TPOAb IEMA WELL REF KT21IW. Italiano p. 3 English p. 12. M325 Rev.2 09/2007

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1 TPOAb IEMA WELL REF KT21IW 96 Italiano p. 3 English p. 12 M325 Rev.2 09/2007

2 Reagenti del Kit - Kit Reagents Materiale Fornito Materials Supplied Quantità Package size Formulazione Formulation Stato fisico Physical state MTP 1 x 96 pozz./wells Pronti per l'uso Ready to use CAL 6 x 2 ml Pronto per l'uso Ready to use Liquido liquid CONJ 1 x 15 ml Pronto per l'uso Ready to use Liquido liquid CTR 2 x 2 ml Pronto per l'uso Ready to use Liquido liquid DIL 1 x 15 ml Concentrato Concentrate Liquido liquid WASH 1 x 50 ml Concentrato Concentrate Liquido liquid SUBS 1 x 15 ml Pronto per l'uso Ready to use Liquido liquid TMB 1 x 15 ml Pronto per l'uso Ready to use Liquido liquid STOP 1 x 14 ml Pronto per l'uso Ready to use Liquido liquid "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M325 Rev.2 09/2007 Pag. 2/24

3 DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEGLI AUTOANTICORPI ANTI- TIREOPEROSSIDASI (TPOAb) NEL SIERO O PLASMA UMANO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE Pazienti affetti da tireopatie anche molto diverse tra loro, come ipo ed ipertiroidismo (morbo di Hashimoto e morbo di Graves) presentano spesso nel siero autoanticorpi diretti contro l'antigene microsomiale (TMAb) e la tireoglobulina (TgAb). L'autoimmunità tiroidea è più frequente nelle donne. La concentrazione degli anticorpi nelle donne aumenta con l'età, dal 10 % (18-24 anni) al 30 % (55-65 anni) per il TgAb e dal 15% (18-24 anni) al 24% (55-65 anni) per il TMAb. Questi titoli significativi possono condurre allo sviluppo di tireopatie croniche che si risolvono spesso in ipotiroidismi. Il maggior responsabile dell'autoimmunità nella frazione microsomiale tiroidea è un enzima: la Perossidasi Tiroidea (TPO). La misura degli autoanticorpi diretti contro la Perossidasi Tiroidea (TPOAb) si è rivelata molto sensibile e altamente specifica per la determinazione di malattie autoimmuni. Le tireopatie asintomatiche con ipertiroidismo transitorio sono frequenti come effetto post-partum. Inoltre in soggetti che presentano gozzi moderati si è riscontrata un'elevata concentrazione di TPOAb. La valutazione di TgAb e TPOAb è stata recentemente proposta tra le indagini per le gravidanze a rischio. Nel mixedema idiopatico significativi livelli di TgAb e TPOAb evidenziano lo stadio terminale di tireopatia autoimmune cronica atrofica. Nei pazienti più giovani un evidente gozzo associato a valori elevati di TgAb e TPOAb è generalmente sintomo del morbo di Hashimoto, caratterizzato da una progressiva diminuzione delle funzioni tiroidee che porta fino all'ipotiroidismo. Nel morbo di Graves il gozzo tossico è associato a tiroiditi croniche, come confermato da alti livelli di TgAb e TPOAb. Il monitoraggio del TgAb, TMAb ed TPOAb è frequentemente usato durante la terapia. Infine il TgAb può dare informazioni sul rischio di trasmissione di malattie autoimmuni in una famiglia. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato sul metodo immunoenzimometrico (IEMA) ed impiega quale fase solida pozzetti di polistirene sensibilizzati con TPO umana ricombinante (purezza>95%). Durante la prima incubazione, gli autoanticorpi eventualmente presenti nei calibratori e nei campioni si legano all'antigene adeso sulla fase solida. Al termine dell'incubazione, il materiale non legato viene rimosso mediante aspirazione e lavaggio. Si aggiunge ai pozzetti il coniugato enzimatico (anticorpo Anti-hIgG umane coniugato a perossidasi di rafano), che si lega agli eventuali anticorpi catturati durante la prima incubazione. Dopo ulteriore lavaggio, l'attività enzimatica residua fissata sulla fase solida sarà quindi direttamente proporzionale alla concentrazione di TPOAb nei calibratori e nei campioni, e viene evidenziata aggiungendo ai pozzetti una soluzione di Cromogeno (tetrametilbenzidina, TMB) in Tampone Substrato. L'intensità del colore sviluppato viene misurata mediante uno spettrofotometro a 450 nm e 405 nm. 3. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. Il kit deve essere conservato a 2-8 C. La data di scadenza di ogni reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. Dopo apertura il kit è stabile un mese se conservato a +2 8 C. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 3/24

