DHEA-S EIA WELL REF KS19EW. Italiano p. 3 English p. 12. M146 Rev.6 05/2009

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1 DHEA-S EIA WELL REF KS19EW 96 Italiano p. 3 English p. 12 M146 Rev.6 05/2009

2 REAGENTI DEL KIT - KIT REAGENTS Reag, Reac Quant. MTP 1 x 96 pozz./wells Pronti per l'uso, Ready for use CAL 6 x 1 ml Liof., Lyoph. CONJ 1 x 2.7 ml Conc. DIL CONJ 2 x 12 ml Pronto per l'uso, Ready for use CTR 1 x 1 ml Liof., Lyoph. WASH 1 x 50 ml Conc. TMB 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use SUBS 1 x 15 ml Pronto per l'uso, Ready for use STOP 1 x 14 ml Pronto per l'uso, Ready for use "Le Istruzioni per l'uso tradotte nelle altre lingue di interesse sono consultabili sul sito Internet all'indirizzo The instructions for use available in the other languages of interest can be viewed on our website Οι οδηγίες χρήσης μεταφρασμένες στις άλλες ενδιαφερόμενες γλώσσες όπως επίσης στην ηλεκτρονική διεύθυνση In den anderen Sprachen von Interesse ist die Bedienungsanleitung kann auf der Website unter der Adresse konsultiertwerden. "Le mode d emploi dans les autres langues intéressées est consultable sur le site Internet à l'adresse Las instrucciones de uso traducidas en los otros idiomas de interés se pueden consultar en nuestro sitio Internet "As instruções de uso traduzidas nos outros idiomas de interesse podem ser consultadas no nosso site Internet, ao endereço M146 Rev.6 05/2009 Pag. 2/24

3 DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DEL DEIDROEPIANDROSTERONE SOLFATO (DHEA-S) NEL SIERO O PLASMA UMANO. PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO APPLICAZIONI CLINICHE Il Deidroepiandrosterone solfato (DHEA-S) è un ormone steroideo a 19 atomi di carbonio, secreto in massima parte dalla zona reticolare della corteccia surrenalica. La sua concentrazione plasmatica è estremamente elevata, ed è circa 500 volte superiore a quella del DHEA, a causa della sua più lenta clearance metabolica. Il DHEA-S circola legato all'albumina sierica, ma non alla SHBG. Le concentrazioni sieriche di DHEA-S non presentano variazioni circadiane, né fluttuazioni legate al ciclo mestruale. Il DHEA-S viene eliminato nelle urine, dove i suoi metaboliti costituiscono la quota principale dei 17-chetosteroidi. Il DHEA-S ha un'attività androgenica piuttosto debole, ma può essere metabolizzato a androstenedione e testosterone, che hanno un effetto virilizzante molto maggiore. Le concentrazioni sieriche di DHEA-S sono elevate alla nascita, e decrescono durante le prime 3 settimane di vita, fino a raggiungere i valori normali del bambino prepubere. A partire dai 6 anni circa i livelli di DHEA-S cominciano ad aumentare gradualmente, raggiungendo verso i anni i valori riscontrabili negli adulti. In caso di pubertà ritardata i livelli di DHEA-S si mantengono più bassi della norma, mentre in un quadro clinico di pubertà precoce il DHEA-S è elevato rispetto all'età ossea e in accordo con lo sviluppo pilifero del pube. Dalla pubertà fino ai anni i livelli di questo steroide si mantengono costanti; successivamente si osserva, in entrambi i sessi, una loro graduale diminuzione. Durante la gravidanza la concentrazione sierica di DHEA-S diminuisce gradatamente, raggiungendo a termine valori all'incirca dimezzati rispetto ai normali. Il dosaggio del DHEA-S è di grande utilità nell'indagare la funzionalità surrenalica in una serie di patologie endocrine. Tra di esse elenchiamo: Ipersurrenalismo: nell'irsutismo di origine surrenalica si riscontrano elevati valori di DHEA-S, e questi valori sono significativamente maggiori nelle forme di irsutismo sostenute da processi eteroplasici rispetto a quelle funzionali. Alti livelli di DHEA-S si riscontrano spesso nella sindrome da ovaio policistico. Il dosaggio del DHEA-S è inoltre consigliabile durante i test dinamici di soppressione surrenalica; a differenza del Cortisolo, che torna ai valori di presoppressione dopo circa 24 ore dalla sospensione del blocco con Desametazone, i valori del DHEA-S rimangono soppressi per giorni. Iposurrenalismo: il DHEA-S nelle forme di iposurrenalismo primario o secondario risulta al di sotto della norma. Infertilità: nella donna irsuta amenorroica la soppressione farmacologica del DHEA-S porta ad un ripristino del ciclo mestruale e della fertilità. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 3/24

