Metabolismo batterico

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1 Metabolismo batterico

2 Metabolismo batterico E l insieme delle reazioni biochimiche attraverso le quali un organismo, partendo da composti organici ed inorganici, giunge alla formazione di specifiche macromolecole. Tutto ciò è reso possibile dal flusso dell energia e dalla partecipazione di enzimi. Funzione principale della cellula batterica è la crescita. I batteri realizzano i processi metabolici con una velocità da 10 a 100 volte superiore ed utilizzano svariati composti come sorgenti energetiche. Sintetizzano macromolecole in maniera semplificata, grazie alla semplicità della loro organizzazione. Alcuni processi biosintetici sono esclusivi (sintesi del peptidoglicano).

3 Metabolismo batterico Il metabolismo essendo l insieme di tutti i processi comprende sia il catabolismo che l anabolismo. Anabolismo: Reazioni di biosintesi di macromolecole (hanno bisogno di energia). Catabolismo: Reazioni di demolizione o di degradazione delle macromolecole (producono energia). Fornisce parte delle molecole necessarie per la biosintesi dei componenti cellulari. I nutrienti necessari per far avvenire le reazioni vengono sequestrati dall ambiente.

4 Quindi. Metabolismo batterico la cellula, attraverso i processi anabolici sovrintende alla crescita, alla replicazione e alla riparazione delle strutture cellulari; attraverso il catabolismo si fornisce l energia necessaria per lo svolgimento dei processi vitali.

5 I procarioti a differenza degli eucarioti possono produrre energia sia in presenza che in assenza di ossigeno. Ciò gli ha permesso di colonizzare tutti gli ambienti.

6 Possiamo classificare i microrganismi in base alla capacità di crescere in varie condizioni nutrizionali o fisiche. Classificazione degli organismi in base alla fonte di carbonio Eterotrofi: incapaci di utilizzare la CO 2 atmosferica e perciò usano il carbonio derivato da molecole organiche. Autotrofi: capaci di utilizzare la CO 2 atmosferica per la sintesi di strutture cellulari (Fotosintesi).

7 Classificazione degli organismi in base alla fonte energetica che la cellula utilizza per generare ATP Fototrofi, ottengono energia dalla luce solare Chemioautotrofi o litotrofi: microrganismi in grado di sintetizzare le proprie molecole organiche a partire da sostanze inorganiche e utilizzano energia non derivante da sostanze organiche assimilate. Chemioeterotrofi: utilizzano composti organici sia come fonte di carbonio che come fonte di energia. I batteri di interesse medico appartengono a questo raggruppamento.

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9 L energia rilasciata come risultato delle reazioni redox che avvengono nella cellula deve essere immagazzinata e conservata per poi essere utilizzata nelle diverse reazioni biologiche. Nei chemioeterotrofi, che nel metabolismo energetico utilizzano sostanze chimiche come donatori di elettroni, si riconoscono due meccanismi destinati alla conservazione dell energia: la respirazione la fermentazione

10 Respirazione aerobica, utilizzano una catena respiratoria con accettore finale O 2 Respirazione anaerobica, catena respiratoria con accettore finale NO 3, NO 2, SO 4, Fe Fermentazione, avviene quando nell habitat non sono disponibili accettori di elettroni come nella respirazione; si ha ossidazione parziale a molecole organiche. Fotosintesi, conversione dell energia luminosa in energia chimica utilizzata poi per la riduzione di CO 2.

11 I due sistemi differiscono nel meccanismo in base al quale l ATP viene sintetizzato: nella respirazione cellulare aerobia è presente l ossigeno molecolare come accettore di elettroni.

12 Il meccanismo attraverso il quale si produce energia è basato sulla presenza, a livello della membrana cellulare, di una serie di componenti proteiche (citocromi), disposte in serie secondo un gradiente di potenziale elettrochimico decrescente, sulle quali vengono fatte passare le molecole che sono soggette ad ossidazione. In seguito all ossidazione le molecole cedono elettroni creando un gradiente protonico, che genera un energia che viene utilizzata per produrre ATP (fosforilazione ossidativa).

13 L acetic CoA prodotto dal piruvato viene incanalato nel Ciclo di Krebs o degli acidi tricarbossilici. Questo determina il rilascio di molti protoni ed elettroni che vengono trasferiti lungo la catena repsiratoria e ceduti all accettore terminale (Ossigeno).