4 3.1 Reagenti Specifici MTP CAL Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra da 96 pozzetti separabili singolarmente sensibilizzati con TPO umana ricombinante ad alta purezza. I pozzetti non utilizzati devono essere riposti a 2-8 C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente e protetta dall'umidità. Calibratori: 6 flaconi (2 ml) di TPOAb in siero umano prediluito, alle seguenti concentrazioni: 0, 50, 150, 300, 1000 e 3000 U/ml. Pronti per l'uso. Conservante: NaN 3 (<0.1%). I calibratori sono stati tarati con la Preparazione di Riferimento MRC 66/387 della NIBSC. CONJ Coniugato Enzimatico: 1 flacone (15 ml) di anti-higg coniugato con perossidasi di rafano (HRPO) in tampone TRIS, BSA e stabilizzanti. Conservante: Neomicina. Pronto per l'uso. CTR DIL Sieri di Controllo: 2 flaconi (2 ml) di siero umano prediluito. Pronti per l uso. Conservante:NaN 3 (<0.1%). 1 flacone: siero negativo; 1 flacone: siero positivo. Diluente dei Campioni TPOAb/TgAb IEMA (concentrato): 1 flacone (15 ml) di tampone fosfato con BSA. Conservante: NaN 3 (<0.1%). Portare il contenuto del flacone a 150 ml con H 2 O distillata. La soluzione così diluita, è stabile 1 mese a 2-8 C. 3.2 Reagenti comuni per tutti i kit della linea ormonale RADIM WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata): 1 flacone (50 ml) di tampone fosfato con detergente. Conservante: Mertiolato (<0.1%). Portare il contenuto a 500 ml con H 2 O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli, ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. La soluzione così diluita è stabile 1 mese a 2-8 C. TMB Cromogeno: 1 flacone (15 ml) di tetrametilbenzidina in tampone citrato- fosfato e DMSO. SUBS Tampone Substrato:1 flacone (15 ml) di tampone citrato-fosfato H 2 O 2. N.B.: Prima dell'uso, unire parti uguali di Cromogeno e di Tampone Substrato, per un volume sufficiente al dosaggio. Tenere la miscela al riparo dalla luce. STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 ml) di H 2 SO 4 1N. Pronto per l'uso. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 4/24

5 CPA Copripiastra adesivo - Busta di plastica trasparente con minigrip. 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO 4.1 Dosaggio Manuale Micropipette automatiche a punte intercambiabili a volume variabile. Cilindri graduati per la diluizione dei reattivi Agitatore termostatato per micropiastre regolabile a 37 C ± 2 C e 1200 rpm. Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell'intervallo A ad una lunghezza d'onda di 450 nm e di 405 nm. Carta millimetrata. H 2 O distillata. 4.2 Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati riproducibili, é necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. E possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Non rispettare: la sequenza e la quantità nell aggiunta dei reattivi i tempi e la temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 5/24

