Mantenimento della forma della cellula

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1 MICROFILAMENTI Mantenimento della forma della cellula Movimento ameboide Locomozione cellulare Contrazione cellulare Divisione cellulare Motilità intracellulare

2 MICROFILAMENTI Struttura Diametro Due catene di actina filamentosa (F ACTINA) 8 nm Subunità actina G (globulare)

3 Lo studio della funzione dell actina si vale di diverse sostanze che ne inibiscono la funzione: CITOCALASINA induce depolarizzazione dell actina FALLOIDINA blocca la depolarizzazione LATRUNCULINA blocca i monomeri liberi b. Esposizione a CITOCALASINA (5 min.)

4 Poiché ogni monomero di actina ha una polarità e tutte le subunità sono orientate nel filamento allo stesso modo, il filamento di actina F risulta polarizzato. Ogni monomero è ruotato di 166 nel filamento, che quindi appare come una doppia elica

5 L actina è una proteina che lega e idrolizza ATP. L estremità + ha una affinità per l actina/atp dieci volte maggiore dell estremità -. Quindi l estremità + cresce dieci volte più velocemente della - L ATP è idrolizzato in un momento successivo all incorporazione del monomero nel polimero.

6 In teoria non serve l ATP per far polimerizzare l actina, ma l actina-atp polimerizza più facilmente di actina-adp, mentre l actina-adp depolimerizza più facilmente. (A mano a mano che procede la polimerizzazione l actina idrolizza l ATP).

7 Come per i microtubuli anche per i microfilamenti è molto importante l assemblaggio ed il disassemblaggio TREADMILLING It occurs when one end of a filament grows in length while the other end shrinks resulting in a section of filament seemingly "moving" across a stratum or the cytosol. This is due to the constant removal of the protein subunits from these filaments at one end of the filament while protein subunits are constantly added at the other end Esiste una concentrazione critica dei monomeri alla quale la velocità del loro assemblaggio è uguale alla velocità di disassemblaggio: filamenti in apparente equilibrio

8 Quindi. 1) La concentrazione critica di monomeri per l aggiunta alla estremità è più alta di quella richiesta per la crescita dell estremità + 2) Dato che l ATP e idrolizzato poco dopo l incorporazione, a concentrazioni critiche per l estremità - è più facile trovare actina-atp all estremità + e actina-adp all estremità 3) Visto che l actina-adp depolimerizza più facilmente dell actina- ATP, al di sotto di una certa concentrazione di monomeri l estremità + cresce e la depolimerizza.

9 Come per i microtubuli, le cellule mantengono un equilibrio dinamico tra le forme monomerica e polimerica dell actina. Cambiamenti delle condizioni locali della cellula (influenzati da parecchie proteine accessorie diffusibili) possono spostare l equilibrio verso l assemblaggio o il disassemblaggio. Questa riorganizzazione è necessaria per processi dinamici come la locomozione cellulare, i cambiamenti di forma e la citochinesi.

10 La miosina rappresenta il motore molecolare dei filamenti di actina (miosine: superfamiglia che comprende almeno 18 membri) Miosini convenzionali coinvolte nelle contrazioni muscolari, nella citodieresi, nel mantenimento della tensione alle adesioni focali La Miosina II è formata da sei catene polipeptidiche : 2 catene pesanti e 2 coppie di catene leggere. Si distinguono: due teste globulari (siti catalitici), due colli (alfa elica della catena pesante più due catene leggere), una coda (avvolgimento di due alfa eliche delle catene pesanti)

11 MLCK: Myosin light chain kinase (Ser Threo kinase) fosforila la catena Leggera della miosina, attivandola La testa miosinica ha attività ATPasica. Due delle quattro catene leggere, dette regolatrici, hanno siti di fosforilazione con cui controllano l attività delle teste e il dispiegamento delle code, lequali possono così interagire tra di loro in modo parallelo o antiparallelo per formare aggregati di filamenti bipolari.

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13 Il ciclo ATPasico regola la contrazione della testa miosinica sul filamento di actina Il legame con l ATP, l idrolisi in ADP+Pi e il rilascio dell ADP provocano diverse modificazioni conformazionali responsabili dello scatto della testa della miosina legata al filamento di actina che viene così spostato

14 MODELLO SCHEMATICO DELLA CONTRAZIONE ACTINA/MIOSINA

15 Actina e miosina II si organizzano nell unità contrattile del muscolo scheletrico, il sarcomero. Due grandi proteine, titina e nebulina, contribuiscono alla struttura e stabilità del sarcomero. La titina è una specie di molla che tiene aperto il sarcomero in condizione di riposo. La nebulina regola la lunghezza e l assemblaggio dei filamenti di actina. Altre proteine incappucciano l estremità+ del filamento di actina. Nel disco Z è contenuta anche α-actinina.