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15 Nella respirazione cellulare anaerobica il donatore di elettroni è un composto organico o inorganico, ma l accettore di elettroni finale è una molecola ossidata diversa (nitrati, solfati, o anidride carbonica). L ATP si produce per fosforilazione ossidativa, grazie alla formazione di un gradiente di protoni sulla membrana cellulare. La resa energetica è la stessa di quella aerobia, ma più lenta. Questo spiega la velocità di crescita di una coltura aerobia (24 ore) rispetto a quella anerobica (48 ore).

16 Nella fermentazione il processo redox avviene in assenza di accettori terminali di elettroni, ma l ossidazione avviene accoppiata alla riduzione di un composto generato dal substrato. L acido piruvico è un intermedio fondamentale nel processo fermentativo; l energia (ATP) è prodotta con reazioni di fosforilazione a livello di substrato, durante specifici stadi del catabolismo. Non avviene sulla membrana batterica come si ha nella fosforilazione ossidativa.

17 Nella fosforilazione a livello del substrato si ha un ossidazione non completa della molecola organica e l accettore finale di elettroni è un altra molecola organica interna allo stesso processo. Molti sono i composti ricchi di energia che sono coinvolti nella fosforilazione a livello del substrato. Sono composti ai quali è legato un gruppo fosfato o molecole del coenzima A; l idrolisi di questi composti è fortemente esoergonica producendo nella maggior parte dei casi ATP. Bilancio energetico: 2 ATP contro i 38 della respirazione aerobia.

18 A partire dall acido piruvico è possibile ottenere vari prodotti finali che distinguono le varie fermentazioni batteriche. Fermentazione tipica dei Lattobacilli Accettore di elettroni Fermentazione tipica di alcuni lieviti e batteri Fermentazione tipica degli Enterobatteri Fermentazione tipica del Propionibacterium

19 Fermentazione lattica La fermentazione più comune degli zuccheri ha come prodotto principale l acido lattico. I batteri lattici sono organismi Gram positivi che producono acido lattico come principale prodotto della fermentazione. Sono noti due modelli fermentativi: l omofermentativo l eterofermentativo

20 Fermentazione lattica Fermentazione omolattica l unico prodotto finale è l acido lattico che si ottiene per riduzione diretta dell acido piruvico con rigenerazione di NAD+. Questa fermentazione è tipica di Lactobacillus spp.; viene sfruttata per ottenere vari prodotti alimentari come lo yogurt.

21 I batteri lattici (LAB) non possiedono il corredo enzimatico completo per la biosintesi del gruppo eme, fondamentale nella struttura dei citocromi che costituiscono la catena respiratoria. I LAB hanno i citocromi ma privi del gruppo eme. Pertanto la maggior parte dei LAB non possono avere catene respiratorie funzionanti né aerobie né anaerobie. Solo alcuni batteri appartenenti al genere Streptococcus hanno la capacità di sottrarre il gruppo eme ad altre cellule e di inserirlo nella propria catena respiratoria in modo da poterla far funzionare; gli altri hanno dovuto trovare vie metaboliche compensative quali la fermentazione lattica.

22 A differenza della fermentazione omolattica, la fermentazione eterolattica sfrutta un processo di degradazione del glucosio diverso dalla glicolisi. I prodotti finali saranno oltre al lattato, etanolo e CO2. Un modo per distinguere i batteri omofermentanti dagli eterofermentanti è quello di osservare la produzione di CO2. Questa via è nota anche come shunt degli esosi monofosfati o via di Warburg-Dickens.

23 23 Brook, Biologia dei microrganismi 2 Microbiologia ambientale e industriale

24 Nelle fermentazioni acido-miste, tipiche dei batteri enterici, i differenti acidi che si formano dalla fermentazione del glucosio o altri zuccheri sono tre: acido acetico, lattico e succinico, oltre a etanolo, CO2 e H2. E.coli usa questo tipo di fermentazione mista.

