PRODOTTI FITOSANITARI MICROBIOLOGICI E

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1 Pertot Ilaria PRODOTTI FITOSANITARI MICROBIOLOGICI E A BASE NATURALE

2 Biopesticida Non è definito chiaramente in UE, ma il termine è usato In USA è definito dall EPA come: naturally occurring substances that control pests (biochemical pesticides), microorganisms that control pests (microbial pesticides), and pesticidal substances produced by plants containing added genetic material (plantincorporated protectants) (=OGM)

3 Prodotto fitosanitario In UE è indicato come Plant protection product In Italia è usato anche il termine agrofarmaco Un prodotto fitosanitario è un pesticida che mira a proteggere le colture o piante utili, usato in agricoltura, foreste o nel giardinaggio È composto da uno o più sostanze attive

4 Di sintesi chimica/ di natura biologica Nel processo di registrazione l UE non fa distinzione sulla base della natura del principio attivo (stesso iter) Nell utilizzo: esistono restrizioni per la produzione biologica che ammette solo prodotti fitosanitari di natura biologica (tranne alcune eccezioni) ed esistono preferenze come indicato dalla direttiva sull uso sostenibile dei pesticidi

5 Normativa EU sui pesticidi REGOLAMENTO (CE) N. 1107/2009 relativo all immissione sul mercato dei prodotti fitosanitari e che abroga le direttive del Consiglio 79/117/CEE e 91/414/CEE REGOLAMENTO (CE) N. 396/2005 concernente i livelli massimi di residui di antiparassitari nei o sui prodotti alimentari e mangimi di origine vegetale e animale e che modifica la direttiva 91/414/CEE

6 DB sulle sostanze attive e MRLs t=homepage&language=en

7 Approvazione delle sostanze attive Un prodotto fitosanitario in genere contiene più di un componente. Il componente attivo contro patogeni/parassiti è chiamato sostanza attiva La commissione valuta ogni sostanza attiva prima che venga immessa sul mercato Le sostanze devono essere sicure per la salute delle persone, includendo i loro residui nel cibo, degli animali e dell ambiente

8 Distinzione tra Sostanze chimiche (inclusi gli estratti vegetali, i minerali, i sali) Microrganismi (virus, batteri, funghi) Ma non distinzione tra origine: Naturale Sintesi chimica

9 Approvazione dei prodotti fitosanitari L UE è divisa in 3 zone (+ le serre), nord, centro e sud; la valutazione pe runa zona è fatta da un solo stato membro e poi estesa Si sceglie un zonal Rapporteur Member State (zrms) e questo fa la valutazione (gli altri stati possono commentare) Approvazione o meno (può essere rifiutata dagli altri stati della stessa zona) Procedura di mutuo riconoscimento Richiede circa 1, 5 anni

10 Zone per registrazione

11 EPPO zone climatiche

12 Legislazione sui prodotti fitosanitari Regulation EC 1107/2009 registrazione Regulation EU 540/2011 sostanze approvate [Updated 01/09/2014] Regulation EU 546/2011 principi per la valutazione di un prodotto fitosanitario Regulation EU 547/ etichettatura Regulation EU 283/2013 dati richiesti per le sostanze attive Regulation EU 284/2013 dati richiesti per i prodotti fitosanitari

13 TIPOLOGIE E CARATTERISTICHE DELLE ALTERNATIVE AI PRODOTTI FITOSANITARI DI SINTESI CONTRO I PATOGENI. ESEMPI

14 Macro categorie Microrganismi Estratti vegetali (botanicals) Sostanze naturali

15 Biofungicidi microbiologici Ampelomyces quisqualis Aureobasidium pullulans (lievito) Bacillus spp. (batterio) Candida oleophila Gliocladium catenulatum Coniothyrium minitans Phlebiopsis gigantea (ceppi diversi) Pseudomonas spp. Pseudozyma flocculosa Trichoderma spp. (fungo filamentoso) Verticillium albo-atrum (precedentemente V. dahliae)

16 Bioinsetticidi microbiologici Beauveria bassiana Bacillus thuringiensis Lecanicillium muscarium Metarhizium anisopliae var. anisopliae Paecilomyces fumosoroseus Granulovirus

17 Meccanismi d azione dei fungicidi microbiologici Diretto (produzione di enzimi e antibiotici) Induzione di resistenza (attivazione di ISR o SAR nella pianta (tipici nei trattamenti radicali, effetto spesso temporaneo e mai 100% di controllo) Iperparassitismo (colonizzano e si nutrono del patogeno) Competizione per spazio e nutrienti

18 Meccanismi d azione dei fungicidi microbiologici Generalmente coesiste più di un meccanismo Importante conoscere il meccanismo del biofungicida e la dinamica delle infezioni del patogeno Azione diretta: concetto simile a quello dei fungicidi di sintesi chimica Induzione di resistenza: 40-50% efficacia Iperparassitismo: mai eliminazione del patogeno Competizione: riduzione inoculo e prevenzione

19 Azione diretta: antibiosi Fitopatogeno Coltura duale Antagonista Alo = tossine Test classico: Il filtrato colturale dell organismo inibisce la crescita del fitopatogeno

20 Induzione di resistenza Bacillus e altri microrganismi possono colonizzare stabilmente la radice (rizosfera) e grazie alla produzione di elicitori attivare l ISR (priming per una risposta veloce la patogeno)

