Spettroscopia NMR (Risonanza Magnetica Nucleare)

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1 Spettroscopia NMR (Risonanza Magnetica Nucleare) studia l assorbimento della radiazione a radiofrequenze da parte di molecole quando i loro atomi sono orientati da un campo magnetico applicato. rispetto alle altre tecniche (es. IR, UV), fornisce un maggior numero di informazioni di tipo strutturale utili all identificazione di un composto organico. Dallo spettro NMR di un composto si possono ottenere informazioni qualitative e quantitative. inoltre, conducendo esperimenti sofisticati, è possibile risalire alla conformazione di molecole molto complesse.

2 Rabi Fisica 1944 Purcell Fisica 1952 Bloch Fisica 1952 Ernst Chimica 1991 Wutrich Chimica 2002 Lauterbur Medicina 2003 Mansfield Medicina 2003

3 Spettroscopia NMR (Risonanza Magnetica Nucleare)

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5 Momento angolare di spin Le particelle elementari che compongono gli atomi, come elettroni, protoni e neutroni, hanno alcune proprietà di base: Massa Carica elettrica (protoni ed elettroni) Momento angolare di spin Il momento angolare di spin può essere rappresentato intuitivamente come un movimento di rotazione intorno al proprio asse della massa

6 UN PO DI RIPASSO:????????? Il numero quantico principale n definisce il livello di energia dell'elettrone e la dimensione degli orbitali. Può assumere valori interi positivi: n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 Il numero quantico secondario l stablisce il numero dei sottolivelli in cui si differenzia ciascun livello. Ogni sottolivello raggruppa orbitali della stessa forma definita dal valore di l compreso tra 0 e (n 1). Ogni sottolivello corrispondente a ciascun valore di l viene indicato con una lettera minuscola secondo il seguente schema: valore di l= simbolo s p d f g Si parla quindi di orbitali di tipo s, orbitali di tipo p, orbitali di tipo d ecc. Il numero quantico magnetico m. Determina il numero di orbitali appartenenti a ciascun sottolivello e il loro orientamento nello spazio. Gli orbitali di uno stesso sottolivello sono isoenergetici (degeneri); m può assumere tutti i valori interi da -l a +l, compreso lo zero. Per esempio, per l = 1, m = -1, 0, +1, ossia al sottolivello p appartengono tre orbitali degeneri orientati secondo gli assi cartesiani: px, py, pz. Il numero quantico di spin, ms è legato al senso della rotazione, orario o antiorario, dell'elettrone attorno al proprio asse. Esso può assumere valore +1/2 e -1/2. Ogni orbitale può contenere al massimo due elettroni (doppietto elettronico) con spin opposto.

7 Proprietà magnetiche dei nuclei I nuclei che posseggono una massa dispari o una carica dispari o entrambe si comportano come se fossero in rotazione (spin) attorno all asse nucleare. Essi posseggono un momento angolare di spin quantizzato P

8 Proprietà magnetiche dei nuclei Il momento magnetico m è proporzionale al momento di spin m = g P La costante di proporzionalità tra il momento magnetico m ed il momento angolare nucleare P è detta rapporto giromagnetico (g) Nella visione classica, un nucleo ruotando intorno al proprio asse (moto di spin) genera un campo magentico microscopico ed è equivalente ad una barretta magnetica il cui asse cocnide con l asse di rotazione. Si parla cioè di dipolo magnetico nucleare

9 Momento magnetico Il momento magnetico (chiamato anche momento di dipolo magnetico e indicato dalla lettera greca μ) è un vettore che caratterizza le proprietà magnetiche di un corpo: in una barra magnetica, per esempio, il verso del momento magnetico è diretto dal polo sud al polo nord della barra. m

10 Momento magnetico Il modulo del momento magnetico è fisso per ogni nucleo, e non può cambiare in nessun modo. Può cambiare l orientazione che il vettore momento magnetico può assumere nei confronti di una direzione esterna z. Campo magnetico spento Campo magnetico acceso

11 Momento magnetico Il modulo del momento magnetico è fisso per ogni nucleo, e non può cambiare in nessun modo. Può cambiare l orientazione che il vettore momento magnetico può assumere nei confronti di una direzione esterna z.

