Esperimenti FT-NMR a impulsi
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- Rosalinda Nicolosi
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1 Esperimenti FT-MR a impulsi La RF applicata contiene un intervallo di frequenze centrate alla frequenzza ν 0. La durata dell impulso dipende dall ampiezza dello spettro osservata. Si usano impulsi brevi e di elevata potenza per garantire l eccitazione di tutti i nuclei in quanto si genera una banda larga (di frequenze). Sequenza di impulsi Recupero della magnetizzazione M 0 S ~ nscan PW = ampiezza dell impulso t = tempo di asquisizione = tempo di recupero (delay( delay) d L accumulo di molti FID consente di migliorare il rapporto S/. Il rapporto S/ aumenta proporzionalmente alla radice quadrata del numero di scansioni
2 Esperimenti FT-MR a impulsi Dipendenza della fase del segnale dalla direzione dell impulso Queste sequenze vanno sotto il nome di phase cycling e sono alla base delle moderne tecniche di indagine MR.
3 Esperimenti FT-MR a impulsi Si registra un segnale RF oscillante nel tempo che tende a decadere ere in seguito ai processi di rilassamento (FID). Si registra l intensità del segnale in funzione del tempo!!!! Al fine di ottenere l informazione di frequenza si applica la trasformata di Fourier.
4 Esperimenti MR-2D egli esperimenti bidimensionali, le due dimensioni sono rappresentate entate da due assi che riportano misure di frequenza (chemical( shift); in realtà l intensità del segnale è nella terza dimensione! Si eseguono due e trasformate di Fourier su due domini dei tempi indipendenti e ottenuti da opportune sequenze di impulso. Intensità Prototipo di sequenza per un esperimento 2D; il tempo incrementale t (µs)) e il tempo di acquisizione t 2 (s) sono trasformati (FT) nei valori di frequenza ν e ν 2 delle due dimensioni. ν x ν A ν ν x ν A ν 2
5 Esperimenti MR-2D Tutte le sequenze bi-dimensionali si basano sullo stesso principio e hanno un formato base che può essere suddiviso in 4 fasi:.preparazione 2.Evoluzione 3.Mixing 4.Detection (Acquisizione del segnale) el periodo di evoluzione si determinano le condizioni per la seconda dimensione in quanto consente l ottenimento di una variazione della magnetizzazione in funzione del tempo.
6 Esperimenti MR-2D Consideriamo la seguente sequenza a due impulsi di 90 applicata ad un sistema con un solo nucleo, es. CHCl 3. Effetto della sequenza a due impulsi sulla magnetizzazione netta. Evoluzione in base al chemical shift L intensità del segnale dipenderà dal fattore sin νt e sarà correlata al tempo di evoluzione
7 Esperimenti MR-2D Analizzando i vari FID ottenuti variando il tempo di evoluzione t, si ottengo una serie di spettri i cui segnali mostrano una intensità che varia nel tempo. el esempio esempio è riportato il risultato relativo al CHCl 3. Si riconosce una modulazione di ampiezza nel tempo. Il segnale inoltre diminuisce di intensità per alti valori di t a causa del rilassamento T 2 *
8 Esperimenti MR-2D La variazione di intensità nel tempo consente di ricavare un secondo FID che è funzione di t. Sottoponendo questo nuovo FID creato artificialmente è possibile ricavare la seconda dimensione f con l informazione di chemical shift. f La notazione f e f 2 segue l ordine derivante dai tempi t e t 2. f 2
9 Esperimenti MR-2D Rappresentazione di uno spettro 2D come contour plot con curve di livello f ν A ν x f 2 ν x ν A
10 -Omonucleare Esperimenti MR-2D Esperimenti di correlazione attraverso i legami: COSY, DQF-COSY, COSY-β, TOCSY, IADEQUATE.. -Eteronucleare HMQC, HSQC, HMBC, HETCOR. Esperimenti di correlazione attraverso lo spazio: effetto OE -Omonucleare OESY (D, 2D), ROESY (D, 2D), EXSY.. -Eteronucleare HOESY.