6 Accertarsi che tutta la strumentazione usata (vetreria, agitatore e lavatore per micropiastre, spettrofotometro, stufa termostatata, frigoriferi usati per la conservazione dei kit e dei campioni) sia perfettamente funzionante, adeguatamente calibrata e sia soggetta ad un regolare piano di manutenzione. Un uso non accurato di ognuno di questi strumenti può produrre errori metodologici che possono condizionare la riproducibilità e l affidabilità dei risultati ottenuti. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, é necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infetti; pertanto i rifiuti del dosaggio devono essere decontaminati ed eliminati secondo opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito; il materiale non combustibile deve essere sterilizzato in autoclave per almeno 1 ora a 121 C. I rifiuti liquidi (se contenenti acido) vanno prima neutralizzati con quantità proporzionali di base e comunque in seguito addizionati di ipoclorito di sodio fino ad una concentrazione finale del 3%, lasciando agire almeno 30 minuti. La sodio azide contenuta in alcuni reagenti, può reagire con il piombo ed il rame delle tubature formando azidi di metallo esplosive. Per evitarne la formazione e l'accumulo far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. 6. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma. I campioni fortemente lipemici o emolizzati devono essere scartati. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 1- M325 Rev.2 09/2007 Pag. 6/24

7 2 giorni; per periodi più lunghi congelare a -20 C; si consiglia di non scongelarli ripetutamente. I campioni di plasma possono presentare filamenti di fibrina che interferiscono nel dosaggio: assicurarsi che siano limpidi. Diluire i campioni prima del dosaggio nel modo seguente: 10 μl di campione μl di Diluente (diluizione 1:101 ) I Calibratori e sieri di controllo sono pronti per l'uso. 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO (*) Portare reagenti ed i campioni a temperatura ambiente. Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. 7.1 Preparare i pozzetti necessari per: Bianco, Calibratori, Sieri di Controllo e Campioni. 7.2 Dispensare 100 µl di ogni Calibratore, del Siero di Controllo e dei Campioni diluiti, nei rispettivi pozzetti. Dispensare direttamente nel fondo dei pozzetti. 7.3 Incubare 60 minuti a 37 C in agitazione. 7.4 Lavare i pozzetti 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio diluita, aspirando completamente il liquido da tutti i pozzetti. 7.5 Dispensare 100 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti, eccetto il Bianco. 7.6 Incubare 30 minuti a 37 C in agitazione. 7.7 Lavare i pozzetti 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio diluita, aspirando completamente il liquido da tutti i pozzetti. 7.8 Dispensare 200 µl della soluzione Substrato-Cromogeno (vedi paragrafo reagenti), in tutti i pozzetti. 7.9 Incubare per 10 minuti a 37 C in agitazione al riparo dalla luce intensa Dispensare 100 µl di Reagente Bloccante in tutti i pozzetti Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm e 405 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico, con lunghezza d'onda di riferimento a 620nm (azzerando lo strumento con il Bianco). La lettura deve essere effettuata entro 20 minuti dal termine del dosaggio. (*) Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico Radim e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. 8. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi pagina CALCOLO DEI RISULTATI Al fine di ottenere una migliore sensibilità, il presente metodo utilizza una lettura spettrofotometrica a due lunghezze d'onda (450 e 405 nm). I campioni con concentrazione di TPOAb compresa tra 0 e 300 U/ml dovranno essere letti a 450 nm. I campioni con livelli di TPOAb superiori a 300 U/ml dovranno essere letti a 405 nm. Disegnare la curva di calibrazione su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le dosi del calibratore e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per M325 Rev.2 09/2007 Pag. 7/24

8 ciascuno calibratore. Interpolando sulla curva standard le assorbanze relative a ciascun campione si otterranno le corrispondenti concentrazioni di TPOAb in U/ml. * Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura. 9.1 Esempio di calcolo I valori sotto riportati devono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione U/ml D.O. media TPOAb U/ml CAL CAL CAL CAL CAL CAL CTR 1 < CTR Campione Campione Campione Esempio della Curva di Calibrazione 5 4,5 D.O. 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 U/ml Criteri di accettabilità Il dosaggio si considera valido se rientra nei seguenti limiti: M325 Rev.2 09/2007 Pag. 8/24

