LaborAperto. microbiologia, fisica, chimica, biologia, ecologia ITIS e Liceo Scientifico G. Natta -BG I PRIMI OCCHI SUL DNA

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1 LaborAperto microbiologia, fisica, chimica, biologia, ecologia ITIS e Liceo Scientifico G. Natta -BG I PRIMI OCCHI SUL DNA Prof. Giuseppe Poeta Paccati, ITIS Giulio Natta Bergamo poetag@katamail.com v 1.0/2010

2 Volevo studiare la chimica del nucleo della cellula così, nel 1869, pensai di usare i globuli bianchi del sangue che mi potevo procurare in grandi quantità dal pus delle bende dei feriti della guerra di Crimea negli ospedali. Ciao ragazzi, mi chiamo Johann Friedrich Miescher, ma voi potete chiamarmi Freddy. Sono famoso perché sono stata la prima persona al mondo a vedere il DNA!! 2 Così ho scoperto che nei loro nuclei c era una sostanza acida, fino ad allora sconosciuta, che chiamai NUCLEINA. Ma il significato del mio lavoro non fu capito per interi decenni! Chiediamo a Freddy di ricordare per noi quella famosa esperienza. Ecco cosa ha da dirci. «Se non fossi diventato parzialmente sordo a causa del tifo, forse avrei svolto la professione di medico; la mia menomazione, invece, mi convinse che fosse meglio dedicarmi alla fisiologia e alla chimica cellulare. Così, nel 1868, avevo 24 anni, mi trasferì dalla nativa Svizzera a Tubinga, in Germania, per lavorare nel laboratorio del pioniere della biochimica, Ernst Felix Hoppe- Seyler, che fu colui che battezzò il pigmento rosso del sangue, emoglobina». «La mia vera passione erano i fondamenti teorici della vita e per questo volevo fare il ricercatore». Granulocita basofilo Un misterioso precipitato e la serendipica scoperta di Miescher «Incominciai a studiare vari tipi di proteine dei leucociti dato che proprio le proteine erano ritenute le molecole più promettenti per capire il funzionamento della cellula. Per vari mesi lavorai assiduamente in un laboratorio allestito nella cantina del castello di Tubinga. Con le tecniche analitiche a mia disposizione, però, nonostante facessi un buon lavoro, non ero in grado di distinguere le differenze tra le proteine delle cellule. Ma, quasi per caso, mi accorsi che quando aggiungevo ai miei estratti cellulari un acido, dalla soluzione si separava una sostanza che si ridiscioglieva con una base». «In quel momento non lo sapevo ancora, ma avevo ottenuto un precipitato grezzo degli acidi nucleici delle cellule. Ero il primo uomo ad avere visto il DNA!». «Dato che questa enigmatica sostanza poteva provenire solo dai nuclei delle cellule la battezzai: NUCLEINA!».

3 «Per ottenere questi risultati dovetti approntare dei metodi chimici di separazione che oggi potete, opportunamente modificati, ripetere anche voi alunni delle scuole. Sono molto contento che ciascuno di voi ripeta gli esperimenti che mi hanno reso famoso: in questo modo, anche se oggi non sono lì con voi, è un po come se lo fossi ogni volta che fate i miei esperimenti, io ritorno a vivere per un po Grazie!» 3 Il castello di Tubinga dove lavorò Miescher con Hoppe-Seyler Qualcuno di voi potrebbe chiedermi come facevo ad essere così sicuro che non si trattava di proteine ma di una nuova sostanza anche se ancora piuttosto sconosciuta. Ebbene una delle prove più convincenti che portai anche ai miei colleghi scienziati molto più severi e critici di voi ragazzi fu che la nucleina, al contrario di quanto avviene con le proteine, non poteva essere digerita dagli enzimi proteolitici (proteasi)». «Trovai inoltre che la nucleina conteneva fosforo, azoto e zolfo». «Gli estratti, però, erano ancora molto impuri, e la scoperta era così inusuale per quel tempo che persino il mio capo, Hoppe-Seyler, si mostrò diffidente (era un perfezionista un po maniaco!) e, prima di accettare di pubblicare i miei risultati sulla rivista di biochimica che aveva appena fondato, volle ripetere personalmente gli esperimenti». «Nel 1870 sono ritornato a Basilea nella mia città natale, dove perfezionai la tecnica di estrazione tanto che riuscii, per la prima volta, ad estrarre la nucleina pura dallo sperma dei salmoni del Reno. A quel tempo, infatti, il fiume era rinomato proprio per questi pesci». «Nell immagine qui accanto vedete un contenitore con un campione da me personalmente preparato. Sono contento che lo conserviate ancora così gelosamente!» «Nel 1889 un mio allievo, Richard Altmann, (nel frattempo ero diventato professore di fisiologia), sostituì il termine nucleina con quello che usate ancora oggi di acido nucleico». «Voi studenti, oggi, siete fortunati perché anche i laboratori della scuole sono molto attrezzati ma ai miei tempi le cose erano ben diverse e le difficoltà erano tante: ad esempio non c erano i frigoriferi e così ero costretto ad iniziare a lavorare prima dell alba in modo che i reagenti fossero sufficientemente freddi per riuscire a precipitare l acido nucleico».