11 COSY: COrrelation SpectroscopY In questo tipo di tecnica 2D si ritrovano diverse sequenze d impulso che consentono di realizzare esperimenti di diverso tipo (COSY, DQF-COSY, COSY-b,, COSY-90). Da questi esperimenti è possibile ricavare informazioni riguardanti la correlazione relazione di protoni (o nuclei dello stesso tipo) accoppiati tra loro a 2 o 3 legami (accoppiamento scalare). s 3 AcO O A 2 OAc O H AcO O B OAc 2 O O Spettro COSY 500 MHz di un carbopeptide.. I due residui dello zucchero sono contrassegnati con le lettere A e B.. In rosso sopra la diagonale sono evidenziate le correlazioni per lo zucchero A e in nero,, sotto la diagonale, quelle per lo zucchero B
12 COSY: COrrelation SpectroscopY
13 COSY: COrrelation SpectroscopY 6 CH H CH2 HO 8 3 H3C 2 CH3
14 Esperimenti di correlazione attraverso i legami: Eteronucleare In questo tipo di esperimenti è possibile ricavare informazioni di correlazioni tra eteronuclei.. Ad esempio nella correlazione 3 C- H è possibile risalire ai carboni direttamente legati a protoni. Usando particolari sequenze è possibile sibile fare correlazioni a lunga distanza. HETCOR: con rilevazione sul canale del Carbonio HMQC, HSQC, HMBC: con rilevazione sul canale del protone
15 HETCOR: con rilevazione sul canale del Carbonio C6 C7 =CH 2 C8 C4(OH) C3 C5 C2 C
16 HMQC (Heteronuclear( Multiple Quantum Correlation) con rilevazione sul canale del protone CH 2 4 H HO CH 2 8 H 3 C 2 CH 3
17 HMBC (Heteronuclear( Multiple Bond Coherence) ) con rilevazione sul canale del protone. Si osservano correlazioni long range 2 J CH e 3 J CH Il tempo delay \2J puo essere ottimizzato a seconda della J che si desidera trovare. ello spettro HMBC non si osservano le costanti dirette. 6 CH 2 4 H HO CH 2 8 H 3 C 2 CH 3
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19 OESY (uclear( Overhauser Spectroscopy) E una tecnica utile per le analisi strutturali e le determinazioni stereochimiche.. Si sfrutta l interazione dipolare (OE) tra nuclei spazialmente vicini. I picchi di correlazione sono in antifase rispetto alla diagonale H , H , H 3 H , H 4.8, H , H 5
20 OESY (uclear( Overhauser Spectroscopy) scambio Correlazione H3 H7 scambio
21 3 C (ppm( ppm) H(ppm ppm) q q CH q CH q CH CH CH CH CH CH CH , CH q CH CH , CH , 2.30 OH 2.99
22 Spettro H 600 MHz chinina CHIIA OH DMSO DMSO H T,T2 HK H L HQ H T2 H F H S H P H T H T H F H G H L,K H H H S O H R,Q H S H U H T H 3 CO H O HO H G 2 3 H U H R H U 4 5 H
23 COSY (Correlation( Spectroscopy) ) CHIIA H 3 CO HK H L HQ H T2 H O HO H G 2 3 H F H U H R H S H P H T H T H H U 4 5
24 COSY (Correlation( Spectroscopy) ) CHIIA H 3 CO HK H L HQ H T2 H O HO H G 2 3 H F H U H P H T H R H S H U 4 5 H T H
25 OESY (uclear( Overhauser Spectroscopy) ) CHIIA In blu sono indicati i picchi di correlazione in antifase rispetto alla diagonale. ota due picchi di scambio in rosso H 3 CO HK H L HQ H T2 H O HO H G 2 3 H F H U H R H S H P H T H T H H U 4 5
26 H 3 CO HK H L HQ H T2 H O HO H G 2 3 H F H U H R H S H P H T H T H H U 4 5 OESY (uclear( Overhauser Spectroscopy) ) CHIIA
27 OESY (uclear( Overhauser Spectroscopy) ) CHIIA H 3 CO HK H L HQ H T2 H O HO H G 2 3 H F H U H R H S H P H T H T H H U 4 5 Picchi di correlazione in rosso
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