9 Bianco < D.O. S. Controllo 1 (Negativo) < 40 U/ml S. Controllo 2 (Positivo) Vedi certificato di C.Q. allegato 9.3 Interpretazione dei risultati I valori riportati nella tabella, determinati su 300 campioni, sono soltanto indicativi poiché influenzati da fattori contingenti quali clima, area geografica e dieta. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento. Valori normali per TPOAb Valori dubbi per TPOAb Valori elevati per TPOAb < di 40 U/ml U/ml > di 75 U/ml 10 CARATTERISTICHE METODOLOGICHE 10.1 Specificità Il presente metodo analitico non ha mostrato reazioni crociate con anticorpi diretti contro la tireoglobulina umana Sensibilità La sensibilità è stata calcolata sulla curva di calibrazione ed espressa come minima dose significativamente distinguibile dalla risposta del Calibratore Zero (valore medio +2 D.S.). Tale dose è risultata pari a 4.2 U/ml. I calibratori del kit TPOAb sono tarati contro lo standard primario anti-tms (antigene microsomiale tiroideo) MRC 66/387 della società NIBSC. E l unico standard disponibile su scala internazionale per gli anticorpi anti-tpo anche se non è stato mai adottato dalla WHO (Organizzazione Mondiale Sanità) come Standard Internazionale. Oggi è generalmente accettato che nei microsomi tiroidei, l antigene principale sia la TPO. Quindi se il dosaggio è tarato contro MRC 66/387 della NIBSC, può essere considerato tarato contro un riferimento di anti-tpo. Si potrà quindi esprimere in Unità per ml (U/ml) sia la concentrazione di ogni calibratore sia quella dei campioni Precisione La precisione è stata determinata misurando la ripetibilità e la riproducibilità (variabilità intra-saggio ed inter-saggio) su 3 sieri a differenti concentrazioni di autoanticorpi TPOAb. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 9/24

10 Ripetibilità ( variabilità Intra-saggio) Tre sieri sono stati dosati in 24 replicati. Siero Media (U/ml) D.S. (U/ml) C.V. (%) Replicati n. a b c Riproducibilità (variabilità Inter-saggio) Ogni siero dosato in quadruplicato e stato analizzato in 10 sessioni. Siero Media (U/ml) D.S. (U/ml) C.V. (%) Dosaggi n. a b c ACCURATEZZA L'accuratezza del metodo è stata valutata mediante il test di parallelismo. Test di Parallelismo Due sieri a diverso titolo di TPOAb sono stati dosati a varie diluizioni con il calibratore Zero. Diluizione Atteso Misurato Recupero (U/ml) (U/ml) (%) S1 indiluito / / / / S2 indiluito / / / / M325 Rev.2 09/2007 Pag. 10/24

11 N.B.: Con certi sieri la diluizione può essere non lineare a causa della eterogeneità degli auto-anticorpi. 11. LIMITI DEL DOSAGGIO Come per qualsiasi procedura analitica la diagnosi di un paziente non può essere fatta in base al risultato di un singolo dosaggio. I risultati ottenuti da questo metodo immunoenzimatico contribuiscono alla diagnosi etiopatogenica di autoimmunità tiroidea ma non ne costituiscono l unico elemento nella pratica clinica. 12. LEGENDA SIMBOLI: vedi pagina 20. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 11/24