16 Lo stimolo elettrico determina un accumulo di calcio intracellulare. Il Ca++ agisce su due proteine accessorie legate all actina, la troponina e la tropomiosina. A bassa concentrazione di Ca++ la tropomiosina interferisce con il legame della miosina all actina, mentre alte concentrazioni di Ca++ provocano uno slittamento del complesso troponina-tropomiosina, che libera il sito di attacco per la miosina sull actina.

17 Miosine non convenzionali: collaborano con i microtubuli nel trasporto di diversi tipi di vescicole

18 Rab27a regulates the localization and exocytosis of lysosome-related organelles in different cell types through distinct effector proteins. Olkkonen V M, and Ikonen E J Cell Sci 2006;119: * identified disease mutations 2006 by The Company of Biologists Ltd

19 Assenza di gene normale per la miosina Va o per Rab27: Sindrome di GRISCELLI (autosomica recessiva), caratterizzata da ipopigmentazione, Immunodeficienza (deficit dell attività citotossica dei linfociti T, Cellule natural killer)

20 Proteine associate ai microfilamenti sono responsabili della conversione dei microfilamenti da una forma all altra - Alcune controllano la polimerizzazione legandosi ai monomeri e impedendo ai microfilamenti di aggregarsi - Alcune li stabilizzano - Alcune li frammentano - Alcune raggruppano i microfilamenti in fasci paralleli - Alcune li organizzano in reti tridimensionali - Alcune si associano ai microfilamenti per formare fasci contrattili

21 1. iniziazione: formina, complesso Arp Proteine che legano l actina alla membrana ERM (ezrina, radixina moesina) e membri delle spettrine (tra cui la DISTROFINA, proteina (se alterata) responsabile della distrofia muscolare

22 La polimerizzazione dei microfilamenti di actina comincia in un centro di nucleazione in cui la proteina dimerica Formina assembla i primi monomeri di actina G. Anche la più rapida polimerizzazione successiva è guidata dalla formina che mantiene i monomeri di actina nella conformazione corretta per una più efficiente polimerizzazione

23 Il complesso proteico Arp2/3 dirige la ramificazione (BRANCHING) dei microfilamenti actinici, legandosi all estremità+

24 WAS Wiskott Aldrich syndrome (WAS) is a rare X-linked recessive disease characterized by eczema, thrombocytopenia (low platelet count), immune deficiency, and bloody diarrhea (secondary to the thrombocytopenia). The main function of WASp is to activate actin polymerization by binding to the Arp2/3 complex. In T-cells, WASp is important because it is known to be activated via T-cell receptor (TCR) signaling pathways to induce cortical actin cytoskeleton rearrangements that are responsible for forming the immunological synapse leading to IMMUNODEFICIENCY

25 Wiskott Aldrich syndrome (WAS)

26 La Cofilina agisce: a) come fattore depolimerizzante legandosi all estremità-e aumentando la velocità di dissociazione dei monomeri (ai quali resta legata impedendone il riassemblaggio) b) spezzando i filamenti di actina La profilina stimola lo scambio tra ADP e ATP dando luogo alla formazione di actina G/ATP. Il complesso profilinaactinag/atp si lega più efficacemente del singolo monomero all estremità + accelerando la polimerizzazione, ma in assenza di un filamento da accrescere il complesso blocca l inizio della polimerizzazone.

27 Fascio di filamenti paralleli Fascio contrattile Fimbrina Α-actinina

28 Filamenti a rete La filamina è una proteina dimerica a forma di V che lega i filamenti di actina in reti ortogonali LA FILAMINA FA ANCHE DA PONTE TRA INTEGRINE E CITOSCHELETRO DI ACTINA (vedi dopo)

29 Fasci di filamenti di actina formano la struttura centrale dei microvilli

30 Associazione del citoscheletro di actina alla membrana plasmatica: Adesioni focali integrine matrice extracellulare Talina fa da ponte Tra le integrine e il Citoscheletro di actina Nelle adesioni focali.