21 Chi può indurre resistenza Laminarina (Vacciplant) Bacillus spp. (Serenade, Amylo-x, ecc.) Trichoderma spp. (Trianum, Vintec, ecc.) Pseudomonas spp. (Cerall, etc.) Estratto di salice (candidato per sostanza di base) Reynoutria sachalinensis (Regalia, Milsana, ecc.) ISR è indotta sia da microrganismi, che parti di essi che alcune molecole naturali, non ha costi metabolici (SAR) ISR o SAR possono solo ridurre la malattia (fino a 40-50%), in genere la pianta è già attivata in natura

22 Laminarina Un glucano (polisaccaride del glucosio) che si trova nelle alghe brune (Laminaria digitata) Agisce sulla pianta come segnale d allarme e la pianta reagisce attivando la resistenza sistemica Efficacia limitata (40-50%), inattivo se la pianta è giù indotta e poco efficace se l epidemia è in fase esponenziale

23 Iperparassitismo Caso tipico di Ampelomyces quisqualis (oidio su varie colture) o Coniothyrium minitans (Sclerotinia sclerotiorum su lattuga, leguminose, ecc.) L antagonista cresce sul o nel patogeno, invade i tessuti, si nutre di esso e lo uccide (lentamente), ma mai completamente Riduzione delle infezioni Riduzione dell inoculo

24 A. quisqualis che parassitizza oidio Ife e micelio di oidio e crescita di A. quisqualis all interno

25 Sclerotinia sclerotiorum Sclerozio di S. sclerotiorum parassitizato da C. minitans

26 Competizione di spazio e nutrienti Si basa sul fatto che ferite e zone d ingresso del patogeno sono colonizzate dal microorganismo antagonista, che può anche produrre enzimi litici e tossine nel punto di colonizzazione Sul consumo di sostanze necessarie alla germinazione/crescita del patogeno (esempio B. cinerea ha bisogno di zucchero per germinare) Sull occupazione di spazio/nutrienti che sarebbero usati dal patogeno (riduzione inoculo)

27 Penicillium (24 h) Penicillium + antagonista (24 h) Penicillium + antagonista (48 h) Acqua Succo mela a 0.5% Succo mela a 5%

28 Aureobasidium pullulans ceppi DSM e DSM Botector COMPOSIZIONE: 100 grammi di prodotto contengono: A. pullulans 5x x10 12 CFU Coformulanti q.b. a g 100 FORMULAZIONE: Polvere Bagnabile Tempo di carenza: nessuno Conservazione: 18 mesi a 8 C e 10 mesi a 25 C

29 Aureobasidium pullulans Botector VITE DA VINO e UVA DA TAVOLA 0,4 Kg/ha Epoca d impiego: BBCH (80% fioritura fino a raccolta) Non miscibile con fungicidi, attendere qualche giorno dall ultimo trattamento. Temperatura dell acqua non superiore a 25 C

30 Aureobasidium pullulans Fungo: Ascomycota, famiglia Dothioraceae, genere Aureobasidium (27 specie) Noto anche come black yeast, ha un alto grado di poliformismo Ubiquitario, saprofita, polifago (terreno, acque di fiume, materiale vegetale, aria) Battericida contro Erwina amylovora Fungicida contro Penicillium expansum (pomacee), Botrytis cinerea (vite) Range termico simile: optimum a 29 C (DSM 14940) e a 27 C (DSM 14941), non si moltiplicano a T > 33 C

31 Meccanismo d azione Competizione per il nutrimento e lo spazio, Produzione di cutinasi che determina l aumento della divisione cellulare dell epidermide della pianta con produzione di fitoalessine e abbassamento del ph negli ambienti colonizzati (effetto batteriostatico) Alcuni ceppi si usano per produrre pullulano (additivo alimentare ottenuto dall amido) e per produrre pellicole edibili

32 Caratteristiche Fungo molto adattabile (plastico) La morfologia della colonia varia con fonte di carbonio, età, temperatura, luce e substrato Può crescere come fungo filamentoso o come cellule levuliformi I cambiamenti: modificazioni epigenetiche Si adatta a condizioni ambientali stressanti come ipersalinità, acidità, freddo, mancanza di nutrienti C è una specie patogena umana nel genere Aureobasidium (A. melanogenum)

33 Aureobasidium pullulans

34 Aureobasidium pullulans Meccanismo contro Botrytis cinerea in microferita su buccia

35 Vantaggi nell uso Non lascia residui Non interferisce con la fermentazione Può essere applicato vicino alla raccolta Meccanismo complesso: può essere inserito nelle strategie anti-resistenza Valido strumento nell agricoltura biologica e nell IPM Vantaggi per l operatore (non è tossico) Non dà fitotossicità

36 Limiti nell uso Non è efficace se le infezioni sono già avvenute e se la pressione della malattia è alta L efficacia è minore degli antibotritici di sintesi Viene dilavato dalle piogge e non resiste ad alte temperature Va fatta attenzione ai trattamenti precedenti e seguenti (compatibilità) Maggiore efficacia all invaiatura Effetto più debole rispetto al Bacillus sul marciume acido in pre-raccolta