12 IMMUNOENZYMOMETRIC ASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF ANTI THYROPEROXIDASE AUTOANTIBODIES (TPOAb) IN HUMAN SERUM OR PLASMA FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS Autoimmune thyroid diseases encompass a wide spectrum of different clinical symptoms varying from hypo- to hyperthyroidism (Hashimoto's disease and Graves' disease). The link between these extremes is the presence of serum auto-antibodies directed against the microsomal antigen (TMAb) and/or thyroglobulin (TgAb). Thyroid autoimmunity is more frequently registered in women. Antibody prevalence in women increases with age, rising from approximately 10% at the age of up to 30% at the age of for TgAb and from 15% at the age of up to 24% at the age of for TMAb. These significant TgAb and TMAb titers can lead to the development of chronic thyroiditis, often resulting in hypothyroidism. The main microsomal agent responsible for autoimmunity is an enzyme: thyroperoxidase (TPO). The detection of auto-antibodies against thyroperoxidase (TPOAb) is known to be a highly sensitive as well as specific tool in diagnosing autoimmune diseases. Asymptomatic thyroid diseases with transient hyperthyroidism have been frequently noted in post-partum conditions. Subjects with moderate-sized goiters exhibit high TPOAb levels. A rise in TgAb and TPOAb has recently been proposed as an independent marker for "at-risk" pregnancies. In cases of primary myxoedema, significant TgAb and TPOAb levels indicate the endstage of autoimmune atrophic chronic thyroiditis. In younger patients, a firm goiter found in combination with high TgAb and TPOAb levels is generally a sign of Hashimoto's disease, characterized by a progressive decrease in thyroid function leading to hypothyroidism. In Graves' disease, the toxic goiter is associated to chronic thyroiditis, as confirmed by high TgAb and TPOAb levels. Monitoring of TgAb, TMAb and TPOAb levels is frequently used for treatment follow-up. TgAb can also be used as a marker for the identification of family members exposed to the risk of transmission of autoimmune conditions. 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY This test is based on an immunoenzymometric assay (IEMA). The solid phase (polystyrene microwells) is coated with human recombinant thyroperoxidase (>95% purity). During the first incubation, autoantibodies present in calibrators and samples bind to the antigen coated on the solid phase. Following a wash step conjugate is added (anti-higg antibody conjugated to horseradish peroxidase) which binds to the antibodies captured during the first step. Following a second wash step, a chromogenic solution is added. The enzyme reaction is halted by the addition of an acidic solution. The colour produced is directly proportional to TPOAb concentration in Calibrators and samples and is measured in a photometer at 450 nm. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 12/24

13 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT Reagents are sufficient for 96 wells. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each component is shown on the vial label. The kit has an expiry of one month after opening, if stored at 2-8 C. 3.1 Specific Reagents MTP Coated Microtiterplate: 1 microplate for 96 breakable wells coated with human recombinant thyroperoxidase. Keep unused wells at 2-8 C. Protect from moisture by carefully sealing within the provided plastic bag. CAL Calibrators: 6 vials (2 ml) of TPOAb in prediluted human serum, at the following concentrations: 0, 50, 150, 300, 1000 and 3000 U/ml. Ready for use. Preservative: NaN 3 (<0.1%). These calibrators have been calibrated against the MRC 66/387 Reference Standard from NIBSC. CONJ Enzyme Conjugate: 1 vial (15 ml) of anti-higg conjugated to horseradish peroxidase (HRPO), in Tris buffer containing BSA and stabilizers. Preservative: Neomycin. Ready for use. CTR DIL Control Serum: 2 vials (2 ml) of prediluted human serum. Ready for use. Preservative: NaN 3 (<0.1%). 1 vial: negative serum; 1 vial: positive serum. Sample Diluent TPOAb/TgAb IEMA (concentrated): 1 vial (15 ml) of phosphate buffer with BSA. Preservative: NaN 3 (<0.1%). Bring bottle content to 150 ml with distilled water. The diluted sample diluent is stable for 1 month at 2-8 C. 3.2 Common Reagents for use with the RADIM Hormone Line WASH TMB Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 ml) of Phosphate buffer with detergent. Preservative: Thimerosal (<0.1%). Bring bottle content to 500 ml with distilled water. If any undissolved crystals are detected allow them to redissolve by placing the vial at 37 C for a few minutes. The diluted washing solution is stable for 1 month at 2-8 C. Chromogen: 1 vial (15 ml) of Tetramethylbenzidine in citrate-phosphate buffer and DMSO. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 13/24