25 Brook, Biologia dei microrganismi 2 Microbiologia ambientale e industriale 25

26 Si definiscono reazioni energetiche quelle che procurano alla cellula l energia necessaria ed i 12 precursori metabolici utilizzati nelle reazioni biosintetiche

27 TRASPORTO DEI NUTRIENTI ALL INTERNO DELLA CELLULA Per poter utilizzare i nutrienti è necessario portarli all interno della cellula: l unico composto chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna dalla cellula batterica è l acqua TRASPORTO FACILITATO Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte del microrganismo) che opera solo quando il soluto è in concentrazione maggiore all esterno che all interno della cellula. La diffusione passiva rende conto dell ingresso di ben pochi nutrienti, come l ossigeno disciolto, l anidride carbonica e l acqua stessa. Anche la diffusione facilitata non usa energia cosicchè il soluto non raggiunge una concentrazione interna maggiore di quella esterna. E però selettiva grazie alle protein channel che formano canali selettivi per il passaggio di singole molecole. Sono comunque sistemi poco efficienti e troppo lenti.

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29 TRASPORTO ATTIVO Nel trasporto attivo la concentrazione interna del soluto si mantiene superiore a quella esterna, spendendo energia. Ci sono due tipi di meccanismi di trasporto che dipendono dalla fonte di energia impiegata: il trasporto ioni-accoppiato e il trasporto ABC (ATP-binding cassette). Trasporto ioni-accoppiato. Questi sistemi muovono una molecola attraverso la membrana cellulare a spese di un gradiente ionico creato in precedenza, come forza motrice protonica o sodica. Sono di tre tipi fondamentali: uniporto, simporto e antiporto.

30 TRASPORTO ATTIVO Uniporto: catalizza il trasporto di un substrato indipendentemente da qualsiasi ione. Simporto: catalizza il trasporto simultaneo di due substrati che vanno nella medesima direzione mediante una singola proteina carrier della membrana citoplasmatica; per esempio un gradiente di H + può permettere il trasporto contemporaneo di uno ione con carica opposta o di una molecola neutra (galattosio). Antiporto: catalizza il trasporto simultaneo di due composti con carica simile in direzione opposte mediante un trasportatore comune (ad esempio, H + :NA + ) Una singola proteina carrier può catalizzare solo uno di questi processi o anche tutti i tre.

31 Sistemi di trasporto di membrana

32 TRASPORTO ATTIVO Trasporto ABC (ATP-binding cassette). Questo meccanismo usa direttamente l ATP per trasportare soluti dentro la cellula. Nei batteri gram-negativi, il trasporto di molti nutrienti è facilitato da proteine leganti specifiche localizzate nello spazio periplasmatico; nei batteri gram-positivi le proteine leganti sono attaccate alla superficie esterna della membrana della cellula. Queste proteine funzionano trasferendo il substrato ad un complesso proteico legato alla membrana. L idrolisi viene innescata e l energia è usata per aprire il poro della membrana per consentire il movimento unidirezionale del substrato dentro le cellula.

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34 TRASPORTO ATTIVO Trasporti speciali. Il ferro (Fe) è un nutriente essenziale per la crescita dei batteri. I compartimenti interni degli animali non contengono Fe libero, ma è sequestrato in complessi con proteine come la transferrina e la lattoferrina. Alcuni batteri riescono a sequestrare il Fe secernendo i siderofori, composti che chelano il Fe e favoriscono il suo trasporto come complesso solubile. Un composto importante di siderofori nei batteri gram-negativi è formato da derivati dell acido idrossaminico (-CONH 2 OH) che chela fortemente il Fe ossidato (Fe 3+ ) che è insolubile. In questo modo il complesso ferro idrossamato è trasportato attivamente dentro la cellula batterica, libera il ferro e l idrossamato fuorisce nuovamente per essere riutilizzato.

35 Le molecole di zucchero o le altre risorse di carbonio e di energie portate all interno della cellula, vengono metabolizzate attraverso le vie principali quali la via glicolitica di Embden- Meyerhof, la via dei pentosi fosfato ed il ciclo di krebs, al fine di produrre i composti organici necessari per la biosintesi. Così lavorando in concerto le vie energetiche producono i 12 Così lavorando in concerto le vie energetiche producono i 12 precursori metabolici essenziali.

36 Ciclo degli acidi tricarbossilici

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39 RIPRODUZIONE La maggior parte dei batteri di interesse medico si riproduce mediante SCISSIONE BINARIA (trasversale). Questo processo di riproduzione asessuata assicura alla cellula procariotica una esatta ripartizione del corredo cromosomico tra due cellule figlie, che risulteranno uguali

40 CICLO CELLULARE a) sintesi coordinata di macromolecole e di altri componenti cellulari: crescita; b) formazione del setto; c) divisione caratterizzata da una serie di reazioni che culminano nel trasferimento di una copia di DNA in ciascuna cellula delle cellule figlie.