4 Sindrome virilizzante da iperplasia surrenalica congenita: in questo quadro clinico i valori di DHEA-S risultano marcatamente elevati. PRINCIPIO DEL METODO Il presente kit è basato su un metodo immunoenzimatico competitivo ed impiega quale fase solida pozzetti sensibilizzati con anticorpi anti-dhea-s specifici. Aggiungendo nei pozzetti il siero del paziente ed il coniugato (DHEA-S coniugato con perossidasi di rafano) si ha competizione tra DHEA-S sierico e coniugato per i siti leganti degli anticorpi. Al termine dell'incubazione, il materiale non legato viene rimosso mediante aspirazione e lavaggio. L'attività enzimatica rimasta fissata sulla fase solida sarà quindi inversamente proporzionale alla concentrazione di DHEA-S nei Calibratori e nei Campioni, e viene evidenziata aggiungendo ai pozzetti una soluzione di Cromogeno (tetrametilbenzidina, TMB) e un Tampone Substrato. L'intensità del colore sviluppato viene misurata mediante uno spettrofotometro a 450 e 405 nm. REAGENTI CONTENUTI NEL KIT: PREPARAZIONE E STABILITA' I reagenti sono sufficienti per 96 pozzetti. Il kit deve essere conservato a 2-8 C. La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. Una volta aperto, il kit è stabile 2 mesi a 2-8 C. MTP Micropiastra Sensibilizzata: 1 micropiastra con 96 pozzetti separabili singolarmente, sensibilizzati con anticorpi specifici anti-dhea-s (coniglio). I pozzetti non utilizzati devono essere conservati a 2-8 C nella bustina di plastica trasparente fornita, sigillata accuratamente. CAL Calibratori: 6 flaconi contenenti DHEA-S in PBS, BSA e stabilizzanti, in forma liofila, alle seguenti concentrazioni: 0, 0.1, 0.3, 1, 3 e 10 µg/ml. Conservante: Neomicina. Ricostituire ciascun flacone con 1 ml di H 2 O distillata. Dopo ricostituzione, conservare a 2-8 C per 7-10 giorni; per periodi più lunghi congelare a -20 C. N.B.: verificare sempre l'esatta concentrazione sul foglio di C.Q. CONJ Coniugato Enzimatico (concentrato): 1 flacone (2.7 ml) di DHEA-S, coniugato con perossidasi di rafano (HRPO) in tampone TRIS con BSA e stabilizzanti. Conservante: Neomicina. Al momento dell'uso, aggiungere 1.2 ml di Coniugato al flacone del Diluente del Coniugato Enzimatico, mescolando accuratamente. Il Coniugato diluito è stabile per 8 settimane a 2-8 C. DIL CONJ Diluente del Coniugato Enzimatico: 2 flaconi (12 ml) di tampone TRIS con BSA e ANS. Pronto per l'uso. Conservante: Neomicina. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 4/24

5 CTR Siero di Controllo: 1 flacone di DHEA-S in matrice sierica, liofilo. Conservante: Neomicina. Ricostituire con 1 ml di H 2 O distillata. Dopo ricostituzione, conservare a 2-8 C per 7-10 giorni; per periodi più lunghi congelare a -20 C. N.B.: verificare sempre l'esatta concentrazione sul foglio di C.Q. WASH Soluzione di Lavaggio (concentrata): 1 flacone (50 ml) di PBS- Tween20. Conservante: Mertiolato (<0.05%). Portare il contenuto del flacone a 500 ml con H 2 O distillata. Nel caso siano presenti cristalli insoluti, risospenderli ponendo il flacone a 37 C per qualche minuto. La soluzione diluita è stabile 1 mese a 2-8 C. TMB Cromogeno: 1 flacone (15 ml) di tetrametilbenzidina in tampone citratofosfato e DMSO. Pronto per l'uso. SUBS Tampone Substrato: 1 flacone (15 ml) di tampone citrato-fosfato e H 2 O 2. Pronto per l'uso. N.B.: Per ottenere la Soluzione Substrato, miscelare in parti uguali il Cromogeno (8) con il Tampone Substrato (9) utilizzando un flacone scuro e ben pulito; tenere la soluzione così preparata al riparo dalla luce. Dispensare la soluzione entro 1 ora dal momento della preparazione. STOP Reagente Bloccante: 1 flacone (14 ml) di H 2 SO 4 1N. Pronto per l'uso. CPA Copripiastra adesivo Bustina di plastica trasparente con minigrip MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Dosaggio Manuale Micropipette automatiche a punte intercambiabili a volume variabile. Termostato ad aria, regolabile a 37 C. Cilindro graduato. Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. Spettrofotometro di precisione per micropiastre, con possibilità di misura in assorbanza nell'intervallo A ad una lunghezza d'onda di 450 nm e a 405 nm. Carta millimetrata. H 2 O distillata. Dosaggio Automatico Il dispositivo può essere utilizzato con strumentazione automatica di kit ELISA su micropiastra. Si garantisce l applicabilità su strumentazione RADIM e/o SEAC M146 Rev.6 05/2009 Pag. 5/24

