Patch clamp - 2. Bisogna avere:

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Pietro Bellucci
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1 Patch clamp - 1 La tecnica del voltage clamp ci ha permesso di studiare le correnti ioniche transmembranarie (ovvero le variazioni di conduttanza della membrana), in particolare quelle che sostengono i pda. Oggi sappiamo che correnti e conduttanze misurate in voltage clamp riflettono il comportamento di una o più popolazioni di canali ionici presenti nella membrana. Quindi H&H hanno valutato a livello macroscopico la somma di numerossimi eventi che si verificano a livello microscopico (molecolare). Il comportamento dei singoli canali è diventato accessibile all indagine sperimentale con l avvento della tecnica del patch clamp ( blocco d area ). <Neher & Sackman (Goettingen, anni 80)> L idea di partenza: isolare elettricamente un area piccolissima (un patch ) di membrana, e registrare le correnti ioniche che fluiscono attraverso i pochi canali ionici (al limite, uno solo) che vi sono presenti, in modo da risolvere le correnti di singolo canale (single channel currents).

3 Patch clamp - 2 Bisogna avere: a) un elettrodo di vetro simile a quelli usati per le registrazioni intracellulari, ma spuntato: la sua bocca (2-3 µ) viene cotta (forgiata) al calore per renderla perfettamente pulita e non tagliente. Quando il bordo arrotondato dell elettrodo viene portato a contatto della membrana con le dovute cautele, si realizza una saldatura ( seal, probabilmente dovuta ad interazioni elettrostatiche tra vetro e membrana), così perfetta da isolare il patch dalla soluzione circostante. Il seal è facilitato da una suzione applicata all elettrodo dopo un accurata pulizia della superficie cellulare. Un buon seal (dev essere di almeno qualche GΩ) è una condizione imprescindibile per poter registrare le correnti di singolo canale, altrimenti il rumore di fondo <noise> è troppo grande e le maschera.

4 Patch clamp - 5 Le SCC si presentano come una sequenza di eventi discreti (off-on e viceversa), riconducibili alla variazione di stato C O del singolo canale. Naturalmente quando il canale è in C, non si registra corrente; quando il canale è in O, si registrerà al solito I j = γ (V cl -E j ) dove j indica la specie ionica per la quale il canale è selettivo, Ej il suo pot. di equilibrio, V cl =V c -V m. La variazione di stato è rapidissima, inferiore al potere di risoluzione temporale dei normali strumenti.

5 Patch clamp - 6 Fu subito evidente che le condizioni che modificano il gating dei VOC e dei ROC non modificano la conduttanza dei singoli canali, ma bensì la probabilità del canale di trovarsi nello stato aperto o nello stato chiuso. Ad esempio Un canale VD (A) passa una maggior percentuale di tempo nello stato aperto se la membrana è depolarizzata Notare che cambiando il potenziale di comando cambia anche l ampiezza delle SCC. Perché? Un canale chemio-dipendente (B) attivato per esempio dall acetilcolina passa una maggior percentuale di tempo nello stato aperto quando la concentrazione dell Ach aumenta. Naturalmente esistono anche canali che vengono deattivati da uno stimolo.

6 Patch clamp - 8 L analisi in patch clamp delle correnti di singolo canale ha sostanzialmente confermato le aspettative dei modelli tipo H&H, intesi a spiegare il comportamento (voltaggio-, tempo-, chemio-dipendente, ecc.) delle correnti macroscopiche modelli fondati sull idea che ogni variazione di conduttanza ionica della membrana sia dovuta alla variazione del numero di canali che si trovano nello stato aperto : g m =N o γ e che questo, per la legge dei grandi numeri (o meglio: assumendo che il sistema sia ergodico), sia dato dal numero dei canali presenti <N tot > moltiplicato per la probabilità di ogni canale di trovarsi nello stato aperto <p o >): N o =N tot p o Se il sistema è ergodico, la probabilità di ogni canale di trovarsi nello stato aperto <p o > è uguale alla percentuale di tempo che ogni canale passa nello stato aperto, quale risulta dall analisi temporale delle SCC. Nel caso più semplice (modello a due stati) questa percentuale sarà p o =k o->c /(k c->o + k o->c ) Perciò, se sommiamo un gran numero di registrazioni di SCC e le sincronizziamo, otterremo l evoluzione temporale della corrente macroscopica. Nel caso dell assone gigante del calamaro ad esempio

7 Patch clamp - 9 Domanda : che composti deve contenere l elettrodo nei due casi? Le costanti di velocità delle transizioni C O (ed O I nel caso del Na+), determinate in base alla distribuzione statistica (istogrammi) dei tempi di apertura e di chiusura, sono risultate pressapoco uguali alle α m e β m, α n e β n, ecc. anticipate da H&H.

8 Patch clamp - 10 Finora ci siamo riferiti alla condizione chiamata cell attached (A). Questa è necessaria per la registrazione delle correnti di singolo canale (voltaggio-dipendenti o meccanodipendenti), ma non è l unica configurazione della tecnica del patch clamp. La condizione di whole cell (C) è quella più usata. Essa permette di registrare le correnti ioniche che attraversano tutta la membrana, effettuando un voltage clamp con un solo elettrodo anzichè due elettrodi, cosa che è impossibile da fare nelle cellule più piccole, ad es. globuli rossi o linfociti Naturalmente la soluzione che riempie l elettrodo dev essere tale da perturbare il meno possibile la composizione ionica intracellulare. Che caratteristiche dovrà avere in linea di massima? Però le proteine intracellulari (protein-chinasi, calmoduline ecc.) vengono inevitabilmente dilavate.. Per aggirare questo problema, si può usare le tecnica del perforated patch, che consiste nel restare in cell-attached aggiungendo nell elettrodo delle molecole che formano canali ionici non selettivi, ad es. la Nistatina

9 Patch clamp - 11 L utilità della condizione whole cell è tale che praticamente oggi non si usa più la tecnica del voltage clamp con due elettrodi, tranne che in situazioni particolari (es. oocita di Xenopus ). Dalla configurazione whole cell si può facilmente passare alla configurazione di outside out (D), nella quale il patch presenta all esterno dell elettrodo il versante extracellulare della membrana.

Patch clamp - 12 L outside-out è molto utile per studiare le correnti di singolo canale date dai recettori-canale, come ad esempio il recettore nicotinico per l acetilcolina

10 Patch clamp - 12 L outside-out è molto utile per studiare le correnti di singolo canale date dai recettori-canale, come ad esempio il recettore nicotinico per l acetilcolina Si possono fare dei probes (biosensori) sensibilissimi per vedere se una cellula secerne una data sostanza. Perché la commercializzazione di questi biosensori è problematica?

11 Patch clamp - 13 La quarta configurazione è l inside out (B), nella quale il patch presenta all esterno dell elettrodo il versante intracellulare della membrana. L inside-out può esere impiegato ad esempio per studiare l inattivazione dei canali voltaggio-dipendenti. Checosasipuòfare? ma la sua principale applicazione è nello studio dei canali chemio-dipendenti attivati per via indiretta dal versante intracellulare, facendo arrivare sul patch ad es. proteine-g, o secondi messaggeri, o protein-chinasi, ecc.. Ad esempio i canali GIRK o i CNGC Outside-out extracellulare recettori canale, attivati dal versante Inside-out canali attivati per via indiretta dal versante intracellulare.. Il sipario sulla scena dei canali chemio-dipendenti (ROC) s è ormai alzato

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