41 La divisione di un microrganismo per scissione si realizza attraverso fasi successive 1) Inizialmente il corpo batterico si allunga per accrescimento sia della membrana citoplasmatica che della parete cellulare. Ciò avviene generalmente in corrispondenza del mesosoma o del sito di membrana a cui è ancorato il materiale nucleare. Durante questa fase si ha invaginazione della membrana citoplasmatica e aumento della parete cellulare Manca il fuso mitotico, ma si forma un apparato mitotico primordiale nel quale risulta centrale la funzione della membrana citoplasmatica (mesosomi).

42 2) Contemporaneamente ha inizio la duplicazione del cromosoma batterico 3) L accrescimento in senso centripeto della parete cellulare e della membrana citoplasmatica porterà alla formazione, nella porzione centrale della cellula, di un setto trasverso, che determinerà l allontanamento dei due nuovi cromosomi per distanziamento delle zone della membrana citoplasmatica alle quali sono ancorati. 4) Con il completo sviluppo di questa struttura si otterrà la separazione delle due cellule figlie.

43 In alcuni casi il setto di parete cellulare, rimanendo a lungo incompleto genera la formazione di raggruppamenti di cellule in rapporto ai successivi piani di divisione cellulare.

44 La divisione batterica per scissione binaria determina la moltiplicazione del microrganismo in maniera esponenziale, così che, dopo tre divisioni, da una cellula batterica se ne formano otto

45 IL TEMPO DI REPLICAZIONE DIPENDE DA: L intervallo di tempo necessario al batterio per riprodursi è detto tempo di duplicazione (o tempo di replicazione) e varia tra i differenti microrganismi e a seconda delle condizioni di crescita. Escherichia coli e la maggior parte dei batteri ha, in condizioni ambientali ottimali (create in laboratorio), un tempo di duplicazione di minuti; in questi casi bastano 12 ore (35 generazioni) per ottenere da una singola cellula miliardi di batteri. In condizioni naturali, ad esempio nell intestino umano, Escherichia coli impiega ben 12 ore per effettuare una divisione cellulare.

46 Altri microrganismi patogeni hanno tempi di duplicazione molto più lunghi: Mycobacterium tuberculosis pallidum si replica in 33h. si replica in 18h Treponema Per replicarsi i batteri non necessitano solo di adatte sostanze nutritizie ma anche di opportune condizioni ambientali. Sia la sopravvivenza che la moltiplicazione batterica sono influenzate da: 1. temperatura 2. disponibilità di ossigeno 3. ph 4. pressione osmotica

47 TEMPERATURA Le differenti specie batteriche presentano differenti temperature di crescita. Esiste un range di temperature all interno del quale la crescita microbica può verificarsi. Al di sopra della temperature massima o al di sotto di quella minima il microrganismo non si replica. L influenza della temperatura sulla crescita microbica è un riflesso dell effetto della temperatura sulle reazioni enzimatiche cellulari. Se la temperatura aumenta troppo, gli enzimi e le proteine vengono denaturati con danneggiamento e morte della cellula batterica. Viceversa, se troppo bassa l attività enzimatica è rallentata.

48 TEMPERATURA In base alla temperatura ottimale di crescita i batteri vengono classificati in: Psicrofili: microrganismi con un optimum di sviluppo tra C. Alcuni batteri possono replicarsi anche a temperature inferiori ai 10 C (Listeria monocytogenes) e quindi essere in grado di svilupparsi nei cibi refrigerati. Mesofili: a questo gruppo appartengono la maggior parte dei batteri patogeni per l uomo. Essi crescono a temperature comprese tra i 20 e i 40 C con un optimum di temperatura di C. Termofili: microrganismi che hanno un optimum di temperatura di circa 45 C. Si possono isolare in sorgenti termali, in cui questi batteri si moltiplicano a temperature comprese tra 40 e 60 C. Stenotermofili: microrganismi che si moltiplicano a temperature superiori a 60 C. Le molecole dei termofili e stenotermofili hanno una struttura terziaria particolarmente stabile che li rende resistenti a temperature più elevate.