12 Numero quantico di spin Questa orientazione è quantizzata, ed il vettore momento magnetico può assumere solo 2I+1 orientazioni, dove il numero quantico di spin I è una costante fisica per ogni nucleo Elemento 1 H 2 H 12 C 13 C 14 N 16 O 17 O N massa N carica Numero quantico di spin ( I ) 1/ / /2 Numero di massa pari e numero di carica pari I=0

13 Numero quantico di spin Questa orientazione è quantizzata, ed il vettore momento magnetico può assumere solo 2I+1 orientazioni, dove il numero quantico di spin I è una costante fisica per ogni nucleo Elemento 1 H 2 H 12 C 13 C 14 N 16 O 17 O N massa N carica Numero quantico di spin ( I ) 1/ / /2 Numero di massa pari e numero di carica dispari I intero

14 Numero quantico di spin Questa orientazione è quantizzata, ed il vettore momento magnetico può assumere solo 2I+1 orientazioni, dove il numero quantico di spin I è una costante fisica per ogni nucleo Elemento 1 H 2 H 12 C 13 C 14 N 16 O 17 O N massa N carica Numero quantico di spin ( I ) 1/ / /2 Numero di massa dispari I semiintero

15 A ogni numero quantico di spin sono associati degli stati di spin -I<m<+I (Δm=±1)

16 A ogni numero quantico di spin sono associati degli stati di spin -I<m<+I (Δm=±1) m=-1 m=0 m=1

17 La Spettroscopia NMR si basa sul fatto che i nuclei atomici possono essere orientati in un campo magnetico* (B 0 ) e assorbire una radiazione a radiofrequenze ad una determinata frequenza. Fenomeno di Risonanza Magnetica B 0 DE hn=de La transizione avverra quando hn= DE, e comportera un assorbimento di energia Radiazione spenta Processi di Rilassamento Magnetico * Lo spazio entro il quale un magnete esercita la sua azione prende il nome di Campo magnetico

18 I=1/2

19 I=1/2 In presenza di campo magnetico In assenza di campo magnetico 2I+1=2*1/2+1=2

20 Precessione del Momento Magnetico Nucleare B 0 I=1/2 In presenza di campo magnetico La frequenza di precessione è chiamata frequenza di Larmor n=(g/2p)b 0

21 Quantizzazione dell Energia

22 Popolazione dei livelli energetici b DE 1 DE 2 B 0 a

23 Popolazione dei livelli energetici b DE 1 DE 2 B 0 a

24 Popolazione dei livelli energetici b DE 1 DE 2 B 0 a Poiché i due stati di spin hanno energia diversa, è quindi possibile indurre il passaggio da uno stato all altro mediante un quanto di radiazione elettromagnetica di frequenza n DE h g B h g 2p 0 B 0

25 LA SENSIBILITA Principale problema della spettroscopia NMR Distribuzione di Boltzmann N N b a e DE kt 1 DE kt N b 0 N a g B 1 kt

26 LA SENSIBILITA Principale problema della spettroscopia NMR N N b a Distribuzione di Boltzmann e DE kt DE 1 kt N b 0 N a g B 1 kt hn hn hn hn hn b a a b b b b a a a b a b b a a a b b a b a a b b a a hn hn hn hn

27 LA SENSIBILITA Principale problema della spettroscopia NMR Distribuzione di Boltzmann N N b a e DE kt 1 DE kt N b 0 N a g B 1 kt

28 LA SENSIBILITA Principale problema della spettroscopia NMR Distribuzione di Boltzmann N N b a e DE kt 1 DE kt N b 0 N a g B 1 kt La sensibilità di un esperimento NMR aumenta: all aumentare del campo applicato; all aumentare del rapporto giromagnetico DE g B 0

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30 PRINCIPI BASILARI DI UN ESPERIMENTO NMR Come si induce una transizione tra differenti livelli energetici? Nell NMR cio viene realizzato attraverso l irradiazione del nucleo con una radiazione a radiofrequenze (r.f) la cui componente magnetica possa interagire con i dipoli nucleari. La transizione avrà luogo quando hn= DE; ciò comporterà un assorbimento di energia. In pratica la frequenza n della radiazione a r.f. dovra essere uguale alla frequenza di Larmor (ogni transizione comporta un cambiamento di spin) Secondo le regole di selezione, saranno permesse solo le transizioni in cui il numero quantico m vari di 1: Dm = 1