37 Limiti nell uso Non è miscibile con altri fungicidi Non si può conservare la sospensione per lungo tempo La botte va risciacquata con cura prima dell uso Il prodotto va conservato preferibilmente al freddo ed ha scadenza Se non usato tutto il prodotto va richiuso con attenzione possibilmente ermeticamente (teme l umidità)

38 Bacillus spp. Fungicida e battericida vite Bacillus subtilis str. QST 713 (Serenade) Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum D747 (AMYLO-X) Altre colture Bacillus pumilus QST 2808 In registrazione: Bacillus amyloliquefaciens MBI 600 Bacillus amyloliquefaciens strain FZB24

39 B. subtilis, B. amyloliquefaciens Batteri gram positivi Formano spore Conservazione prolungata e miscibilità Meccanismo d azione: diretto- produzione di metaboliti principalmente lipopeptidi; induzione di resistenza (effetto limitato su vite) Botrytis cinerea e marciume acido

40 B. subtilis Serenade Max COMPOSIZIONE: 100 grammi di prodotto contengono: B. subtilis QST ,67 % (5,13x10 10 CFU/g) Coformulanti q.b. a g 100 FORMULAZIONE: Polvere Bagnabile Tempo di carenza: 3 giorni Conservazione: in luogo fresco e asciutto il prodotto è stabile per 2 anni

41 B. subtilis - Serenade Max VITE DA VINO e UVA DA TAVOLA 2,5-4 Kg/ha Epoca d impiego: intervenire a inizio o in previsione di infezione o secondo le indicazioni locali, dallo stadio di 80 % di fiori aperti fino a inizio maturazione (inizio comparsa tipico colore varietale) Max 5 trattamenti Completa miscibilità

42 B. amyloliquefaciens - Amylo-X COMPOSIZIONE: 100 grammi di prodotto contengono: B. amyloliquefaciens g 25 (5x10 10 CFU/g) - Coformulanti q.b. a g 100 FORMULAZIONE: Granuli idrodispersibili (WG) Tempo di carenza: 3 giorni Conservazione: in luogo fresco e asciutto il prodotto è stabile per 2 anni

43 B. amyloliquefaciens Amylo-X VITE DA VINO e UVA DA TAVOLA 1,5-2,5 Kg/ha Epoca d impiego: intervenire a inizio o in previsione di infezione o secondo le indicazioni locali, dallo stadio di 80 % di fiori aperti fino a inizio maturazione (inizio comparsa tipico colore varietale) Completa miscibilità

44 B. subtilis, B. amyloliquefaciens Batterio bastoncellare, Gram + Può formare un corpo di protezione duro (endospora di protezione) che tollera condizioni estreme Non sono patogeni umani, possono però degradare o contaminare gli alimenti (raramente causa intossicazione alimentare) Produce l'enzima proteolitico subtilisina, usato per fermentare cibi

45 Meccanismo d azione Diretto: mediante produzione di diversi metaboliti antibiotici (più di venti) tra cui i lipopeptidi (surfactina, iturina, fengicina) e altri antibiotici (subtilina, bacillosina, ecc.) Induzione di resistenza (soprattutto nei trattamenti radicali (elicitore surfactina) Competizione per spazio e nutrienti (in misura minore)

46 Vantaggi nell uso Non lascia residui Non interferisce con la fermentazione Può essere applicato vicino alla raccolta Meccanismo complesso: può essere inserito nelle strategie antiresistenza Valido strumento nell agricoltura biologica e nell IPM Vantaggi per l operatore (non è tossico) Può essere conservato a T ambiente a lungo

47 Limiti nell uso Non è efficace se le infezioni sono già avvenute e se la pressione della malattia è alta Azione solo preventiva L efficacia è minore degli antibotritici di sintesi Viene dilavato dalle piogge Maggiore efficacia in pre-raccolta e se anche marciume acido

48 B. subtilis, B. amyloliquefaciens Cellule vitali rosse, endospore verdi

49 Trichoderma spp. Fungicida contro le malattie del legno T. gamsii (formerly T. viride) strain ICC080 T. asperellum (formerly T. harzianum) strains ICC012, T25 and TV1 (Remedier) T. atroviride strain I-1237 (Esquive) T. atroviride strain SC1 (Vintec, brevetto FEM) T. asperellum (strain T34) T. atroviride (formerly T. harzianum) strains IMI and T11 T. harzianum strains T-22 and ITEM 908 T. polysporum strain IMI

50 T. asperellum + T. gamsii Remedier COMPOSIZIONE: Trichoderma asperellum (ceppo ICC 012) 2 g e Trichoderma gamsii (ceppo ICC 080) 2 g, (3 x 10 7 CFU/g) FORMULAZIONE: Polvere Bagnabile Tempo di carenza: 3 giorni Conservazione: 15 mesi a temperatura < 25 C

51 T. asperellum + T. gamsii Remedier VITE DA VINO e UVA DA TAVOLA 1 Kg/ha Epoca d impiego: Dopo la potatura, invernale o primaverile. Nei vigneti a forte rischio di malattia può essere eseguito un secondo trattamento entro la fase di germogliamento Preparare una sospensione 100 g/l di Remedier ore prima del trattamento Non miscibile, non compatibile con ditiocarbammati, imazalil, procloraz