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50 RICHIESTA DI OSSIGENO Nel colonizzare gli ambienti terrestri i batteri hanno sviluppato modalità diverse di utilizzo dell ossigeno. Li possiamo, così, distinguere in base alle esigenze di ossigeno libero, ma anche alla loro abilità nel proteggersi dagli effetti nocivi dei prodotti reattivi che si formano nel metabolismo aerobio come il perossido di idrogeno (H 2 O 2 ) e l anione superossido (O 2- )

51 RICHIESTA DI OSSIGENO Il perossido di idrogeno viene prodotto nelle reazioni in cui l ossigeno è l accettore terminale di elettroni e protoni, mentre il radicale superossido è un prodotto intermedio risultante dalla riduzione dell ossigeno molecolare. L enzima superossido dismutasi, presente in tutti gli organismi procarioti ed eucarioti, ha la funzione di detossificare il radicale superossido convertendolo in ossigeno molecolare.

52 RICHIESTA DI OSSIGENO I batteri che perdono la capacità di produrre superossido dismutasi e catalasi (enzima che detossifica il perossido di idrogeno) sono sensibili alla presenza di ossigeno molecolare e generalmente crescono anaerobicamente utilizzando la fermentazione. I batteri che posseggono questi enzimi possono crescere in presenza di ossigeno, ma l utilizzazione metabolica dell ossigeno dipende dalla loro capacità respiratoria.

53 RICHIESTA DI OSSIGENO In base alla capacità che hanno i batteri di utilizzare l ossigeno molecolare come accettore finale, possiamo raggruppare le diverse specie batteriche in quattro classi principali: Aerobi obbligati: batteri che crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico e utilizzano un metabolismo aerobio. Questi comprendono, soprattutto, patogeni delle vie respiratorie, come ad es. Mycobacterium tuberculosis o alcune specie di Neisseria. Anaerobi obbligati: batteri che possono vivere solo in assenza di ossigeno molecolare e per i quali la presenza di ossigeno atmosferico è addirittura tossica (microrganismi non ossigenotolleranti). La maggior parte dei batteri anaerobi vive nel tratto gastrointestinale dell uomo, ad es., alcune specie di Bacteroides, costituenti del microbiota intestinale, responsabili di ascessi in diversa sede, e alcune specie di Clostridium. Utilizzano la fermentazione.

54 Anaerobi facoltativi: batteri che sono capaci di crescere in condizioni aerobie e anaerobie. Gli anaerobi facoltativi comprendono molti batteri di interesse medico come: Vibrio, Spirillum, Escherichia, Aerobacter, Salmonella e Shigella tra i batteri Gram negativi; tra i Gram positivi la maggior parte dei bacilli e Staphylococcus. Se l ossigeno è presente utilizzano la respirazione, se è assente la fermentazione

55 Microaerofili: batteri che hanno bisogno per moltiplicarsi di una atmosfera con una ridotta pressione parziale di ossigeno; essi non crescono o crescono molto stentatamente in presenza di aria, ma si moltiplicano bene in atmosfera addizionata di CO 2. A questo gruppo appartengono, ad es., microrganismi Gram positivi quali ad es. Streptococcus, Lactobacillus e Propionibacterium e tra i Gram negativi Campylobacter. Questi microrganismi crescono bene in recipienti a tenuta all interno dei quali l aria può essere modificata, facendo reagire l ossigeno libero con H generato da un sistema chimico inserito nel contenitore. Inoltre, si aggiunge un generatore di CO 2 (acido citrico e sodio bicarbonato) che viene attivato con aggiunta di acqua al momento dell uso, portando la percentuale di CO 2 dell atmosfera dallo 0,03% al 5-10%. La presenza di un catalizzatore nel sistema consente la combinazione dell O 2 presente nel recipiente con l H sviluppatosi e la formazione di acqua

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58 CONDIZIONI DI ph La maggior parte dei microrganismi richiede concentrazioni ottimali di ioni idrogeno, anche se possono moltiplicarsi in un range abbastanza ampio di ph. Il valore di ph ottimale per le specie patogene per l uomo è compreso tra 6.5 e 7.5; alcuni microrganismi, però crescono meglio a ph alcalino (Vibrio cholerae ), mentre altri si moltiplicano anche a ph fortemente acido (Lattobacilli).

