Tecniche di microscopia ad alta risoluzione: vedere le molecole al microscopio, studiare il loro comportamento

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1 Tecniche di microscopia ad alta risoluzione: vedere le molecole al microscopio, studiare il loro comportamento GroEL:

2 Perché fare microscopia? A volte è meglio osservare gli individui che fare misure mediate di un singolo osservabile (approccio delle singole molecole). La statistica collega la distribuzione dei parametri dei singoli individui con i risultati dei metodi convenzionali che operano su grandi popolazioni.

3 Le tecniche microscopiche permettono di vedere i campioni o comunque di studiare loro caratteristiche localizzate nello spazio (composizione, interazioni) La scelta tra le varie tecniche a disposizione dello sperimentatore può essere fatta sulla base delle dimensioni degli oggetti da osservare, ma anche sulla loro composizione, sulle condizioni di osservazione e sul tipo di osservabile che interessa. nanoscopia ottica

4 Il microscopio elettronico: oltre la lunghezza d onda della luce visibile Perché utilizzare gli elettroni come radiazione: - si possono produrre facilmente (fotoemissione, emissione termoionica, elettroni secondari, emissione di campo) - hanno lunghezze d onda molto corte (e modulabili) - gli elettroni interagiscono con la materia e possono essere rivelati facilmente la lunghezza d onda degli elettroni è modulabile mediante il potenziale di accelerazione che serve a creare un fascio. Un potenziale di accelerazione più alto permette: lunghezze d onda minori penetrazione maggiore minore contrasto

5 Alcune date importanti per la microscopia elettronica

6 L interazione degli elettroni con la materia

7 Nella microscopia elettronica dei campioni biologici, uno dei problemi maggiori è il contrasto in TEM l immagine osservata sullo schermo o registrata sulla pellicola fotografica dipende dalla differenza nel numero di elettroni per unità di area superficiale e tempo che colpiscono il piano dell immagine: è il campione che modula l intensità elettronica sull immagine. Il numero di elettroni che colpisce lo schermo dipende da: Scattering elastico Scattering anelastico Diffrazione Assorbimento Rumore elettronico diverse cose possono succedere agli elettroni che attraversano un campione sottile. Possono interagire con i nuclei atomici o con gli elettroni che li circondano o possono attraversarli senza interagire con niente (come capita alla maggior parte degli elettroni per i campioni sottili). Per un dato materiale, la probabilità che un elettrone sia disperso (scattering) dipende dallo spessore, poiché più è spesso e maggiore è la probabilità di urti. Per diversi materiali, la probabilità dipende anche dal numero atomico del materiale, poiché materiali con numero atomico più alto avranno nuclei più grossi ed un numero maggiore di elettroni che li circondano. Un elettrone che incontra un nucleo viene deflesso con un grosso angolo, ma non perderà energia (scattering elastico): viene rimosso dal fascio elettronico grazie ad un diaframma. Questa è l origine del contrasto di ampiezza delle micrografie TEM, quello comunemente utilizzato.

8 L interazione degli elettroni con la materia Gli elettroni hanno lunghezza d onda variabile, dipendente dal modo in cui sono prodotti: il microscopio elettronico può utilizzare radiazioni di lunghezza d onda tale da poter osservare gli atomi. Sfortunatamente una radiazione elettronica a bassa lunghezza d onda ha alta energia e distrugge i campioni fragili (tutti i campioni biologici). La lunghezza d onda degli elettroni dipende dalla loro velocità, e quindi dal potenziale di accelerazione impiegato λ = se E è in elettronvolt. Ad esempio, E=100 kev, λ=0.037 Å. h p 1/ = h( 2meE) E Ma la risoluzione è, in realtà, fortemente limitata da fenomeni di diffrazione e di aberrazione (sferica) delle lenti (le lenti magnetiche sono molto meno efficienti delle lenti ottiche) e il limite corrente di risoluzione per un accelerazione di 100 kv è intorno ai 3 Å. 1/ 2

9 TEM: che informazioni sono presenti 1. TEM gives images of internal structure of a specimen sufficiently thin (~1000 Å) to allow transmission of electrons, typically kv. 2. Electrons diffract. Electron diffraction patterns give detailed crystallographic information: Crystal orientation Lattice parameters Specimen thickness 3. Chemical analysis is also possible with available analytical attachments for x-ray or electron spectroscopy.