52 Trichoderma spp. Trichoderma spp. sono I funghi più facilmente isolabili dal suolo e sono presenti in genere in legno e materiale vegetale in decomposizione ma sono anche presenti sulle radici di molte piante Opportunistici, simbionti non virulenti, e sono spesso parassiti o antagonisti di molti patogeni vegetali Trichoderma spp. sono tra le specie più studiate e sviluppate commercialmente come biofungicidi, biofertilizzanti I ammendanti del suolo Da Vinale et al. 2008

53 Uso di Trichoderma spp. in agricoltura A seconda del ceppo: Colonizzazione della rizosfera da parte del Trichoderma ( rhizosphere competence ) che permette una relazione stabile con la pianta funzionando sia da agente di biocontrollo che biofertilizzante (produce ad esempio acidi organici che solubilizzano il fosfato) Trattamento del suolo per riduzione dell inoculo di patogeni presenti Trattamento delle ferite (di potatura per prevenire l ingresso di patogeni) Trattamento aereo per ridurre i substrati colonizzabili dal patogeno (es. prechiusura grappolo contro B. cinerea)

54 1. Trichoderma strains detect other fungi and grow tropically towards them; remote sensing is at least partially due to the sequential expression of cell-wall-degrading enzymes 2. attach to the host and can coil around it and form appressoria on the host surface 3. fungitoxic cell-wall-degrading enzymes, and peptaibol antibiotics Harman et al. 2004

55

56 Micoparasitismo Trichoderma secerne CWDEs (cell wall degrading enzymes) che idrolizzano la parete cellulare di altri funghi patogeni, in seguito si rilasciano oligomeri dalla parete del patogeno Trichoderma secerne questi enzimi a livello costitutivo, ma non appena gli oligomeri frutto della lisi giungono indietro, allora Trichoderma attiva una maggior produzione di questi enzimi (meccanismo con cui percepisce la presenza del patogeno e rilascia enzimi solo se necessari)

57 The pre-contact events of the mycoparasitic interaction Trichoderma host fungus. Phase 1: the mycoparasite produces high molecular weight compounds that reach the host. Phase 2: low molecular weight-degradation products that are released from the host cell walls reach the mycoparasite and activate the mycoparasitic gene expression cascade Vinale et al. 2008

58 Metaboliti attivi Produce una grande varietà di enzimi litici (proteasi, cellulasi, chitinasi, ecc.) Alcuni prodotti industrialmente e purificati per fini commerciali Questi enzimi hanno in genere uno spettro d azione abbastanza ampio contro diversi patogeni (i.e. specie di Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Ustilago, Venturia e Colletotrichum, ma anche Oomycetes come Pythium e Phytophthora che non possiedono chitina nella parete) Trichoderma sviluppato contro molti patogeni

59 Antibiotici Composti volatili come 6-pentyl-a-pyrone (6PP) e derivati dell isocyanide Composti solubili in acqua come heptelidic acid o koningic acid Peptaiboli, che sono oligopepetidi lineari di aminoacidi ricchi in acido a-aminoisobutirrico, N- acetilati al N-terminus e contenenti un aminoalcool (Pheol o Trpol) al C-terminus

60 Trichoderma e protezione delle ferite contro le malattie del legno Remedier (registrato in Italia, due ceppi del suolo, bassa capacità di colonizzazione del legno) Esquive (registrato in Francia, ceppo buon colonizzatore, ma solo Eutypa) Vintec (in commercio in tutta EU dal : Pal, Pch, Eutypa) Evitare prodotti non registrati (non c è garanzia della vitalità, della concentrazione, della formulazione, non si sa se il ceppo è attivo infatti non tutti i ceppi sono efficaci)

61 Hp: meccanismi d azione Basso peso molecolare, non polari e volatili (es. 6PP) possono muoversi a lunga distanza sia nella soluzione circolante che nelle sacche d aria, sono prodotti in grossa quantità (basso costo metabolico perchè molecole semplici) L effetto a distanza limitata è dato dagli antibiotici polari e i peptaiboli che agiscono quando il Trichoderma è prossimo all organismo da attaccare Enzimi litici prodotti solo quando serve ed in piccole quantità nel punto di attacco

62 Esca e Petri disease: patogeni associati Esca, Black measles: Phaeomoniella chlamydospora (Pch), Phaeoacremonium aleophilum (Pal) disturbo vasoclare Fomitiporia mediterranea, F. australiensis, si possono trovare nel legno morto Petri disease, Young vine decline: Phaeomoniella chlamydospora

63 Vie per l infezione Pal and Pch producono conidi da inizio stagione fino a tarda estate Conidi trasportati dall aria (vento, pioggia) Ferite, in particolare le ferite di potatura possono essere colonizzate da Pal e Pch Pal e Pch possono crescere nel tessuto vascolare Importante proteggere le piante dopo le potature e quando la presenza dei conidi di Pal e Pch è elevata

64 Number of spores Spread of spores PRUNING Pal T. ATROVIRIDE SC1 month PRUNING Pch T. ATROVIRIDE SC1 month Pal spore pressure in Puglia (2007) and Pch spore pressure in Umbria (2010), modified from Frisullo S. et al. (2010)

65 Modo di applicazione Applicazione: trattamento con T. atroviride sulle ferite Applicare sulle ferite quando il rischio infezione è elevato prima che la malattia compaia Treated Untreated