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60 PRESSIONE OSMOTICA Un microrganismo generalmente si moltiplica meglio in un terreno con concentrazione osmotica più bassa della propria. Ciò permette all acqua di fluire nella cellula, condizione essenziale per la diffusione dei nutrienti. Se la pressione osmotica è elevata (ad esempio portando la concentrazione di cloruro di sodio al 15-20% in un terreno di coltura o al 20% quella del glucosio) si impedisce l assunzione di acqua da parte del batterio e il microrganismo non si replica.

61 PRESSIONE OSMOTICA Alte concentrazioni osmotiche possono essere però utilizzate per la conservazione degli alimenti. Infatti, solo alcuni microrganismi sono in grado di moltiplicarsi in condizioni ipertoniche; questi batteri, detti osmofili o alofili, tollerano elevatissime concentrazioni di cloruro di sodio.

62 CURVA DI CRESCITA BATTERICA In idonee condizioni alle quali il batterio si è completamente adattato, esso è in uno stato di crescita bilanciata. In tali situazioni la crescita batterica segue il principio di una reazione chimica di primo ordine: l entità di crescita del batterio è proporzionale al numero o alla massa dei batteri presenti ad un determinato tempo.

63 Utilizzando un sistema di assi cartesiani semilogaritmico vengono riportati sull asse delle ascisse i tempi di osservazione e sull asse delle ordinate il numero dei batteri. Si otterrà una curva di crescita distinta in 4 fasi 1. Fase di latenza (fase lag) 2. Fase di crescita esponenziale o fase logaritmica (fase log) 3. Fase stazionaria 4. Fase di declino o lisi

64 FASE DI LATENZA Tale fase è caratterizzata dall aumento di volume della cellula, in assenza di divisione cellulare, dall incremento di proteine, acidi nucleici, soprattutto acido ribonucleico. È in questa fase iniziale che il batterio ha necessità di adattarsi alle nuove condizioni ambientali, sintetizzando gli enzimi di adattamento che gli consentono di utilizzare i substrati necessari alla sua moltiplicazione.

65 La durata della fase lag dipende da numerosi fattori: 1. fattori dipendenti dall inoculo: la durata della fase di latenza è inversamente proporzionale alla quantità dell inoculo ed è direttamente proporzionale all età delle cellule dell inoculo, ossia alla fase di crescita in cui si trova la coltura da cui deriva l inoculo. Se l inoculo è costituito da cellule batteriche in fase di crescita logaritmica, la fase lag scompare. 2. fattori dipendenti dal terreno: la fase di latenza si allunga se l inoculo proviene da un terreno diverso da quello utilizzato per lo studio della curva di crescita. È chiaro che in tal caso il tempo maggiore è necessario affinchè la cellula possa sintetizzare gli enzimi di adattamento che le consentiranno l utilizzo di nuovi substrati.

66 FASE LOGARITMICA Alla fine della fase lag si assiste all inizio delle divisioni cellulari e ad un incremento della velocità di crescita. Tale periodo della crescita batterica viene anche definito fase di accelerazione positiva della crescita. Subito dopo inizia la fase esponenziale o logaritmica (fase log). Il tempo di generazione (ossia il tempo che un certo numero di batteri impiega a duplicarsi) è costante e la velocità di crescita è massima e costante, di conseguenza l incremento della popolazione batterica è costante. Se si riuscisse a partire da un unica cellula, dopo n divisioni il numero di cellule sarebbe x (n) = 1 2 n

67 FASE LOGARITMICA In questa fase si ha la produzione di metaboliti primari. Sono sostanze necessarie per lo sviluppo del microrganismo quali carboidrati, proteine, aminoacidi, acidi nucleici, nucleotidi e lipidi.

68 Verso la fine della fase log il tempo di generazione si allunga, la velocità di crescita va diminuendo e il tasso di moltiplicazione e di morte cellulare si equivalgono. È questa fase definita anche fase di accelerazione negativa della crescita la fase di crescita log può essere distinta in tre parti: 1) Fase di accelerazione positiva, in cui il tempo di divisione aumenta e la velocità di crescita aumenta. 2) Fase di crescita esponenziale o logaritmica, in cui sia il tempo di divisione che la velocità di crescita sono costanti. 3) Fase di accelerazione negativa, in cui il tempo di divisione si allunga e la velocità di crescita diminuisce.