4 «Pensate che gli estratti enzimatici di proteasi che mi servivano per purificare l acido nucleico dalle proteine, oggi si possono facilmente comprare nei negozi specializzati, io, invece, dovevo prepararmeli isolandoli dallo stomaco dei maiali appena macellati!» «In circa trent anni ho pubblicato solo nove articoli scientifici e un manoscritto di lezioni cosicché i miei importantissimi risultati divennero noti soprattutto grazie alle numerose lettere che scrivevo agli amici e ai colleghi raccontando le mie ricerche e scoperte». 4 «Quando finalmente la mia scoperta fu pubblicata nel 1871 la sua importanza non fu capita immediatamente e la funzione della nucleina rimase sconosciuta per molto tempo ancora dopo la mia morte. Pensate che ancora agli inizi del 1900, il famoso scienziato Phoebus Levene, 1 (resti fra noi ma guardatelo in fotografia, non assomiglia un po a Charlie Chaplin?) era ancora convinto che le molecole dell eredità fossero le proteine e non gli acidi nucleici!» Nonostante ciò fu proprio lui che scoprì che gli acidi nucleici sono costituiti da quattro basi azotate adenina, guanina, timina e citosina, dal ribosio (nel 1909) e, nel 1929, il desossiribosio. Stabilì inoltre che il ribosio era presente nell acido zimonucleico, (l RNA), mentre nell acido timonucleico, (il DNA), era presente il desossiribosio. Egli comprese addirittura quale fosse l ordine con cui i componenti degli acidi nucleici sono legati tra loro a formare delle unità che chiamò nucleotidi. Esso è: fosfato - zucchero base azotata. «Levene pensava, erroneamente, che il DNA fosse costituito da filamenti di unità nucleotidiche che contenevano le quattro basi azotate in proporzione esattamente uguale tenute assieme dai gruppi fosfato che costituivano il loro asse principale. Egli riteneva che vi fossero solo 4 unità per ciascun filamento (ipotesi del tetranucleotide)». Una struttura del DNA così fatta era troppo semplice e, pertanto, le proteine, con la loro grande variabilità, rimanevano ancora le migliori candidate per essere le molecole responsabili dell eredità dei caratteri. Come poteva, infatti, una molecola con 4 basi e 4 nucleotidi soltanto competere con la variabilità di molecole contenenti circa 20 amminoacidi ai fini di aggiudicarsi il titolo di molecola dell eredità?» «Solo nel 1949 Erwin Chargaff dimostrò, grazie al nuovo metodo della cromatografia su carta, che la proporzione della basi variava da specie a specie, e che le coppie di basi adenina-timina e guanina-citosina erano sempre presenti in quantità uguali. Levene Leonard Kossel aveva quindi torto e, così, tutta la questione poteva essere rimessa in discussione. Levene morì nel 1940 senza poter conoscere il vero significato del DNA». 1 Phoebus Aaron Theodore Levene, M.D. (Sagor, Lithuania 25 febbraio settembre 1940) analizzando il DNA scoprì che era costituito da adenina, guanina, timina, citosina, desossiribosio e fosfato. Lavorò con molti chimici tra i quali Albrecht Kossel e Emil Fischer.