14 SUBS STOP CPA Substrate Buffer: 1 vial (15 ml) of citrate-phosphate buffer containing H 2 O 2. Note: Before use, prepare a solution with equal volumes of Chromogen and Substrate Buffer sufficient for the test required. Avoid exposure to direct sunlight. Blocking Reagent: 1 bottle (14 ml) of 1N H 2 SO 4. Ready for use. Adhesive microtiterplate cover - Clear plastic bag with minigrip 4. MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 4.1 Manual Procedure Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Graduated cylinder. Thermostatic microplate shaker, adjustable at 37 C ± 2 C and 1200 rpm. Aspiration pump or automated well washing device. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a A interval at 450 and 405 nm wavelength. Millimetric graph paper. Distilled H 2 O. 4.2 Automated Procedure This test can be used with automated instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its application on RADIM and/or SEAC automated instruments. While using a non RADIM or SEAC automated instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. 5. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. It is possible to use common reagents (see 3.2) from different lots. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify the "Assay Procedure", in any way. Altering: volume of reagent added exact temperature and incubation times M325 Rev.2 09/2007 Pag. 14/24

15 may cause incorrect clinical results. In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that all the equipment used (glassware, dry heater, microplate shaker, microplate washers, spectrophotometer and fridge/freezers used for reagent and sample storage) is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Any deviation from the correct use of the equipment listed can produce errors in the methodology, this may affect the reproducibility and reliability of results obtained. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Some reagents contain sodium azide as preservative; to prevent build-up of explosive metal azides in lead and copper plumbing, reagents should be discarded by flushing the drain with large amounts of water. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. 6. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum or plasma samples. Highly lipemic or hemolyzed samples must be discarded. Keep samples at 2-8 C for 1-2 days; for longer periods it is advisable to freeze samples in aliquots at -20 C. Plasma samples may contain fibrin filaments which could interfere with the assay. Ensure that samples are always perfectly clear before testing. Repeated freeze/thawing of samples should be avoided. Sample dilution M325 Rev.2 09/2007 Pag. 15/24

16 Before testing, samples must be diluted 1:101 as follows: 10 µl Sample µl Diluent. Calibrator and Control Sera are ready for use. 7. ASSAY PROCEDURE (*) Allow reagents and samples to warm up to room temperature. Mix samples by inversion before use. 7.1 Prepare the wells for: Blank, Calibrators, Control Sera and samples. 7.2 Dispense 100 µl of each Calibrators, Control Serum and diluted sample into the corresponding wells. Dispense directly at the bottom of each well. 7.3 Shake for 60 minutes at 37 C. 7.4 Wash the wells 4 times with 350 µl of diluted washing solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.5 Dispense 100 µl of Enzyme Conjugate into each well, except for the Blank wells. 7.6 Shake for 30 minutes at 37 C. 7.7 Wash the wells 4 times with 350 µl of diluted washing solution. Aspirate all liquid from the wells. 7.8 Dispense 200 µl of Substrate-Chromogen solution (see reagent paragraph) into each well. 7.9 Shake for 10 minutes at 37 C, avoid direct light exposure Dispense 100 µl of Blocking Reagent into each well Read the absorbance of the wells preferably with a bichromatic spectrophotometer at 450 and 405 nm, with reference wavelength at 620nm (setting the instrument at zero with the Blank well). Reading must be completed within 20 minutes from the end of the assay. (*) Please refer to the appropriate instrument manual if using automated microtiterplate instruments supplied by Radim. 8. ASSAY SCHEME: see page CALCULATION OF RESULTS * In order to obtain a better sensitivity, the present method employs spectrophotometric reading at two wavelengths (450 and 405 nm). For samples with TPOAb ranging from 0 to 300 U/ml, read at 450 nm; for samples with TPOAb higher than 300 U/ml, read at 405 nm. Draw a calibrator curve on millimetric graph paper, by plotting the calibrator concentration (x-axis) against the absorbance obtained for each calibrator (y-axis). Corresponding TPOAb concentrations in U/ml are obtained by interpolating the absorbances of each sample on the standard curve. * While using a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, the spectrophotometric reading will be performed automatically at 3 different wavelengths: 450, 405 and 620 nm, thereby allowing a wider curve range. M325 Rev.2 09/2007 Pag. 16/24