69 FASE STAZIONARIA Alla fine della fase di accelerazione negativa, sia per l esaurimento di sostanze nutritive sia per l accumulo di metaboliti tossici, sia per un fenomeno di inibizione da contatto, la popolazione batterica entra nella fase di crescita stazionaria. In tale fase un certo numero di cellule continua a moltiplicarsi con tempi di generazione più lunghi e con velocità di crescita molto bassa, altre cellule muoiono. Si stabilisce una sorta di equilibrio dinamico, per cui, di solito, il numero di cellule che muore equivale al numero di cellule che ancora si divide.

70 FASE STAZIONARIA In questa fase vengono prodotti i metaboliti secondari a partire da intermedi o prodotti del metabolismo primario. Sembrano non essere essenziali per il microrganismo produttore. I metaboliti secondari possono avere attività antibiotica, o possono essere utilizzati come inibitori di enzimi, promotori di crescita o nella produzione di farmaci. Perchè siano prodotti non è noto; si sa che la loro produzione avviene quando c è ridotta disponibilità di nutrienti.

71 FASE STAZIONARIA E possibile che derivino da prodotti intermedi necessari nella fase log, ma non essendo utilizzati perchè in fase stazionaria siano convertiti in metaboliti secondari In questo modo non viene repressa la sintesi degli intermedi a basso peso molecolare e si evitano problemi metabolici legati all accumulo intracellulare di alte concentrazioni di questi metaboliti.

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74 FASE DI LISI O DI DECLINO la morte è una funzione esponenziale e si evidenzia come una riduzione lineare del numero di cellule vitali nel tempo. Il tasso di mortalità aumenta fino a raggiungere un livello costante. Tale fase può durare anche mesi, se un piccolo numero di cellule vive persiste nella coltura e continua a moltiplicarsi, utilizzando i metaboliti liberati dalle cellule lisate.

75 Colture in continuo E possibile prolungare artificialmente la fase di crescita esponenziale ricorrendo alle colture in continuo. In tale sistema le cellule sono mantenute costantemente in fase di crescita esponenziale e la densità della coltura rimane costante. Ciò si ottiene aggiungendo terreno fresco al contenitore ed eliminando la stessa quantità di terreno di coltura sfruttato.

76 Che tipo di terreno si usa per studiare la curva di crescita? Biomassa batterica Colonie batteriche

77 BIOSINTESI del PEPTIDOGLICANO E un lunghissimo polimero lineare, stabilizzato da fitti legami trasversi. E formato dall unione di unità ripetute disaccaridiche costituite da N-ACETILGLUCOSAMMINA (GluNAc o NAG) ed acido N-ACETILMURAMICO (MurNAc o NAM). Al gruppo carbossilico dell acido muramico è legato un TETRAPEPTIDE i cui aminoacidi sono rappresentati da L- alanina, acido D-glutamico, L-lisina (se Gram- abbiamo l acido Mesodiaminopimelico) e D-alanina

78 BIOSINTESI del PEPTIDOGLICANO Nel polimero NAG e NAM sono uniti da un legame beta-1,4 glicosidico I diversi polimeri sono collegati trasversalmente tra di loro in corrispondenza dei tetrapeptidi, mediante un altro corto peptide formato da aminoacidi uguali, tipicamente di PENTAGLICINA, i quali uniscono la D-alanina terminale di una catena con la L-lisina della catena successiva.

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80 Biosintesi del peptidoglicano La biosintesi del peptidoglicano avviene in dieci fasi: le prime fasi hanno luogo nel citoplasma con l intervento di ATP. Nel citoplasma una serie di reazioni conducono alla sintesi dell acido N- acetilmuramico (NAM) a partire da N- acetilglucosammina (NAG). Al NAM si aggiungerà una nuova molecola di NAG con un legame 1-4-b glucosidico, a formare l unità strutturale di base a cui si aggiungeranno gli amminoacidi che a seconda della specie batterica formeranno il ponte tra i pentapeptidi adiacenti.

81 Biosintesi del peptidoglicano Le unità strutturale di base neosintetizzate saranno legate ad un vettore lipidico, chiamato bactoprenolo, per il trasporto attraverso la membrana cellulare. All esterno della cellula avverranno le varie fasi di polimerizzazione ad opera di diversi enzimi tra cui le transpeptidasi (PBP).

82 Penicillin-binding protein (PBP)

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