6 Qualora si utilizzi strumentazione automatica di altri fornitori, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per ottenere risultati corretti e riproducibili, è necessario osservare le seguenti norme: Non mescolare i reagenti specifici (vedi 3.1) di lotti differenti. E possibile utilizzare reagenti comuni (vedi 3.2) di lotti differenti. Non usare i reagenti dopo la data di scadenza. Non esporre i reattivi e i campioni a calore intenso o a forti sorgenti di inquinamento. Usare vetreria perfettamente pulita ed esente da contaminazioni di ioni metallici o sostanze ossidanti. Usare acqua distillata o deionizzata, conservata in recipienti perfettamente puliti. Evitare accuratamente contaminazioni tra campioni; a tal fine è consigliabile usare pipette con puntali monouso per ogni campione e per ogni reattivo. Non modificare in alcun modo il Procedimento Operativo di esecuzione del test. Eventuale non rispetto di: sequenza e quantità nell aggiunta dei reattivi tempi e temperatura di incubazione può dare luogo a risultati clinici errati. Ricostituire gli eventuali reagenti liofili secondo le modalità descritte sulle etichette. Eventuale utilizzo di reattivi o volumi non idonei, può provocare l ottenimento di dati clinici non attendibili. In caso di procedura manuale è importante l utilizzo di pipette calibrate e possedere un adeguata manualità tecnica. In particolare è essenziale una buona precisione nella preparazione e dispensazione dei reattivi. E necessario un adeguato piano di manutenzione (pulizia e calibrazione) di tale strumentazione. Accertarsi che tutta la strumentazione usata (vetreria, agitatore e lavatore per micropiastre, spettrofotometro, stufa termostatata, frigoriferi usati per la conservazione dei kit e dei campioni) sia perfettamente funzionante, adeguatamente calibrata e sia soggetta ad un regolare piano di manutenzione. Un uso non accurato di ognuno di questi strumenti può produrre errori metodologici che possono condizionare la riproducibilità e l affidabilità dei risultati ottenuti. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. Utilizzare un adeguato metodo per la corretta identificazione dei campioni. Possibili conseguenze possono essere sia la perdita di specificità del dispositivo che risultati analitici errati. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 6/24

7 Per evitare contaminazioni personali ed ambientali, è necessario osservare le seguenti norme di sicurezza: Utilizzare guanti monouso durante la manipolazione di materiale potenzialmente infetto e durante il dosaggio. Non pipettare i reagenti con la bocca. Non fumare, mangiare, bere o applicare cosmetici durante l'esecuzione del dosaggio. Le soluzioni di Cromogeno e Reagente Bloccante vanno manipolate con cautela. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose. In caso di incidente lavare abbondantemente con acqua. I materiali di origine umana utilizzati nella preparazione del presente kit sono stati saggiati per la presenza di HBsAg, anti-hiv e anti-hcv e sono risultati ripetutamente negativi. Comunque nessun test attualmente disponibile garantisce l'assenza degli agenti virali responsabili della sindrome da immunodeficienza acquisita, dell'epatite B ed epatite C. Tutti i reagenti contenenti materiale biologico e tutti i campioni di siero umano devono essere considerati potenzialmente infettivi. Evitare la produzione di schizzi e la formazione di aerosol; qualora ciò si verificasse ripulire accuratamente con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 3%. Il mezzo adoperato per la pulizia deve essere trattato come residuo potenzialmente infetto ed eliminato secondo le modalità opportune. Ai sensi del D.L. italiano n. 22 del , che fa riferimento alle direttive CEE (91/156/CEE, 91/689/CEE, 94/62/CEE) tutti i rifiuti provenienti da lavorazioni manuali e/o in automatico sono classificati rifiuti speciali pericolosi con codice di classificazione CER ; devono quindi essere eliminati affidandoli a ditte autorizzate al ritiro ed allo smaltimento. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato su siero o plasma prelevato con EDTA. I campioni fortemente lipemici od emolizzati devono essere scartati. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 1-2 giorni; per periodi più lunghi conservarli a -20 C. I campioni di plasma possono presentare filamenti di fibrina che interferiscono nel dosaggio; assicurarsi pertanto che i campioni siano perfettamente limpidi prima di dosarli. Si consiglia di non congelare e scongelare ripetutamente i campioni. PROCEDIMENTO OPERATIVO* Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. Agitare i campioni per inversione prima dell'uso. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 7/24