5 È comunque riconosciuto che la scoperta di Miescher giocò un ruolo fondamentale nell identificazione degli acidi nucleici come la vera sede dei caratteri ereditari. L importanza del suo lavoro iniziò a divenire evidente quando un fisiologo tedesco, specializzato nella chimica fisiologica della cellula, del suo nucleo e delle proteine, Leonard Kossel 2, diede inizio agli studi sulla struttura chimica della nucleina. Successivamente arrivarono sulla scena scientifica Oswald T. Avery con i suoi colleghi Colin MacLeod e Maclyn McCarthy da un lato, e Al Hershey e Martha Chase dall altro, che con i loro classici esperimenti dimostrarono, definitivamente, che è il DNA e non una proteina la molecola che trasporta i caratteri genetici ereditari. 5 "Ossie" dimostra che il DNA è la sede dell informazione genetica. La scienza e la medicina in particolare non erano certo nei pensieri di Ossie - il nomignolo affibbiato al giovane Oswald Avery 3 - quando suonava il clarinetto con suo fratello maggiore Ernest sulle scale delle chiese per attirare l attenzione dei passanti. Per una ragione che ancora oggi rimane un mistero Avery, al termine degli studi universitari svolti presso la Colgate University nei quali eccelse in letteratura ed oratoria, inaspettatamente, decise di dedicarsi alla scienza medica entrando nel Collegio dei Medici e Chirurghi di New York dove, nel 1904, conseguì la laurea in medicina. Ciao come state? Mi chiamo Oswald Avery, "Ossie" per gli amici. Nel 1943, con i miei colleghi Colin MacLeod e MacIyn McCarty, ho eseguito una serie di esperimenti usando il batterio Pneumococcus pneumoniae, l agente eziologico della polmonite. Con essi ho dimostrato definitivamente - che è il DNA la molecola che porta l informazione genetica al contrario di quello che pensava la maggior parte dei miei colleghi scienziati. 2 Albrecht Karl Ludwig Martin Leonard Kossel fu insignito nel 1910 del Premio Nobel per la Fisiologie e la Medicina per le sue ricerche di biologia cellulare con particolare riferimento alle proteine ed agli acidi nucleici. 3 Oswald Theodore Avery, Halifax, Nuova Scozia, 21 ottobre febbraio 1955, Nashville.

6 Tra gli interessi di Avery vi fu, inizialmente, la batteriologia dello yogurt, ma quando Benjamin White - il direttore del laboratorio in cui lavorava, l Hoaghland Laboratory a Brooklyn, e che lo aveva istruito nelle tecniche di laboratorio e in biochimica si ammalò di una infezione polmonare, si dedicò allo studio della tubercolosi. È proprio in questo periodo che si convinse che si potessero comprendere le attività biologiche dei batteri patogeni attraverso la conoscenza della loro composizione chimica. Ciao Freddy, il mio amico ed io ti ricordiamo sempre con simpatia e riconoscenza. Senza di te, forse, nemmeno noi saremmo così famosi oggi! 6 Nel 1953 un giovane amante dell ornitologia ed un maturo fisico Watson e Crick, entrambi con la passione del gene, scoprirono la corretta struttura del DNA. «Ma questa è un altra affascinante storia che, però, non posso raccontarvi adesso!» Miescher morì di tubercolosi nel 1895 all età di soli 51 anni. L età degli antibiotici, i farmaci che avrebbero potuto salvarlo, era ancora là da venire! Il DNA è presente in tutte le cellule di tutti gli organismi viventi: nelle cellule dei BATTERI, Capsula Citoplasma Inclusioni Ribosomi Parete Membrana Nucleoide (DNA) Capsula Parete Membrana Plasmide (DNA) Flagelli Pili

7 nelle cellule ANIMALI 7 Lisosoma Centriolo Apparato del Golgi Reticolo endoplasmatico Citoplasma Cromatina Nucleo Mitocondrio Nucleolo Membrana nucleare Proteine Granuli di glicogeno Ribosomi Melanina Membrana cellulare nelle cellule VEGETALI Granulo d amido Tilacoidi del cloroplasto Membrana cellulare Parete cellulare Vacuolo Membrana del vacuolo Ribosomi Plasmodesma Dittiosomi del Golgi Cromatina Nucleolo Reticolo endoplasmatico Perossisoma Cloroplasto Mitocondrio Citoplasma. e persino nei VIRUS! Il genoma dei virus, normalmente, è formato da DNA, ma in alcuni tipi di virus, il materiale genetico è costituito di molecole di RNA. Filamento del DNA di un virus (TEM)