17 9.1 Example of calculation The values shown below must be considered as an example and must not be used in place of experimental data. Description U / ml O.D. mean CAL CAL CAL CAL CAL CAL CTR 1 CTR 2 Sample 1 Sample 2 Sample 3 < TPOAb U/ml Typical Calibrator curve 5 4,5 D.O. 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 U/ml Acceptable limits The tests are acceptable if within the following limits: Blank < O. D. Control Serum 1 (Negative) < 40 U/ml Control Serum 2 (Positive) See enclosed Q.C. data sheet M325 Rev.2 09/2007 Pag. 17/24

18 9.3 Interpretation of results The normal values determined on 300 samples, are only indicative since they may be affected by various agents (climate, geographic area, diet, etc.). We recommend that each laboratory establishes its own normal range. Normal values for TPOAb Borderline values for TPOAb Elevated values for TPOAb < 40 U/ml U/ml > 75 U/ml 10. PERFORMANCES OF THE ASSAY 10.1 Specificity No cross-reactions have been observed with anti-tg autoantibodies present in human serum Sensitivity The sensitivity was calculated based upon the calibrator curve and expressed as the minimal dose showing a significant difference from the Zero Calibrator (mean value + 2 S.D.). This dose is 4.2 U/ml. The TPOAb calibrators are referenced against the primary standard anti-tms (thyroid microsomal antigen ) MRC 66/387 from NIBSC. It is the only internationally available standard for TPO antibodies, although it has never been adopted by the WHO (World Health Organization ) as an International Standard. TPO is now usually considered the major antigen present in thyroid microsomes and a test, calibrated against anti-tms MRC 66/387 from NIBSC, can be considered calibrated against an anti-tpo reference. Calibrator and sample concentrations may be expressed as Unit per ml (U/ml) Precision Precision was evaluated measuring the Within and Between Run C.V. % of 3 sera at different TPOAb concentrations. Repeatability (Intra-assay) Serum Mean(U/ml) S.D.(U/ml) C.V.(%) Replicates n. a b c M325 Rev.2 09/2007 Pag. 18/24

19 Reproducibility (Inter-assay) 4 replicates of each serum are tested in 10 separated assays. Serum Mean (U/ml) S.D. (U/ml) C.V. (%) Test n. a b c Accuracy Accuracy of the method has been checked by using parallelism tests. Parallelism Test Two sera with different TPOAb concentrations were tested at different dilutions with the Zero Calibrator. Diluted Expected measured Recovery (U/ml) (U/ml) (%) S1 undiluted / / / / S2 undiluted / / / / Note: Because of the heterogeneity of autoantibodies, for some patient samples a nonlinear dilution may occur. 11. LIMITATION OF THE PROCEDURE As with all diagnostic tests, a definite clinical diagnosis should not be based on the results of a single test, but should only be made by the physician after all clinical and laboratory findings have been evaluated. 12. SYMBOLS LEYEND: see p. 20 M325 Rev.2 09/2007 Pag. 19/24

20 12. SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / Reference or order code / Référence ou numéro de commande / Referencia o número de pedido / Referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / Referenční nebo objednací číslo Lotto / Lot / Lot / Lote / Lote / Charge / παρτίδα / Parti / šarže Data di scadenza / Expiry date / Date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento/ Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / Datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / Aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / In vitro diagnostik kullanım / Pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / Marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / Marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / Marcação-CE segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / Keep at 2-8 C / Conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / Skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / Produzido por / Fabricante / Produkt der / κατασκευάζεται από / Tarafından üretilmiştir / Výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Biogefährdung/ Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné Consultare la metodica operativa / Consult instructions for use / Consulter le mode opératoire / Consultar las instrucciones de uso / Consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / Kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití 96 Sufficiente per 96 test / Sufficient for 96 tests / Suffisant pour 96 déterminations / Suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / Genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / Dostačující pro 96 testů M325 Rev.2 09/2007 Pag. 20/24