66 Protezione continua in vigneto

67 Vantaggi nell uso L unico prodotto efficace contro le malattie del legno della vite Una volta colonizzato le ferite non si dilava e non viene ucciso Facile applicazione (dopo potatura, con T >10-12 C evitando periodi di secco e T <0 C) Non lascia residui Valido strumento nell agricoltura biologica e nell IPM Vantaggi per l operatore (non è tossico)

68 Limiti nell uso Non è efficace se la malattia è presente (non cura) Va applicato a partire da vivaio o dal primo anno dell impianto Costo relativamente alto (circa 200 /ha) L atomizzatore va lavato bene da residui di fungicidi prima dell applicazione Sarebbe utile possedere l attrezzatura per il trattamento a tunnel con recupero (risparmio di prodotto)

69 Estratti vegetali Botanical active substance (estratti vegetali di origine botanica) Gruppo estremamente eterogeneo di sostanze (da polvere di piante ad estratti integrali o che hanno subito trasformazioni) Gli estratti possono essere raffinati (singolo principio attivo) o essere sotto forma di miscele complesse di componenti di cui solo alcuni attivi

70 Definizioni Sostanza attiva di origine botanica: una o più componenti derivanti da pianta ottenuti sottoponendo la pianta o parti di essa a processi come spremitura, macinazione, pressatura, distillazione e/o estrazione. Il processo può includere anche concentrazione, purificazione e/o combinazione di componenti, ma non modifiche o alterazioni attraverso processi chimici o microbiologici Grado tecnico: il risultato ottenuto con uno specifico metodo e da una specifica pianta ed è la sostanza attiva

71 Come si ottengono Infusione o macerazione in acqua (calda, fredda) Spremitura Estrazione in solvente Distillazione in corrente di vapore (il valore introno ai 110 C porta con se l estratto), es. D- limonene Distillazione in alcool (Soxhlet: macerazione in alcool che poi viene allontanato)

72 Estratti vegetali Si ottengono per estrazione (separazione della frazione attiva dalla parte inattiva mediante solvente) Il solvente solubilizza composti con la polarità simile La qualità (efficacia) dipende dal materiale vegetale di origine, dal tipo di solvente e dal metodo di estrazione

73 D-limonene

74 Registrazione Gruppo 1- sostanze da piante già note di cui non è mai stato segnalato l effetto avverso su uomo, animali ed ambiente Gruppo 2 - sostanze che provengono da piante di cui si conoscono possibili effetti avversi (es. tujone in estratti di salvia) Gruppo 3 - sostanze da piante di cui non si sa nulla

75 Che cosa ne influenza il contenuto Coltivazione Specie spontanee o coltivate Habitat naturale o ambiente di crescita Pratiche colturali Raccolta Momento della raccolta Parte della pianta usata Stadio al momento della raccolta Metodo di raccolta e tempo prima della conservazione Metodo di conservazione prima del processamento (temperatura, umidità, luce, ecc.) e presenza di microrganismi Preparazione prima dell estrazione Processo di estrazione Processo post-estrazione

76 Esempi registrati (nessuno su vite) D-limonene Timolo Eugenolo Geraniolo Estratto di tea tree (M. alternifolia, M. linariifolia e M. dissitiflora) - 4 principali costituenti terpinen-4-ol (30-48%), γ-terpinene (10-28%) α-terpinene (5-13%), 1,8-cineol (tracce-15%)

77 Vantaggi dell uso di fungicidi botanici Rapida degradazione Nessun bioaccumulo Nessuno residuo o residuo irrilevante Rinnovabili Molti hanno bassa tossicità per uomo e per ambiente (ma ci sono eccezioni) Utilizzabili in agricoltura biologica Riduzione fungicidi di sintesi chimica (IPM)

78 Estratti botanici: punti di debolezza Metodi di estrazione non standardizzati, composizione dell estratto non stabile Rapida degradazione (UV, termica, microbiologica) o volatilizzazione Per alcuni, elevata dilavabilità Alti dosaggi ed relativi costi elevati Tossicità per organismi acquatici Efficacia incostante o inferiore a standard

79 FOSFONATI: CARATTERISTICHE E MECCANISMI D AZIONE

80 I fosfonati (fosfiti) Non sono molecole naturali Hanno degli aspetti interessanti per l uso su vite Hanno delle criticità nell uso (residuo) Vanno usati in strategie

81 Acido fosforoso P(OH) 3 Ossiacido del fosforo, stato di ossidazione +3 In acqua è in equilibrio con il suo tautomero (acido fosfonico HP(O)(OH) 2 ) acido fosfonico HP(O)(OH) 2 acido fosforoso P(OH) 3 Equilibrio maggiormente spostato verso l'acido fosfonico HP(O)(OH) 2 piuttosto che l'acido fosforoso Spesso indicati (non correttamente) come "acido fosforoso«e formula bruta H 3 PO 3

82 Fosfiti e/o fosfonati? Sali/Esteri del "vero" acido fosforoso vengono detti univocamente fosfiti Sali/Esteri dell'acido fosfonico vengono detti fosfonati Fosfonato di potassio: miscela di reazione di acido fosfonico e idrossido di potassio (ph tra 5.9 e 6.4) che contiene una miscela di idrogeno fosfonato di potassio e fosfonato di dipotassio