8 1 - Preparare i pozzetti per: Bianco, Calibratori, Siero di Controllo e Campioni. 2 - Dispensare 20 µl di ciascun Calibratore, del Siero di Controllo e dei Campioni nei rispettivi pozzetti. 3 - Dispensare 200 µl di Coniugato Enzimatico in tutti i pozzetti, eccetto quelli del Bianco. 4 - Coprire la micropiastra con il foglio adesivo ed agitare delicatamente la piastra. 5 - Incubare per 60 minuti a 37 C. 6 - Rimuovere il foglio adesivo ed aspirare accuratamente la miscela di incubazione da tutti i pozzetti. 7 - Lavare i pozzetti 4 volte con 350 µl di Soluzione di lavaggio diluita. Aspirare completamente il liquido da tutti i pozzetti. 8 - Dispensare 200 µl della soluzione Cromogeno-Substrato (vedi paragrafo reagenti), in tutti i pozzetti. 9 - Incubare per 15 minuti a 37 C al riparo dalla luce troppo intensa Dispensare 100 µl di Reattivo Bloccante in tutti i pozzetti Leggere la densità ottica delle soluzioni a 450 nm e a 405 nm in uno spettrofotometro preferibilmente bicromatico, con lunghezza d'onda di riferimento a 620 nm (azzerando lo strumento con il Bianco). La lettura può essere effettuata entro 20 minuti dal termine del dosaggio. * Qualora si utilizzasse nel procedimento operativo uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, far riferimento al relativo manuale. SCHEMA DEL DOSAGGIO: vedi p. 23 CALCOLO DEI RISULTATI Nel caso si utilizzi uno strumento automatico per micropiastre RADIM e/o SEAC, la lettura spettrofotometrica è eseguita automaticamente a 3 lunghezze d'onda: 450, 405 e 620 nm, permettendo l'ampliamento del range di lettura. Al fine di ottenere una migliore sensibilità, il presente metodo utilizza una lettura spettrofotometrica a due lunghezze d'onda (450 e 405 nm). Per i campioni con concentrazione di DHEA-S compresa tra 1 e 10 µg/ml dovrà essere utilizzata la misura a 450 nm; per campioni con livelli di DHEA-S inferiori a 1 µg/ml, il calcolo dovrà essere effettuato sulle misure a 405 nm. Disegnare la curva di calibrazione su carta millimetrata, riportando sull'asse delle ascisse le dosi dei calibratori e su quello delle ordinate l'assorbanza ottenuta per ciascun calibratore. Interpolando sulla curva di calibrazione le assorbanze relative a ciascun campione si otterranno le corrispondenti concentrazioni di DHEA-S in µg/ml. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 8/24

9 ESEMPIO DI CALCOLO I valori sotto riportati devono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione Assorb. 450 nm DHEA-S Assorb. 405 nm DHEA-S Calibratore 0 µg/ml > Calibratore 0.1 µg/ml > Calibratore 0.3 µg/ml Calibratore 1.0 µg/ml Calibratore 3.0 µg/ml Calibratore 10.0 µg/ml Campione 1 > µg/ml Campione µg/ml VALORI NORMALI I valori riportati nella tabella seguente sono soltanto indicativi. Si raccomanda a ciascun laboratorio di stabilire i propri intervalli di riferimento. Sesso Donna Uomo Età µg/ml µg/ml Neonati Prepuberi Adulti Gravidanza > 50 anni Criteri di accettazione Prima di procedere al calcolo dei risultati, verificare che la concentrazione del siero di controllo rientri nel range di accettazione descritto nel Foglio di Controllo Qualità. CARATTERISTICHE METODOLOGICHE SPECIFICITÀ L'antisiero anti-dhea-s utilizzato ha mostrato le seguenti reazioni crociate: 100% con DHEA-S e DHEA, 19% con Androstenedione, 9% con Androsterone e inferiore allo 0.01% con Testosterone, DHT, 17-OH-Progesterone, Progesterone ed Estrone. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 9/24

10 SENSIBILITÀ La sensibilità è stata calcolata sulla curva di calibrazione ed espressa come minima dose significativamente distinguibile dalla risposta del Calibratore Zero (valore medio - 3 D.S.). Tale dose è risultata pari a 0.08 µg/ml. PRECISIONE La precisione é stata valutata misurando la variabilità intra-saggio ed inter-saggio su 3 sieri a differenti concentrazioni di DHEA-S. Intra-saggio (Ripetibilità) Siero Media ± D.S. C.V. Replicati (µg/ml) % n. a ± b 1.39 ± c 2.61 ± Inter-saggio (Riproducibilità) Siero Media ± D.S. C.V. Dosaggi (µg/ml) % n. a 0.52 ± b 1.25 ± c 2.48 ± ACCURATEZZA L'accuratezza del metodo è stata valutata mediante il test di recupero ed il test di parallelismo: Test di Recupero Quantità scalari di DHEA-S sono state aggiunte ad un campione di siero e dosate. Aggiunto Atteso Misurato Recupero (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) % S S S S M146 Rev.6 05/2009 Pag. 10/24

11 Test di Parallelismo Un siero ad elevato contenuto di DHEA-S è stato dosato a varie diluizioni con il Calibratore Zero. Diluizione Atteso Misurato (µg/ml) (µg/ml) S2 indiluito : : : LIMITI DEL DOSAGGIO I risultati del dosaggio devono essere interpretati con cautela e convalidati da valutazioni cliniche ed ulteriori prove diagnostiche LEGENDA SIMBOLI: vedi p. 20 M146 Rev.6 05/2009 Pag. 11/24