21 RDATE Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia/ Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / Referenční datum RCNS Ricostituire con / Reconstitute with / Reconstituer avec / Reconstituir con / Reconstituir com / Rekonstituiren mit / ανασυστάται με / Ile karıştırma / Rekonstituovat H 2 O Acqua distillata o deionizzata / Deionized or distilled water / Eau deionisée ou distillée / Agua destilada o desionizada / Água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο -απεσταγμένο νερό / Deiyonize veya distile su / Deionizovaná nebo destilovaná voda M325 Rev.2 09/2007 Pag. 21/24

22 Bibliografia - References 1 - Larsen P.R. Triiodothyronine: review of recent studies of its physiology and pathophysiology in man. Metabolism 1972 Nov. Vol: 21 (11), p: Brown.J. Chopra I.J. Cornell J.S et al. Thyroid physiology in health and disease. ANNINTERNMED, 1974, 81/1 (68-81). 3 - Singer P.A., Nicoloff J.T., Estimation of the triiodothyronine secretion rate in euthyroid man. J. Clin. Endocr. Metab Jan. Vol: 35 (1), p Surks M.I. Schadlow A.R. Stock J.M. Oppenheimer J.H. Determination of iodothyronine absorption and conversion of L-thyroxine (T 4 ) to L-triiodothyronine (T 3 ) using turnover rate techniques. J.Clin.Invest 1973 Apr. Vol: 52 (4), p: Fleischer N. Burgus R. Vale W. Dunn T. Guillemin R. Preliminary observations on the effect of synthetic thyrotropin releasing factor on plasma thyrotropin levels in man. J.Clin.Endocrinol.Metab Jul, Vol: 31 (1), p: Sterling K. Refetoff S. Selenkow H.A. T 3 thyrotoxicosis, Thyrotoxicosis due to elevated serum triiodothyronine levels. Jama 1970 Jul 27, Vol: 213 (4), p: Hollander C.S. and Shenkman L., in B. Rothfeld ed, "Nuclear Medicine in Vitro" (Philadelphia: Lippincott, 1974). 8 - Ekins, R. : Measurements of free hormones in blood. Endocrine Reviews, 1990, 11 (1), Maberly G., Waite K., MA G., Soni N., and Eastman C. Binding characteristics of Thyroxin Binding Globulin in serum of normal, pregnant and severely III euthytoid patients. Clin. Chem. 1986, 32 (4), Midgley J. E. M. Direct and indirect free thyroxine assay methods: theory and practice. Clin. Chem. 2001, 47 (8), M325 Rev.2 09/2007 Pag. 22/24

23 SCHEMA DEL DOSAGGIO ASSAY SCHEME Diluizione del Campione, Sample Dilution : 1/ µl di Campione/Sample µl di Diluente/Diluent Pozzetti Wells Bianco Blank CAL (0-5) CTR Campioni Samples CAL (0 5) µl CTR 1, µl ---- Campioni /Samples µl Incubare ed agitare / Incubate and shake: 37 C x 60' Aspirare e lavare / Aspirate and wash: 4 x 350 µl CONJ µl 100 µl 100 µl Incubare ed agitare / Incubate and shake : 37 C x 30' Aspirare e lavare / Aspirate and wash: 4 x 350 µl TMB SUBS 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Incubare ed agitare / Incubate and shake : 37 C x 10' STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leggere a / Read at 450 nm 405 nm Usare come riferimento / Use as reference 620 nm M325 Rev.2 09/2007 Pag. 23/24

24 RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.it -