8 PREPARAZIONE DI UN ESTRATTO GREZZO DI DNA La procedura che impiegheremo si basa sul fatto che le strutture fosfolipidiche della membrana esterna delle cellule e quella del loro nucleo possono essere demolite usando il detersivo per piatti. Il campione in esame è spappolato in modo da separare, il più possibile, le cellule che possono così venire maggiormente a contatto con il detersivo successivamente aggiunto. In tal modo il DNA è liberato dalle membrane che lo trattenevano. Si filtra il liquido in modo da separare la soluzione contenente il DNA dai residui cellulari presenti in sospensione. Infine il DNA è precipitato con alcool in cui è insolubile. Il DNA così ottenuto può essere osservato al microscopio e può essere usato per successivi esperimenti. 8 Materiali: - Campioni per l estrazione: banana, kiwi, spinaci, fragole, fegato di pollo ecc. - Mortaio con pestello - Beuta da 300 ml - Soluzione al 4% di NaCl e di detersivo per piatti (senza fosfati) al 10% - Spruzzetta con acqua distillata - Cilindro graduato da 25 ml - Alcool etilico al 95% raffreddato in bagno di ghiaccio - Soluzione di pepsina al 3% in HCl 0,1 M, o, in alternativa, succo d ananas - Becher da 300 ml con acqua e ghiaccio - Imbuto - Garza per filtrazione - Microscopio con vetrini porta e coprioggetto - Blu di metilene - Bagnomaria con termometro - Provettone - Bacchetta di vetro - Pipette graduate - Aspiratore automatico per pipette - Contagocce Procedimento: A- ESTRAZIONE DEL DNA 1. Pesare 10g di del campione scelto per l estrazione (polpa di banana, di kiwi, spinaci, fragole ecc.) in un vetro di orologio. 2. Trasferire il campione pesato in un mortaio, aggiungere 10 ml di acqua distillata e macinarlo per non più di 2-3 min (se il trattamento è eccessivamente protratto nel tempo si rompono i filamenti di DNA che risultano più corti). 3. Filtrare la miscela con imbuto con garza e raccogliere il filtrato in un provettone posto nella beuta che lo sostiene. 4. Versare nel provettone un uguale volume della soluzione NaCl-detersivo: il detergente rompe le membrane di ogni cellula (plasmatica e nucleare) e libera il DNA dal nucleo. 5. Porre il provettone nel bagnomaria a 60 C per 15 min mescolando lentamente ogni 3-4 min per completare la rottura delle membrane cellulari liberando il DNA dal nucleo. L alta temperatura denatura la DNasi cellulare che potrebbe degradare il DNA.

9 6. Raffreddare per 6 min immergendo il provettone in un beker con ghiaccio mescolando ogni tanto, lentamente. Il repentino abbassamento della temperatura blocca il processo in corso di frammentazione del DNA causata dal calore. Non protrarre eccessivamente il raffreddamento Aggiungere 10 gocce di soluzione acida di pepsina 4 oppure 2-3 ml di succo d ananas agitando delicatamente. La pepsina o la bromelina 5 contenuta nel succo d ananas digeriscono gli istoni, le proteine legate al DNA. 8. Con la pipetta graduata versare gradualmente lungo le pareti del provettone 10 ml di alcool al 95% raffreddato in bagno di ghiaccio, evitando il rimescolamento dei liquidi. Filamenti di DNA Si formano due strati separati: sopra l alcool e sotto la miscela contenente il DNA. Dopo pochi secondi, alla superficie di contatto dei due liquidi, si osserva la formazione di uno strato filamentoso biancastro a forma di medusa : è il DNA. Infatti il DNA non si scioglie in alcool mentre è solubile nelle soluzioni acquose soprattutto se basiche. B PROVE BIOCHIMICHE E OSSERVAZIONE MICROSCOPICA DEL DNA B1 - Ruotando la bacchettina di vetro nella massa di DNA raccogliere un po di filamenti e trasferirli in una provetta e aggiungere 2-3 ml di acqua distillata. Agitare bene la miscela e descrivere cosa avviene. B2 Con la stessa tecnica trasferire un po di filamenti di DNA su un vetrino portaoggetti per microscopia e aggiungere una goccia di blu di metilene, un colorante basico. Coprire con il vetrino copri oggetti, esaminare al microscopio e descrivere le osservazioni. 4 La pepsina è un enzima proteolitico individuato nel 1836 da Theodor Schwann. Esso è stato il primo enzima animale ad essere stato descritto. 5 L ananas (Ananas comosus, famiglia delle Bromeliacea), contiene enzimi proteolitici, l ananaina, e la bromelina. Quest ultima fu individuata per la prima volta dal chimico venezuelano Vicente Marcano nel Con il termine bromelina s intendono due enzimi proteolitici simili: la bromelina del succo e la bromelina del gambo.

10 Bibliografia 10 [1] Dahm R., (2005). "Friedrich Miescher and the discovery of DNA". Dev Biol 278 (2005) : ] [2] Avery O., MacLeod C., McCarty M (1944). "Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Inductions of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III". J Exp Med 79 (2): ] [3] Levene P., (1919). "The structure of yeast nucleic acid". J Biol Chem 40 (2): [4] Kossel, Albrecht, (1910). Über das Agmatin. Zeitschrift für Physiologische Chemie 66: [5] Scoprire il DNA, Dean Madden, Centro Nazionale per l Educazione Biotecnologica dell Università di Reading, UK, School Science Review, Marzo Dimostrazione fotografica (microscopia elettronica) del processo di trascrizione del DNA e sintesi di filamenti di m-rna