12 ENZYMEIMMUNOASSAY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF DEHYDROEPIANDROSTERONE-SULPHATE (DHEA-S) IN HUMAN SERUM OR PLASMA. FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY CLINICAL APPLICATIONS Dehydroepiandrosterone-sulphate (DHEA-S) is a steroid hormone (19 carbon atoms) secreted mainly by the zone reticularis of the adrenal cortex. Its concentration in human plasma is extremely high (about 500 times higher than DHEA) due to its slower metabolic clearance. DHEA-S circulates bound to serum albumin but not to SHBG. Serum DHEA-S lacks a circadian rhythm, nor does it exhibit fluctuations related to the menstrual cycle. It is eliminated through the urine, in which it accounts for the major fraction of 17-ketosteroids. The androgenic activity of DHEA-S is rather weak, although it can be metabolized into androstenedione and testosterone, both having a much greater virilizing effect. DHEA-S serum concentrations are high at birth, thence decreasing in the newborn during the first three weeks of life, until the normal values of pre-pubertal children are reached. Starting from about six years of age, DHEA-S levels gradually begin to rise until adult values are reached around years of age. Low serum DHEA-S levels have been found in case of delayed puberty, while the opposite has been observed in precocious puberty (DHEA-S levels higher as compared to skeletal age and based upon pubic hair growth). From puberty up to years of age DHEA-S levels remain steady, after which a progressive decrease is observed in both sexes. During pregnancy, serum DHEA-S levels follow a gradual decrease until a 50% reduction with respect to normal values is reached at pregnancy term. DHEA-S measurement is an important tool in checking adrenal function in several pathologies among which we mention: Adrenal hyperfunction: high DHEA-S levels are observed in hirsutism of adrenal origin and these levels are significantly higher in the forms of hirsutism due to heteroplasic processes as compared to functional hirsutism. DHEA-S concentrations are often high in polycystic ovary syndrome. DHEA-S measurement is also advisable during adrenal suppression tests: as opposed to Cortisol (which returns to previous levels, 24 hours after suspending dexamethasone administration), DHEA-S values remain suppressed for days. Adrenal hypofunction: DHEA-S values in primitive or secondary hypoadrenalism are below normal. Infertility: In hirsute amenorrheic women, pharmacological suppression of DHEA-S restores the menstrual cycle as well as fertility. Virilizing syndrome due to congenital adrenal hyperplasia: markedly high values are reported for such cases. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 12/24

13 PRINCIPLE OF THE ASSAY This method is based on a competitive enzyme immunoassay (EIA), where wells coated with specific anti-dhea-s antibodies are used as solid phase. During the first incubation, the sample/calibrator DHEA-S competes with the DHEA-S conjugated to horseradish peroxidase (HRPO), for binding to the specific antibody sites on the wells. After the incubation, all unbound material is removed by aspiration and washing. The residual enzyme activity found in the wells, which is inversely proportional to the DHEA-S concentration in calibrators and samples, will be evidenced by adding a Chromogen solution (Tetramethylbenzidine, TMB) in substrate buffer to the wells. Colorimetric reading will be performed by using a spectrophotometer at 450 and 405 nm. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT: PREPARATION AND STABILITY The reagents are sufficient for 96 tests. Store the kit at 2-8 C. The expiry date of each reagent is shown on the vial label. Once opened the kit is stable at 2-8 C for 2 months MTP Coated Microplate: 1 microplate with 96 breakable wells, coated with anti- DHEA-S specific antibodies (rabbit). Keep unused wells at 2-8 C in the provided plastic bag and carefully sealed. CAL Calibrators: 6 vials of DHEA-S in PBS, BSA and stabilizers, lyophilized, at the following concentrations: 0, 0.1, 0.3, 1, 3 and 10 µg/ml. Preservative: Neomycin. Reconstitute each vial with 1 ml of distilled H 2 O. After reconstitution, store at 2-8 C for 7-10 days; for longer periods freeze at-20 C. NOTE: refer to the C.Q. sheet, for exact concentrations. CONJ Enzyme Conjugate (concentrated): 1 vial (2.7 ml) of DHEA-S conjugated to horseradish peroxidase (HRPO) in TRIS buffer with BSA and stabilizers. Preservative: Neomycin. Before use, add 1.2 ml of Conjugate to the Conjugate Diluent vial and mix thoroughly. Store the diluted Conjugate at 2-8 C for 8weeks. DIL CONJ Conjugate Diluent: 2 vials (12 ml) of TRIS buffer with BSA and ANS. Ready for use. Preservative: Neomycin. CTR Control Serum: 1 vial of DHEA-S in serum matrix. Lyophilized. Preservative: Neomycin. Reconstitute with 1 ml of distilled H 2 O. After reconstitution, store at 2-8 C for 7-10 days; for longer periods freeze at -20 C. NOTE: refer to the C.Q. sheet, for exact concentrations. WASH Washing Solution (concentrated): 1 vial (50 ml) of PBS-Tween 20. Preservative: Thimerosal (<0.05%). Take vial content to 500 ml with distilled H 2 O. In presence of undissolved crystals, re-suspend the solution by placing the vial at 37 C for a few minutes. Store the diluted Washing Solution at 2-8 C for 1 month. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 13/24