83 Fosfiti e fosfonati: fertilizzanti o prodotti fitosanitari La miscela tautomerica (ac. fosfonico) è troppo acida per essere applicata alle piante Neutralizzata con una base (di solito l idrossido di potassio, ma potrebbe essere anche di sodio): fosfonato Fosfonati: inclusi anche in alcuni fertilizzanti Fosfonati (fungicidi e fertilizzanti) non vanno confusi con i fosfati (es. fosfato d ammonio) che hanno solo azione fertilizzante

84 Fosfiti e fosfonati: fertilizzanti o prodotti fitosanitari Negli anni in USA e Germania testati come fertilizzanti, ma non risultati sufficientemente efficaci (come i fosfati) L acido fosfonico in reazione con etanolo e ioni alluminio forma l etilfosfonato di alluminio (fosetyl-al) L attività fungicida dei fosfonati è stata scoperta in Francia negli anni 70 da Rhone-Poulenc Agrochemical (Aliette) A partire dagli anni 90: fertilizzanti fosfonati usati impropriamente come fungicidi da molti agricoltori

85 Fosfonati come fertilizzanti I fosfonati non sono fertilizzanti Trattamento con potassio fosfato come sorgente di fosforo (sinistra) e con fosfonato di potassio come sorgente di fosforo (destra) Fonte: Penn State College of Agricultural Sciences

86 Fosfonati come fungicidi Fonte: Penn State College of Agricultural Sciences I fosfonati sono fungicidi Trattamento con potassio fosfonato (destra) riduce il danni da Pythium rispetto al non trattato (sinistra)

87 Fosfiti e fosfonati: concimi o prodotti fitosanitari Negli anni 90: nei fertilizzanti sono stati inseriti fosfonati ed usati come impropriamente come fungicidi Problemi di residui, difficoltà di determinare la concentrazione nel fosfito nel fertilizzante (non dichiarato) Normativa EU: se c è azione fungicida il prodotto deve essere registrato come prodotto fitosanitario (Reg 1107/2009) Fosfonato di potassio ora è registrato (ottobre 2013)

88 Profilo tossicologico Mammiferi DL 50 acuta orale (mg kg -1 ) > 5000 Mammiferi DL 50 dermale (mg kg -1 ) > 4000 Mammiferi CL 50 inalazione (mg l -1 ) > 5,05 ADI - Acceptable Daily Intake (mg kg -1 giorno -1 ) 3,90 AOEL - Acceptable Operator Exposure Level - Systemic (mg kg -1 giorno -1 ) 5,0 Termine di paragone; cloruro di sodio - Mammiferi DL50 acuta orale (mg kg -1 )= 3000

89 Cancerogeno Mutageno Endocrine disrupter Effetti sulla riproduzione Inibitori della Cholinesterase Neurotossico Irritante per il tratto respiratorio Irritante per la pelle Irritante per gli occhi Profilo tossicologico No No No No data No No data No data No Si

90 Profilo ecotossicologico Mammiferi DL 50 acuta orale (mg kg -1 ) > 5000 Uccelli DL 50 acuta (mg kg -1 ) > 2250 Pesci DL 50 acuta 96 ore (mg L -1 ) > 118 Invertebrati acquatici CE 50 acuta 48 ore (mg L -1 ) > 118 Api DL 50 acuta 48 ore (μg ape -1 ) >145 Lombrichi CL 50 acuta 14 giorni (mg kg -1 ) > 1000 Microrganismi del suolo: Leggero effetto transitorio sulla mineralizzazione del carbonio e dell azoto

91 Meccanismo d azione Fosfonati: assorbiti dalla pianta ed incorporati nelle cellule come ioni fosfito (H 2 PO 3- ); il fatto che manca un atomo di ossigeno fa si che il metabolismo nelle piante sia diverso dai quello dei fosfati Gli ioni fosfito possono essere trasportati nelle piante, ma non sono coinvolti nel metabolismo del fosforo (produzione di ATP, fotosintesi e respirazione)

92 Trasporto nella pianta I fosfonati sono assorbiti dalle cellule, in modo attivo I fosfonati hanno rapida mobilità simplastica (il sistema delle cellule unite dai plasmodesmi) e apoplastica (pareti e spazio extracellulare) in entrambe le direzioni Il meccanismo di trasporto non è del tutto chiaro, dipende dalla pianta e dal suo metabolismo Trasporto nel floema permette di curare malattie al colletto o alle radici (Pythium e Phytophthora) Trasporto condiziona probabilmente anche il residuo

93 Trasporto nella pianta Movimento del potassio marcato radioattivamente in piante di peperone trattate (1) con fosfonato di potassio radioattivo Fonte: Anil Kumar et al. 2009

94 Trasporto nella pianta Traslocazione anche a livello radicale Solo una piccola parte viene rilasciata nel suolo Eliminazione del residuo principalmente mediante caduta foglie, asporto prodotti, rilascio da radici

95 Destino nell ambiente Chimicamente sono molto stabili La pianta li elimina attraverso radici, caduta foglie, ecc., da cui passano al suolo Possono essere convertiti dai batteri del suolo in fosfato e poi metabolizzati dalla pianta (alcune settimane) Gli ioni fosfito hanno azione diretta contro alcuni patogeni, soprattutto oomiceti, che non si ha invece con lo ione fosfato