10 TEM Come si presentano i microscopi elettronici SEM

11 Il microscopio elettronico: I tipi diversi di microscopi TEM SEM Il microscopio elettronico lavora sotto vuoto

12 Il Sistema di illuminazione in EM Sorgente ad emissione termoionica Electron source or gun Provides first coherent crossover of electron beam High voltage leading to filament- heated metal wire (cathode) Tungsten or LaB 6 (lanthanum hexaboride) Electrons would have no order Wehnelt Cap Electrode that shapes and controls emission Negative relative to filament Anode Positive respective to filament Wikipedia

13 I tipi di sorgente Tungsteno Un filo metallico LaB 6 Un cristallo Sorgente ad emissione di campo Punta di tungsteno Diversi tipi: Schotkky e fredda

14 Field Emission Source Allows for emission of electrons from fine tip via charge differential of tip and anodes. Brighter More coherent source Atomic diameter point source is future of FE guns

15 Griglie per TEM e film di supporto Comunemente di rame (anche Ni) Tarati in funzione dell area aperta (mesh) Più alto, meno area libera 400 per osservare molecole Molto delicati! Non devono essere piegati o la qualità dell immagine sarà peggiore. (questo è quello mostrato in classe)

16 Film di supporto Deve essere resistente e rigido, ma trasparente agli elettroni Plastica (formvar) Carbonio Holey carbon Quantifoil C-flat holey carbon Quantifoil (holey carbon migliorato)

17 To Glow or Not Glow Discharge (plasma) rende idrofiliche e cariche negativamente le griglie ricoperte da una pellicola. Migliore colorazione Migliore adesione del campione al substrato Minore aggregazione dei campioni particolati

18 Le lenti elettromagnetiche Electrons move in helical pattern Very influenced by magnetic fields Mass is small and require mean free path - high vacuum Bizzola Electron Microscopy 1999

19 Resolving Power (risoluzione spaziale) Microscopio ottico r = 172 nm (numero indicativo, dipende da diversi fattori ) Microscopio Elettronico r =.003 nm teorico r =.27 nm sperimentale nel JEOL 2100 Perché?

20 Fenomeni che riducono la risoluzione Difetti nelle lenti elettromagnetiche Aberrazione sferica Aberrazione cromatica Astigmatismo Coerenza del fascio Dipende dalla sorgente Wikipedia

21 Aberrazione sferica (anche per le lenti di vetro) Due to geometry of electromagnetic lenses such that rays passing through the periphery of the lens are refracted more that rays passing along the axis Circle of minimum confusion Corrected in EM with apertures to eliminate some of the peripheral rays but results in decrease aperture angle and therefore resolution (migliore contrasto, peggiore risoluzione) Bizzola Electron Microscopy 1999

22 Aberrazione cromatica (anche per le lenti di vetro) Distortion in lens in which there is a failure to focus different wavelength rays to converge on same point. In light it s the different color wavelengths In electrons shorter wavelength electrons are more energetic and have a longer focal length than longer wavelength electrons. Results in enlargement of focal point similar to Airy disc Minimized by ensuring stable voltage of source Good vacuum Thinner specimens Electrons transmitted through specimen will change their energy and wavelength

23 Astigmatismo (anche per le lenti di vetro) Radial blur results when a lens field is not symmetrical in strength but stronger in one plane and weaker in another Only part of image will be in focus at a given time Point would appear elliptical rather than spherical Corrected by Properly centered apertures Stigmators of condenser and objective lens Nature Protocols 3, (2008)

24 The Screen and CCD

25 I magnifici 3 Resolution, Magnification, and Contrast Resolution The ability to distinguish two closely placed entities that otherwise might appear as one Adobe.com

26 I magnifici 3 Resolution, Magnification, and Contrast Magnification The measure of the increase in diameter of a structure from it s original size

27 I magnifici 3 Resolution, Magnification, and Contrast Contrast The ability to distinguish differences in intensity values between bright and dark areas.

28 Contrasto Two types in electron microscopy Amplitude contrast (scattering contrast) Subtractive effect where various shades are evident by loss of electrons Main source of most electron microscope contrast (except cryo) Phase Contrast (interference contrast) Interference of diffracted waves cause intensity differences due to loss of energy and the corresponding shorter focal points Appear as bright ring or halo around the edge of an object Fresnel freh-nell fringe

29 Mass Thickness Typical thick sections are at 100 nm while high resolution is limited to 10 s of nm.

30 La colonna del microscopio deve essere sotto vuoto per evitare lo scattering degli elettroni per mantenere un alta tensione stabile per prolungare la vita della sorgente di elettroni (il filamento) per ridurre le contaminazioni il cammino libero medio (MFP) degli elettroni deve essere almeno lungo come la colonna dell EM P MFP 10 5 Pa 660 Å Pa 6.6 m 10-7 Pa 6600 m (1 Torr=1.32 mbar=1 mmhg=132 Pa; 1 atm=760 Torr= Pa)