14 TMB Chromogen: 1 vial (15 ml) of Tetramethylbenzidine with citrate-phosphate buffer and DMSO. Ready for use. SUBS Substrate Buffer: 1 vial (15 ml) of citrate-phosphate buffer and H 2 O 2. Ready for use. NOTE: In order to obtain the Substrate Solution, mix equal volumes of Chromogen (8) with Substrate Buffer (9) by using a dark, thoroughly clean vial. Avoid direct light exposure and use within 1hour from preparation. STOP Blocking Reagent: 1 vial (14 ml) of 1N H 2 SO 4. Ready for use. CAP Adhesive plate sealer Plastic bag with minigrip MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Manual Test Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. Dry Heater, adjustable at 37 C. Graduated cylinder. Aspiration pump or automated well washing device. Microplate spectrophotometer capable of measuring absorbances within a A interval at 450 and 405 nm. Millimetric graph paper. Distilled H 2 O. Automatic Test This test can be used with automatic instrument for ELISA kits on microplate. We guarantee its applications on RADIM and/or SEAC automatic instruments. While using a non RADIM or SEAC automatic instrument for microplate, it is under end user responsibility, to make sure that it was appropriately tested for ELISA kits. WARNINGS AND PRECAUTIONS In order to obtain correct and reproducible results, the following rules must be observed: Do not mix specific reagents (see 3.1) from different lots. It is possible to use common reagents (see 3.2) from different lots. Do not use reagents beyond their expiry date. Do not store or leave reagents and samples at high temperatures or areas of possible contamination. Use thoroughly clean glassware, free from metal ion contamination or oxidizing substances. Use distilled or deionized water, stored in perfectly clean containers. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 14/24

15 Carefully avoid any contamination among samples; for this purpose, disposable tips should be used for each sample and reagent. Do not modify the "Assay Procedure", in any way. Altering: volume of reagent added exact temperature and incubation times may cause incorrect clinical results. Reconstitute lyophilized reagents, if present, as described on the relative labels. Any deviation in reagent use or wrong volumes, may affect the reliability of results obtained. In case of manual procedure, it is important to use calibrated pipettes and have appropriate technical manuals. Primary importance is a good precision preparing and dispensing the reagents. Ensure that all the equipment used is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Ensure that all the equipment used (glassware, dry heater, microplate shaker, microplate washers, spectrophotometer and fridge/freezers used for reagent and sample storage) is in perfect working order, has been correctly calibrated and is regularly maintained. Any deviation from the correct use of the equipment listed can produce errors in the methodology, this may affect the reproducibility and reliability of results obtained. Utilise a suitable method for the correct identification of patient samples. Incorrect identification may cause a specificity losses of the system and wrong clinical results. In order to avoid personal and environmental contamination, the following precautions must be observed: Use disposable gloves while handling potentially infectious material and while performing the assay. Do not pipette reagents by mouth. Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics during the assay. Chromogen and Blocking Reagent should be handled with care. Avoid contact with skin, eyes and mucous membranes. In case of accident rinse thoroughly with running water. All material of human origin used for the preparation of this kit tested negative for HBsAg, anti-hiv and anti-hcv. Since no test at present can guarantee complete absence of these viruses, all samples and reagents containing biological material used for the assay must be considered potentially infectious. Avoid splashing and aerosol formation; in such cases, carefully wash with a 3% sodium hypochlorite solution. Any such cleaning material must be treated as potentially infectious and disposed of accordingly. According to Italian decree D.L. no. 22 dated , in compliance with EEC directives (91/156/EEC, 91/689/EEC, 94/62/EEC), all waste products originating from either manual and/or automated processing are classified as hazardous special waste material (European classification code180103). As M146 Rev.6 05/2009 Pag. 15/24

16 such, they must be eliminated by delegating to special enterprises, qualified for waste collection and disposal. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION The assay can be performed in serum or EDTA-collected plasma samples. Highly lipemic or hemolyzed samples must be discarded. Keep samples at 2-8 C for 1-2days; for longer periods it is advisable to freeze samples at -20 C. Plasma samples may present fibrin filaments which could interfere with the assay; make sure that samples are always perfectly clear before testing. Repeated freezing and thawing of samples should be avoided. ASSAY PROCEDURE* Allow reagents and samples to warm up at room temperature. Mix samples by inversion before use. 1 - Prepare the wells for: Blank, Calibrators, Control Serum and Samples. 2 - Pipette 20 µl of each Calibrator, Control Serum and Sample into the corresponding wells. 3 - Add 200 µl of Enzyme Conjugate into each well, except for the Blank well. 4 - Cover the microplate with the adhesive sheet and mix gently. 5 - Incubate for 60 minutes at 37 C. 6 - Remove the adhesive sheet and carefully aspirate the incubation mixture from all wells. 7 - Wash the wells 4 times with 350 µl of diluted Washing Solution. Aspirate all liquid from the wells. 8 - Pipette 200 µl of Substrate-Chromogen solution (see reagent paragraph) into all wells. 9 - Incubate for 15 minutes at 37 C, avoid direct light exposure Pipette 100 µl of Blocking Reagent into all wells Read the absorbance of the wells with a bichromatic spectrophotometer at 450 and 405 nm, with reference wavelength at 620 nm (setting the instrument at zero with the Blank well). Reading must be completed within 20 minutes from the end of the assay. * While using for the procedure a RADIM and/or SEAC automatic instrument for microplates, refer to its relative manual. ASSAY SCHEME: see p. 23 CALCULATION OF RESULTS M146 Rev.6 05/2009 Pag. 16/24