31 Associazione del citoscheletro di actina alla membrana plasmatica: Giunzioni aderenti-ecaderina (adesione cellula cellula) CATENINE CADERINE (giunzioni dellula/cellula)

32 La dinamica dei riarrangiamenti dei filamenti di Actina è controllata dalle piccole GTPasi della famiglia Rho: Rho, Rac, Cdc42

33 Disposizione dei microfilamenti all interno della cellula Citodieresi (dipendente da Rho) I microfilamenti (filamenti di actina) sono particolarmente numerosi al di sotto della membrana plasmatica (ACTINA CORTICALE)

34 Organizzazione di complessi diversi di actina in una cellula

35 MATRICE EXTRACELLULARE (ECM) E una rete organizzata di materiale extracellulare presente nelle vicinanze della membrana plasmatica MEMBRANA BASALE è uno strato sottile che si interpone tra l epitelio e la parte stromale di un organo. MATRICE INTERSTIZIALE costituisce uno spazio che fa da connessione e protezione delle strutture parenchimali, attraversato da vasi, nervi, che può Essere attraversato da diversi tipi cellulari. E prodotta principalmente da fibroblasti. E ricca in Collagene, Elastina, Fibronectina, laminine

36 COLLAGENE

37 PROTEOGLICANI

38 FIBRONECTINA RGD=arg gly asp è riconosciuto dalle integrine beta-1 Anche la proteina TAT del virus HIV Contiene un dominio RGD che può Portare ad una attivazione di integrin

39 MEMBRANA BASALE

40 MATRIGEL E una matrice cellulare prodotta da un sarcoma utilizzata in laboratorio come substrato di colture cellulari per mimare la matrice cellulare. Contiene laminina, collageni, proteine adesive e fattori di crescita

41 INTEGRINE Svolgono un ruolo chiave nell interazione tra l ambiente intracellulare e quello extracellulare. Sono conservati in tutti gli organismi eucarioti a partire dal lievito. 2 catene polipeptidiche (alfa e beta). Proteine transmembrana con un piccolo dominio intracellulare. Non hanno attività chinasica Legano cationi bivalenti (Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+,) importante per la loro attivazione.

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45 FUNZIONI DELLE INTEGRINE 1. Adesione cellula/cellula o cellula/ecm 2. Trasduzione del segnale al nucleo per indurre espressione genica. Cross talk tra Integrine e fattori di crescita

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47 Ruolo delle integrine nella aggregazione piastrinica: interazione di alfa2b/beta3 Con il motivo RGD del fibrinogeno

48 PATOLOGIE CAUSATE DA MUTAZIONI GENETICHE DELL ESPRESSIONE DI INTEGRINE Deficit di integrina beta-1 sono incompatibili con la vita (nel topo l embrione -/- muore al giorno 4.5 di gestazione per difetto di impianto Deficit di integrina beta2: LEUKOCYTE ADHESION DEFICIENCY (LAD) È una rara patologia autosomica recessiva. E caratterizzata da immunodeficienza che porta ad infezioni ricorrenti. I granulociti sono sono in grado di migrare nei siti di infezione Alterazione genetiche integrine di alfa6-beta4 ed altre molecole connesse nella adesione dei cheratinociti alla membrana basale: EPIDERMOLISI BOLLOSA

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50 INTERAZIONE INTEGRINE/MATRICE EXTRACELLULARE: LE ADESIONI FOCALI

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52 Control of actin organized cell structures by small Rho GTPases Induced by Integrin Activation Stress fibers are organized by Rho Lamellipodia are organized by Rac Filopodia are organized by Cdc42

53 EXTRACELLULAR MATRIX RIGIDITY INTEGRINS FOCAL ADHESIONS RhoA Rho Kinase Myosin II phosphorylation Increased acto-myosin contractility /Stress fibers

54 Vie di trasduzione del segnale indotte dalle GTPasi Rac e Cdc42 che portano Alla polimerizzazione dell actina

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57 Migrazione mesenchimale (lamellipodio) tipica del miofibroblasto Migrazione ameboide tipica del leucocita o varie cellule tumorali Questa è una visione classica basata su esperimenti condotti in 2D. Cellule possono adottare diversi tipi di migrazione a seconda del substrato più o meno rigido, della possibilità di degradare il substrato tramite proteasi

58 2012 by The Company of Biologists Ltd Migrazione mesenchimale/migrazione ameboide

59 Migrazione in 2D Falloidina (actina) Beta1 integrine (focal adhesions) Lamellipodio (Rac) Direzione della migrazione Coda Migrazione in 3D fibronectina Falloidina (actina) paxillina (focal adhesion) Proteasi degradano la matrice Attività di remodeling e forza per farsi strada attraverso i fasci di matrice lobopodio

60 Forma della cellula = funzione cellulare è totalmente diversa tra 2D e 3D 3D fibroblasti cresciuti su matrice extracellulare 2D fibroblasti cresciuti su plastica

61 Generazione di scaffold sintetici in materiale biocompatibile per favorire la crescita cellulare 3D. Scaffod di tessuto osseo, generazione di organi tridimensionali