31 Tre tipologie di contrasto in TEM: positive staining, negative staining e shadowing Tecniche differenti sfruttano diversi aspetti dell interazione degli elettroni con la materia, permettendo di avere informazioni (e contrasto) dipendente dallo spessore del campione, dalla sua conformazione superficiale, dalla sua composizione o struttura. La dispersione degli elettroni è alta se questi incontrano elementi atomici pesanti: la EM sfrutta coloranti opportuni per visualizzare elementi specifici

32 The Concept of Negative Stain Heavy metal atoms act as barrier to the e- beam Allows passage through specimen Stain penetration into hydrophilic specimen Dries faster than specimen Mostly hydrated regions replacing water Lipoproteins and proteins Stains form around hydrophobic regions including lipid Contrast dependent on stain thickness Resolution range Å

33 Negative Contrast Dense areas are bright also exclude stain Amplitude contrast Areas with no stain appear light because there is nothing for the electron beam to hit and the transmitted electrons shine through

34 Negative and Positive Staining A. 4% PTA Negative Stained B. 4% UA Positive Stained C. 4% UA Negative Stained Three types of staining visible Negative staining appearing white Negative staining appearing grey Positive staining appearing black Severe structural distortion

35 Factors Controlling Appearance Specimen ph Isoelectric Point Fixation Concentration Stain ph Charge Buffer and specimen interaction Osmolarity Can influence structure and volume of particle Interaction with the support mechanism Grid film Thickness of stain on film Charge and beam interactions

36 Negative Stains Negative stain should: Have minimal interaction with specimen (pos. stain) High density (must be at least twice the density of the specimen to be visualized) High melting point to avoid beam damage Small grain size Chemical ph stability

37 Diversi tipi di coloranti Uranyl Acetate+ (cation) Uranyl Oxalate+(cation) Uranyl Formate+(cation) PTA- (Phosphotungstic acid) (anion) Ammonium Molybdate Methylamine Tungstate (NanoW) Diversi per carica, densità, ph delle soluzioni, dimensione dei grani, contrasto risultante, stabilità nel fascio

38 Difetti del Negative Stain Fixation Tends to concentrate sample Cellular debris and other junk Positive staining Beam irradiation Lower kv=more damage potential Drying Leads to distortion of particle Flattening Will usually happen perpendicular to support mechanism Makes sample typically larger in diameter to known size

39 Il DNA osservato al microscopio elettronico Varie tecniche sono state sviluppate per l osservazione del DNA con il TEM: tecniche di contrasto (positive staining, shadowing) e di deposizione (su citocromo, con detergenti, su mica). Sotto, shadowing con Pt su DNA ricoperto di citocromo C (immagine di Kleinshmidt e collaboratori) Pt e -

40 In CRIOMICROSCOPIA ELETTRONICA il campione (un volume molto piccolo di soluzione acquosa) è congelato molto velocemente mediante immersione in etano liquido. L acqua vetrifica (non cristallizza) e blocca ogni movimento del campione. Durante tutta la misura il campione deve essere mantenuto a temperatura bassa (azoto liquido) ed osservato per poco tempo per non danneggiarlo. In genere il campione non è colorato con alcun metallo pesante, per cui il contrasto delle immagini è molto basso (le immagini sono brutte a vedersi). Spesso si sfrutta il contrasto di fase che si ottiene guardando le immagini sfocate. La risoluzione delle immagini è però molto alta e ricostruendo matematicamente l immagine a fuoco si ottengono micrografie con dettaglio molto fine. Registrando coppie di immagini a due diversi angoli di visione si ottiene una immagine tridimensionale del campione. Coppia di immagini di DNA al criomicroscopio elettronico (immagini di I. Dustin e collaboratori) Domanda: ma il campione si comporta come se fosse a Tamb o a temperature criogeniche?