17 In order to obtain a better sensitivity, the present method employs spectrophotometric reading at two wavelengths (450 and 405 nm). For samples with DHEA-S concentrations ranging from 1 to 10 µg/ml, read at 450 nm; for samples with DHEA-S levels lower than 1 µg/ml, read at 405nm. Draw a calibration curve on millimetric graph paper, by plotting the calibrators concentrations (x-axis) against the absorbance obtained for each calibrator (yaxis). Corresponding DHEA-S concentrations in µg/ml are obtained by interpolating the absorbances of each sample on the calibration curve. EXAMPLE OF CALCULATION The values shown below must be considered as an example and must not be used in place of experimental data. Description Absorb. 450 nm DHEA-S Absorb. 405 nm DHEA-S Calibrator 0 µg/ml > Calibrator 0.1 µg/ml > Calibrator 0.3 µg/ml Calibrator 1.0 µg/ml Calibrator 3.0 µg/ml Calibrator 10.0 µg/ml Sample 1 > µg/ml Sample µg/ml NORMAL VALUES The values reported below are indicative. We suggest that each laboratory establishes its own normal range. Sex Women Men Age µg/ml µg/ml Newborn Pre-pubertal Adults Pregnancy > 50 years Validation Criteria Before proceeding to calculation of results, make sure the control serum concentration is included within the value described on the Quality Control Sheet. PERFORMANCES OF THE ASSAY M146 Rev.6 05/2009 Pag. 17/24

18 SPECIFICITY The anti-dhea-s antiserum employed has given the following cross-reactions: 100% with DHEA-S and DHEA, 19% with Androstenedione, 9% with Androsterone and less than 0.1% with Testosterone, DHT, 17- Hydroxyprogesterone, Progesterone and Estrone. SENSITIVITY The sensitivity was calculated based upon the calibration curve and expressed as the minimal dose showing a significant difference from the Zero Calibrator (mean value - 3 S.D.). This dose is 0.08 µg/ml. PRECISION Precision was evaluated upon intra- and inter-assay variability, in 3 sera at different DHEA-S concentrations. Intra-assay (Repeatability) Serum Mean ± S.D. C.V. Replicates (µg/ml) % no. a ± b 1.39 ± c 2.61 ± Inter-assay (Reproducibility) Serum Mean ± S.D. C.V. Assays (µg/ml) % no. a 0.52 ± b 1.25 ± c 2.48 ± ACCURACY Accuracy of the method has been checked by the recovery and parallelism tests: Recovery Test Known amounts of DHEA-S have been added to a serum sample and tested. Added Expected Measured Recovery (µg/ml) (µg/ml) (µg/ml) % S S S S M146 Rev.6 05/2009 Pag. 18/24

19 Parallelism Test A serum with high DHEA-S concentration was tested at different dilutions with Zero Calibrator. Dilution Expected Measured (µg/ml) (µg/ml) S2 undiluted : : : LIMITS OF THE ASSAY The results of the assay must be carefully interpreted and confirmed by clinical evaluations and further diagnostic tests. SYMBOLS LEGEND: see p. 20 M146 Rev.6 05/2009 Pag. 19/24

20 12. SIMBOLI, SYMBOLS, SYMBOLES, SÍMBOLOS, SÍMBOLOS, SYMBOLE, ΣΥΜΒΟΛΑ, SYMBOLIT, SYMBOLER EN 980 EDMA REF LOT Codice di riferimento o di ordine / Reference or order code / Référence ou numéro de commande / Referencia o número de pedido / Referência ou número da encomenda / Referenz oder Bestellnummer / κωδικός προϊόντος ή παραγγελίας / Refarans veye sipariş numarsı / Referenční nebo objednací číslo Lotto / Lot / Lot / Lote / Lote / Charge / παρτίδα / Parti / šarže Data di scadenza / Expiry date / Date d expiration / Fecha de caducidad / Data de vencimento/ Verfallsdatum / Ηµεροµηνία λήξης / Son kullanma targhi / Datum expirace IVD Per uso diagnostico in-vitro / For in-vitro diagnostic use / Pour diagnostic in-vitro / Para uso diagnóstico In-vitro / Aplicação do diagnóstico In-vitro / Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK / για in vitro διαγνωστική χρήση / In vitro diagnostik kullanım / Pro použití in-vitro Marcatura CE secondo le direttive IVD 98/79/CE / CE marking according to IVD guidelines 98/79/EC / Marquage CE conforme aux directives IVD 98/79/EC / Marcado CE según directiva de IVD 98/79/CE / Marcação-CE segundo a directriz-ivd 98/79/CE / CE- Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79/EG / Σηµανση CE βάσει κοινοτικής οδηγίας IVD 98/79/EC / 98/79/EC IVD tüzüğüne göre CE işareti / CE označení dle IVD 98/79/EU Conservare a 2-8 C / Keep at 2-8 C / Conserver à 2-8 C / Conservar a 2-8 C / conservar a 2-8 C / Lagerung bei 2-8 C / φύλαξη στους 2-8 C / 2-8 C da saklayınız / Skladovat při 2-8 C Fabbricante / Manufacturer / Fabriquant / Produzido por / Fabricante / Produkt der / κατασκευάζεται από / Tarafından üretilmiştir / Výrobce Rischio biologico / Biohazard / Risque Biologique / Riesgo Biológico / Risco Biológico / Biogefährdung/ Bιολογικός κίνδυνος / Riziko tehlike biyolojik/ Biologicky nebezpečné M146 Rev.6 05/2009 Pag. 20/24