96 Azione diretta o indiretta? Fosfonati incorporati al substrato di crescita hanno effetti limitati sulla crescita del micelio di Pythium aphanidermatum se c è sufficiente fosfato nel substrato Se il fosfato viene ridotto (causa della mancata inibizione) allora si vede un azione di inibizione diretta Sia fosfito che fosfato competono per gli stessi trasportatori nelle membrane cellulari

97 Fosfonato e fosfato: patogeno Pythium aphanidermatum che cresce su un terreno con fosfonato di potassio (sinistra) o fosfato di potassio (destra) Fonte: Penn State College of Agricultural Sciences

98 Assorbimento del fosfonato Il fosfato compete con il fosfonato nell assorbimento (ci deve essere poco fosfato per permettere l assorbimento del fosfonato) L assorbimento dipende dal ph P. cryptogea ha un massimo a ph 5.0 to 5.5

99 Effetto diretto sul patogeno P. cinnamomi dopo 4 giorni su un terreno senza (sinistra) e con 40 µg/ml di fosfonato (destra) Fonte: King et al., Mol Genet Genomics, 2010

100 P. cinnamomi: sporangio normale e sporangio abortito in seguito a trattamento con 50 mg/l di fosfonato

101 A livello molecolare nel patogeno Nel caso studio di P. cinnamomi il fosfonato induce un cambiamento nell espressione di 43 geni la maggior parte di cui codificava per proteine coinvolte nella sintesi della parete cellulare o nelle funzioni del citoscheletro Gluconeogenesi, trasporto, biosintesi, trasduzione del segnale, metabolismo dell azoto, ecc. Questi risultati associati alle osservazioni al microscopio confermerebbero che il fosfonato inibisce le funzioni di sintesi del citoscheletro e della parete

102 Meccanismo che determina la tossicità per il patogeno non è chiaro Fosfonato determina un accumulo di pirofosfato e polifosfati senza però aumentare il fosforo di zuccheri e nucleotidi In Phytophthora il fosfonato produce nelle cellule isoipofosfonato che comunemente non si trova Probabilmente il metabolismo del pirofosfato è il primo target dell inibizione

103 Risposte di difesa della pianta La presenza del patogeno attiva una complessa rete di segnali nelle piante resistenti (espressione di risposte di difesa) Una delle prima risposte è lo stress (burst) ossidativo (rapida produzione nel punto di contatto di specie reattive dell ossigeno) Ipersensibilità, accumulo di fitoalessine e composti fenolici e barriere strutturali e biochimiche

104 Risposte di difesa della pianta La reazione è attivata in modo diretto dal patogeno o da parti di esso (frammenti di parete cellulare, peptidi) Alcuni composti (naturali o sintetici) possono stimolare risposte simili a quelle osservate nell interazione tra pianta resistente e patogeno (acido salicilico, BTH, ecc.) La reazione può essere anche attivata in modo indiretto (rilascio di metaboliti dal patogeno) come si pensa ad esempio nel caso dei fosfonati Ipotesi: il fosfonato induce risposte di difesa che normalmente si hanno nelle piante resistenti anche nelle piante suscettibili

105 Tempo dall inoculazione (ore) Foto tratte da R. Daniel, D. Guest / Physiological and Molecular Plant Pathology (2006) Concentrazione di fosfito g/l Risposte di radici di Arabidopsis thaliana 6 e 24 ore dall aggiunta di fosfonato (0.01 g/l) e zoospore di Phytophthora palmivora

106 Morte cellulare in cellule trattate con fosfonato e poi inoculate Produzione di superossido in radici trattate con fosfito ed inoculate (a destra)

107 Accumulo di lignina nel punto di attacco del patogeno (a: non trattato; b, c, d: trattato con fosfonato)

108 Non trattato e inoculato Trattato con fosfonato e inoculato Accumulo di composti fenolici (autofluorescenza)

109 Che cosa succede dopo il trattamento con fosfonato Le cellule della pianta infette subiscono cambiamenti: morte cellulare (ipersensibilità), attivazione di vie biosintetiche di difesa, accumulo di fitoalessine e deposito di barriere fisiche attorno alle cellule attaccate Aumentano enzimi coinvolti nella difesa: phenylalanine ammonialyase (PAL), 4-coumarate coenzyme- A ligase (4-CL), cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) Sintesi di composti fenolici, lignina

110 Dal punto di vista molecolare In A. thaliana l applicazione di fosfonato determina incremento della trascrizione di geni di difesa della via dell acido salicilico (PR1 e PR5) dell acido jasmonico/etilene (THI2.1 e PDF1.2) Se segue l inoculo del patogeno si ha una rapida deposizione di callosio e produzione di acqua ossigenata H 2 O 2 ) La risposta è maggiore e più rapida Fonte Eshraghi et al., 2011

111 inoculato Non inoculato Aumento dell espressione di PR1::GUS in foglie di Arabidopsis thaliana dopo applicazione di fosfonato (Phi) Fonte Eshraghi et al., 2011

112 Fonte: Lobato et al, 2011 Effetto persistente: trattamenti fogliari in preraccolta attivano i meccanismi di difesa e hanno effetto sulla sensibilità dei tuberi