41 La preparazione dei campioni per criomicroscopia elettronica

42 Colorazione negativa o Cryo-TEM? Negative Stain Light areas indicate density Cryo Contrast reversal of negative stain, dark areas indicate density- Phase Contrast Cryo Fixation Advantages Keeps sample in near native state Higher resolution 8-15 Å No artifacts from stain

43 Tipi di ghiaccio Ghiaccio vetroso o amorfo Il tipo desiderato in cryo-em Azoto liquido -195 C Capacità termica troppo bassa - Liedenfrost Effect etano liquido propano liquido Ghiaccio cubico L acqua in un reticolo cristallino oscura il fascio elettr. Si forma intorno a -140 C

44 The Grid in Cryo

45 The Mechanism Plunge Freezing Manual Blotting

46 Advanced Grid Freezing- Gatan CP3

47 Un cryo-tem di ultima generazione

48 Visualizing Ice on the Grid Search for suitable area on grid

49 Low Dose Ice is beam sensitive e - cause irradiated sample High res data can be lost in a matter of seconds Focus on area that is not photographed and correct for astigmatism Keep levels to around 5-20 e - /A 2 Can be a software automated process

50 Irradiation Damage [diapositiva modificata da materiale del laboratorio di Susan Hafenstein, Penn State Univ.]

51 Defocus Tradeoff Focus adjacent region of interest to true focus No inherent contrast from sample in ice No tone ring visible in FFT Reset to range desirable -2 to -5 µm [diapositiva modificata da materiale del laboratorio di Susan Hafenstein, Penn State Univ.]

52 Drawbacks of Cryo EM Low contrast Expensive Time intensive Labor intensive Beam irradiation Lower kv=more damage potential Low signal to noise ratio Size limitation Must be > 400kD for proper resolution Smallest published to date is 260kD Cryo negative stain as possible solution Phase plates [diapositiva modificata da materiale del laboratorio di Susan Hafenstein, Penn State Univ.]

53 The End Result [diapositiva modificata da materiale del laboratorio di Susan Hafenstein, Penn State Univ.]

54 Perché fare Cryo-TEM di singole particelle? CryoEM Density Fitting Sun et al.,2013 Elife

55 La procedura completa di lavoro del cryo-tem, dal campione di proteina, al modello 3D. Il numero delle mappe 3D di EM depositate in banca dati fino al 3 trimestre del Si noti l aumento significativo delle strutture a risoluzione <4Å.

56 Semliki Forest Virus nanometer resolution Vogel et al., 1986 Nature

57 The Importance of Resolution Improving resolution means more structural features are discernible Low resolutions (20-10 Å)= general shape, capsomere morphology High Resolution (9-6 Å) = individual subunit boundaries, secondary structure elements (α helices, β sheets) Near Atomic Resolution (<4.5 Å) = Pitch of helices, separation of β strands, some side chains of a.a. Able to determine features unable to be crystallized Can use both in conjunction in order to learn more

58 Sub-nanometer Resolution Hepatitis B Capsid, 9.1Å Resolution Conway et al., 1997 Science

59 Near-Atomic Resolution Epsilon 15 Bacteriophage, 4.5Å Resolution Jiang et al., 2008 Nature

60 Atomic Resolution Human Adenovirus 5, 3.6Å Resolution Liu et al., 2010 Science

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62 L utilità della risoluzione Zhou, Current Opinions in Structural Biology, 2008

63 Il progresso della Cryo-TEM di singola particella per la determinazione strutturale 11.5-Å struttura cryo-em structure del ribosoma 70S di Escherichia coli ottenuto con la tecnologia del Immagine da Gabashvili et al. Cell 100, (2000). 3.2-Å struttura cryo-em della grande subunità ribosomiale del mitocondrio di lievito ottenuta con tecnologia del Da Amunts et al. Science 343, (2014).

64 Perdita di risoluzione per il movimento del campione indotto dal fascio elettronico Accounting for electron beam induced sample motion improves resolution (right side) by decreasing blurring in particle images. Brilot et al. J. Struct. Biol. 177, (2012). Miglioramenti radicali mediante le telecamere di nuova generazione (direct electron detection cameras): rispetto alle CCD hanno bassissimo rumore, alto contrasto, alta risoluzione. Permettono di usare tempi di esposizione più brevi e quindi riducono gli effetti del movimento del campione.

65 Atomic resolution structures for icosaheral virus Nikolaus Grigorieff and Stephen C Harrison (2011) Current Opinion in Structural Biology FSC

66 Strutture a bassa simmetria ottenute ad alta risoluzione 1. GroEL (~840 kda, prototypical group I chaperonin) by Ludtke et al LHe, JEOL JEM3000SFF (300kV) ~ 4 Å from 20,401 particles with D7 (x14) and C7 (x7) symmetry using EMAN 2. Mm-cpn (~960 kda, an archaeal group II chaperonin) by Zhang et al LN2, JEOL JEM3200FSC (300kV) 4.3 Å from 29,926 with D8 (x16) symmetry using EMAN Ribosomi o subunità: codice della struttura in banca dati risoluzione anno 4V8T 8.1Å (2012) 4CSU 5.5Å (2014) 4UGO 3.6Å (2015) 5JPQ 7.3Å (2016)