21 Consultare la metodica operativa / Consult instructions for use / Consulter le mode opératoire / Consultar las instrucciones de uso / Consultar as instruções de uso / Schauen Sie die Arbeitsanleitung an / συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης / Kullanımda başvurulacak bilgiler / Sledujte návod k použití 96 RDATE RCNS H 2 O Sufficiente per 96 test / Sufficient for 96 tests / Suffisant pour 96 déterminations / Suficiente para 96 determinaciones / Componentes para 96 testes / Genügend für 96 Tests / επαρκεί για 96 τεστ / 96 test için yeterli / Dostačující pro 96 testů Data di Riferimento / Reference date / Date de référence / Fecha de referencia / Data de refêrencia/ Referenzdatum / ημερομηνία βαθμονόμησης / Referans Targhi / Referenční datum Ricostituire con / Reconstitute with / Reconstituer avec / Reconstituir con / Reconstituir com / Rekonstituiren mit / ανασυστάται με / Ile karıştırma / Rekonstituovat Acqua distillata o deionizzata / Deionized or distilled water / Eau deionisée ou distillée / Agua destilada o desionizada / Água destilada ou deionizada / Deionisiertes oder Destilliertes Wasser / απιονισμένο - απεσταγμένο νερό / Deiyonize veya distile su / Deionizovaná nebo destilovaná voda M146 Rev.6 05/2009 Pag. 21/24

22 BIBLIOGRAFIA-REFERENCES 1 - Abraham GE, Manlimos FS: The role of adrenal cortex in hirsutism, The Endocrine Function of the Human Adrenal Cortex edited by VHT James, M. Serio, G. Giusti, L. Martini. New York, Academic Press, 1978, p Abraham GE, Stevenson GW, Chiamori NY: Clinical indications for serum DHEA-S measurements. Clinical Lab. Products 11: 38-42, May Abraham GE: The role of the adrenal cortex in female infertility, The Infertile Female, edited by R. Givens. Chicago, Yearbook Publishers, 1979, p Maroulis GB, Manlimos FS, Abraham GE: Comparison between urinary 17- ketosteroids and serum androgens in hirsute patients. Obstet. Gynec. 49: 454, Lobo RA, Paul WL, Goebelsmann U: Dehydroepiandrosterone sulfate as an indicator for adrenal androgen function. Obstet. Gynecol. 57: 69, Buster JE, Abraham GE: Radioimmunoassay of plasma dehydroepiandrosterone sulfate. Analyt Letters 5: 543, Abraham GE: Evaluation and treatment of the hyperandrogenized woman Endocrinology of the Ovary, edited by R Scholler. Paris, Editions SEPE, 1978 pp Chakmakjian ZH, Abraham GE: Peripheral steroid levels in a patient with virilizing adrenal adenoma. Obstet. Gynecol. 47: 544, Lobo RA, Goebelsmann U: Evidence for reduced 3-β-ol hydroxysteroid dehydrogenase activity in some hirsute women thought to have polycystic ovary syndrome. J Clin. Endocrinol. Metab. 53: 394, Abraham GE, Maroulis GB, Buster JE, Chang RJ, Marshall JR: The effect of dexamethasone on serum cortisol and androgen levels in hirsute patients. Obstet. Gynecol. 47: 395, Granoff AB, Abraham GE: Peripheral and adrenal venous levels of steroids in a patient with virilizing adrenal tumor. Obstet. Gynecol. 53: 111, Abraham GE: Androgens in women: Methodological and pathophysiological aspects, Radioimmunology 1979, edited by CA Bizollon. Elsevier/North Holland Biomedical Press, 1979, pp Abraham GE: Ovarian and adrenal contribution to peripheral steroids during the menstrual cycle in two hirsute women. Obstet. Gynec. 46: 29, Abraham GE: The application of steroid radioimmunoassay to gynecologic endocrinology, in Progress in Gynecology, Vol. VI, edited by Taymore, TH Green. New York, Grune and Stratton, 1975, pp Glass AR, Dahms WT, Abraham GE, Bray GA, Swerdloff RS: Secondary amenorrhea in obesity: Etiologic role of weight-related androgen excess. Fertil Steril 30: 243, Chang RJ, Abraham GE: Effect of dexamethasone and clomiphene citrate on peripheral steroid levels and ovarian function in a hirsute amenorrheic patient. Fertil Steril 27: 640, M146 Rev.6 05/2009 Pag. 22/24

23 SCHEMA DEL DOSAGGIO - ASSAY SCHEME Reag. Pozzetti, Wells Bianco, Blank (Bo) CAL (0-5) CTR Campioni, Samples CAL (0-5) µl CTR µl ---- Campioni, Samples µl CONJ µl 200 µl 200 µl Incubare, Incubate: 37 C 60'. Aspirare e lavare, Aspirate and wash: 4 x 350 µl. TMB - SUBS 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl Incubare, Incubate: 37 C 15'. STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Leggere, Read: nm. M146 Rev.6 05/2009 Pag. 23/24

24 RADIM S.p.A. - Via del Mare, Pomezia (Roma) Italia Tel.: Fax: National Order Entry: Export Department: Customer Care: info@radim.com -