113 Dal punto di vista del segnale Ancora molte ipotesi Probabilmente la via dell acido salicilico, coinvolto l acido abscissico, forse non direttamente la via dell acido jasmonico/etilene

114 Può sviluppare resistenza? L uso continuo del fosfonato può indurre resistenza del patogeno? Pochi casi e pochi studi sui fosfonati Bremia lactucae in California (Brown et al., 2004): isolati di patogeno che sporula anche in piante trattate Phytophthora cinnamomi da siti trattati e non (Dobrowolski et al., 2008): gli isolati da siti trattati sono meno inibiti

115 Piante di trattate Sinistra: crescita di isolati di P. cinnamomi provenienti da siti dove non era stato usato fosfonato Destra: crescita di isolati provenienti da siti dove era stato applicato il fosfonato Selezione di isolati meno sensibili in seguito all uso di fosfonati

116 Non influenza la normale microflora L applicazione al suolo di 1 o 10 g di fosfonato non cambia i numeri di batteri e funghi e nemmeno le proporzioni dei batteri e funghi potenzialmente antagonisti di Phytophthora cinnamomi Lo stesso dicasi per applicazioni fogliari a semenzali di avocado Effetto sulla microflora, se presente, solo minimo e transitorio

117 Fitotossicità In generale non si riscontra fitotossicità per le piante a meno di non essere in carenza di fosfato Attenzione deve essere anche posta sulla vite in presenza/combinazione con rame

118 Efficacia: pianta/patogeni Pianta Patogeno Riferimento Melo Alternaria alternata Reuveni et al., 2003 Cavolo Plasmodiophora brassicae Abbasi and Lazarovits, 2006 Cetriolo Pythium ultimum Abbasi and Lazarovits, 2006 Vite Plasmopara viticola Speiser et al., 2000 Lupino Phytophthora cinnamomi Smillie et al., 1989 Mais Peronosclerospora sorghi Panicker and Gangadharan, 1999 Arancio Phytophthora citrophthora Orbovi[1]c et al., 2008 Papaya Phytophthora palmivora Smillie et al., 1989 Peperone Phytophthora capsici Förster et al., 1998 Patata Phytophthora infestans Cooke and Little, 2002 Patata Phytophthora erythroseptica Johnson et al., 2004 Fragola Phytophthora cactorum Rebollar-Alviter et al., 2007 Tangelo Alternaria alternata Yogev et al., 2006 Tabacco Phytophthora nicotianae Smillie et al., 1989 Modificato da Deliolopoulos, 2010

119 Inibizione (%) Fosfonati e patogeni della vite Peronospora è altamente sensibile, l oidio molto meno peronospora oidio Concentrazione del fosfonato di potassio mm Fonte: e Dufour & Corio-Costet, 2013

120 Fosfonati e peronospora della vite Non trattato Metiram+pyra clostrobin Non trattato Fosfito di potassio Non trattato Metiram+pyra clostrobin Non trattato Fosfito di potassio Prove di efficacia in Francia: trattamenti settimanali con Metiram+pyraclostrobin o fosfonato di potassio (Pinto et al, 2012)

121 Residuo 100 mg/kg uva da vino e d tavola di fosetil, il prodotto di degradazione acido fosforoso e i loro sali (fosfonati) Normalmente il LMR non si supera con 3 trattamenti in pre-post fioritura della vite Variabilità di residuo tra annate, vitigni, numero e tempo trattamenti

122 Fosfonati e agricoltura bio Expert Group for Technical Advice on Organic Production (technical advice April 2014) L uso dei fosfonati è stato escluso per la produzione biologica, perché non è in linea con gli obiettivi ed i principi della produzione biologica (Regolamento CE No 834/2007) Se l obiettivo è quello di ridurre il rame allora bisogna trovare alternative compatibili con il bio

123 Uso dei fosfonati in agricoltura bio Prima dell ottobre 2013: in Germania registrati prodotti fortificatori basati sul fosfonato di potassio (all inizio era dichiarato, poi solo estratto di alghe ); per un breve periodo autorizzati anche in Austria, Repubblica ceca, Slovacchia ed Ungheria Fosfonato: mai stato autorizzato esplicitamente in produzione biologica, ma visto che i fortificatori potevano essere usati (Art. 16 of Reg. 834/2007), di fatto lo era

124 Bio: vite, peronospora e rame EGTOP- Sono disponibili e vanno preferite: Pratiche agronomiche che rendono la vite meno resistente Varietà resistenti Utilizzo di strategie con basse dosi di rame e sostanze parzialmente attive (es. laminarina) Fosfonati sono prodotti sinteticamente (segnalazioni della presenza naturale solo in meteoriti, pozze geotermiche, ecc.) Meglio del rame per il suolo

125 Bio: vite, peronospora e rame Anche se distinguibili dal fosetil, al momento i residui sono ora espressi come (fosethyl + phosphorous acid and their salts) ciò rende impossibile verificare che i produttori bio non abbiano usato fosetil Sono stati usati in agricoltura biologica dal 1980 (difficile sostenerne l uso tradizionale) Non sono autorizzati in USA ne dal Codex Alimentarius per il biologico Confusione nel consumatore

126 Grazie per l attenzione!