with / reconstituer avec / reconstituir con / reconstituir com / rekonstituiren mit / ανασυστάται με / ile karıştırma / rekonstituovat Acqua distillata o deionizzata / deionized or distilled water / eau deionisée ou distillée / agua destilada o desionizada / água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο - απεσταγμένο νερό / deiyonize veya distile su / deionizovaná nebo destilovaná voda SCHEMA DEL DOSAGGIO-ASSAY SCHEME M412 Rev.1 04/2008 Pag. 21/24

22 Prediluizione del campione, Sample predilution: 1/100. Pozzetti Wells Bianco, Blank CAL (1-5) CTR Campioni, Samples Reag CAL µl CTR µl --- Campioni, Samples µl DIL 100 µl Incubare, Incubate: T.A./R.T. 60±5 min rpm Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl. CONJ 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: T.A./R.T. 30±2 min rpm Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl. TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubare, Incubate: T.A./R.T. 10 min rpm STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: nm. M412 Rev.1 04/2008 Pag. 22/24

23 BIBLIOGRAFIA-REFERENCES 1 - Dieterich W., Laag E., Schöpper H., Volta U., Ferguson A., Gillet H., Riecken E.O., Schuppan D. (1998). Autoantibodies to Tissue Transglutaminase as Predictor of Coeliac Disease. Gastroenterology, 115: Sulkanen S., Halttunen T., Laurila K., Kohlo K.L., Korponay-Szabò I.R., Sarnesto A., Savilahti E., Collin P., Mäki M. (1998). Tissue Transglutaminase Autoantibody Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay in Detecting Coeliac Disease. Gastroenterology, 115: Dieterich W., Ehnis T., Bauer M., Donner P., Volta U., Riecken O., Schuppan D. (1997). Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of celiac disease. Nature Medicine, 3: Maki M. (1997). Tissue Transglutaminase as the autoantigen of coeliac disease. Gut, 41: Sollid L.M., Molberg Ø., McAdam S., Lundin K.E.A. (1997). Autoantibodies in celiac disease: tissue transglutaminase-guilt by association?. Gut, 41: Salmaso C., Ocmant A., Pesce G., Altrinetti V., Montagna P., Descalzi D., Martini S., Bagnasco M., Mascara F. (2001). Comparison of ELISA for tissue transglutaminase autoantibodies with antiendomysium antibodies in pediatric and adult patients with celiac disease. Allergy, 56: Carroccio A., Vitale G., Di Prima L., Chifari N., Napoli S., La Russa C., Gulotta G., Averna M.R., Montalto G., Mansueto S., Notarbartolo A. (2002). Comparison of Anti-Transglutaminase ELISAs and an Anti-Endomysial Antibody Assay in the Diagnosis od Celiac Disease: A Prospective Study. Clinical Chemistry, 48 (9): Van Wijk M.A.M., van der Lei J., Mosseveld M., Bohenen A.M., van Bemmel J.H. (2002). Compliance of General Practitioners with a Guideline-based Decision Support System for Ordering Blood Tests. Clinical Chemistry, 48 (1): Kocna P., Vanìčkovà Z., Perušičovà J., Dvořàk M. (2002). Tissue Transglutaminase-Serology Markers for Celiac Disease. Clin. Chem. Lab. Med., 40 (5): Hansson T., Dahlbom I., Rogberg S., Dannaeus A., Höpfl P., Gut H., Kraaz W., Klareskog L. (2002). Recombinant Human Tissue Transglutaminase for Diagnosis and Follow-Up of Childhood Coeliac Disease. Pediatric Research, 51 (6): F. Cataldo, D. Lio, V. Marino, A. Picarelli, A. Ventura, GR Corazza (2000). IgG antiendomysium and IgG anti-tissue-transglutaminase antibodies in coeliac patients with selective IgA deficiency. Gut 2000; 47: V. Kumar, M. Jarzabek-Chorzelska e al. (2002). Coeliac disease and Immunoglobulin A deficiency: how effective are the serologicals methods of diagnosis? Clinical and diagnostic laboratory Immunology, Nov. 2002, pag T. Hansson, I. Dahlbom e al. (2002). Recombinant human tissue transglutaminase for diagnosis and follow-up of chikdhood coeliac disease. Pediatric research vol. 51, n 6, I R Korponay-Szabo, I. Dahlbom e al. (2003). Elevation of IgG antibodies against tissue transglutaminase as a diagnostic tool for coeliac disease in selective IgA deficiency. Gut 2003, 52: M412 Rev.1 04/2008 Pag. 23/24

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