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32 Spettrometro NMR 900 MHz (21.2 T)

33 Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT) Il campione viene eccitato mediante pulsi di RF di durata molto breve (ms). Il segnale rivelato dallo spettrometro è quello rilasciato dai nuclei durante la fase di rilassamento (ritorno all equilibrio). FID F ( n ) f ( t)exp( i2pnt) dt Freq. Larmor

34 Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT) Vi sono persone in grado di riconoscere le singole note nel caso di piu' note suonate contemporaneamente, anche se questo processo diventa piu' difficile all'aumentare delle note Provate a suonare più note simultaneamente. Riuscireste a dire quali frequenze sono state suonate? La trasformata di Fourier puo' farlo! Cambiate ora le ampiezze relative delle note. Riuscireste a determinare le intensita' relative delle note con il vostro orecchio? La trasformata di Fourier puo' farlo! L'operazione effettuata dalla trasformata di Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che ascolta un insieme di toni (segnale nel dominio del tempo) e ne determina le note (contenuto in frequenza). La trasformata inversa di Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che vede le note (frequenze) sullo spartito musicale e le converte in toni (segnali nel domino del tempo).

35 Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT) Vi sono persone in grado di riconoscere le singole note nel caso di piu' note suonate contemporaneamente, anche se questo processo diventa piu' difficile all'aumentare delle note Provate a suonare più note simultaneamente. Riuscireste a dire quali frequenze sono state suonate? La trasformata di Fourier puo' farlo! Cambiate ora le ampiezze relative delle note. Riuscireste a determinare le intensita' relative delle note con il vostro orecchio? La trasformata di Fourier puo' farlo! L'operazione effettuata dalla trasformata di Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che ascolta un insieme di toni (segnale nel dominio del tempo) e ne determina le note (contenuto in frequenza). La trasformata inversa di Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che vede le note (frequenze) sullo spartito musicale e le converte in toni (segnali nel domino del tempo).

36 Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)

37 Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)

38 Se tutti i nuclei dello stesso tipo di una molecola precedono alla stessa frequenza di risonanza quanti segnali ci aspettiamo di trovare nel corrispondente spettro NMR? Es. Quanti segnali ci aspettiamo dallo spettro 1 H-NMR dell etanolo (CH 3 -CH 2 -OH)?

39 LO SPOSTAMENTO CHIMICO (CHEMICAL SHIFT) Nonostante tutti i nuclei di una certo tipo (per esempio 1 H) siano esattamente identici, essi risuonano a frequenze leggermente diverse purché si trovino in intorni chimici differenti. Sotto l influenza del campo magnetico esterno gli elettroni tendono ad assumere un movimento rotatorio, e ruotando generano essi stessi un campo magnetico. Il campo magnetico generato si oppone al campo magnetico esterno Pertanto, il nucleo sarà sottoposto ad un campo magnetico effettivo minore di quello applicato, è cioè schermato dagli elettroni.

40 SCHERMAGGIO CAMPO MAGNETICO EFFETTIVO B eff =B 0 (1-s) s= costante di schermo che dipende dalla struttura elettronica in prossimità del nucleo in esame FREQUENZA DI LARMOR EFFETTIVA n eff =n 0 (1-s)

41 LO SPOSTAMENTO CHIMICO

42 LO SPOSTAMENTO CHIMICO La posizione del centro del segnale NMR è chiamata spostamento chimico (chemical shift, d) e viene espressa in ppm: d ( n campione n n spettrometro riferimento ) 6 *10 riferimento=tetrametilsilano (TMS) Si(CH 3 ) 4

43 n=g/2pb 0

44 CHEMICAL SHIFT PROTONICO Cl Elemento elettronegativo d- d C H d- d Il principale fattore che determina il chemical shift di un protone è la densità elettronica del relativo idrogeno. Composto CH 3 X Elemento X Elettronegatività of X Chemical shift d CH 3 F CH 3 OH CH 3 Cl CH 3 Br CH 3 I CH 4 (CH 3 ) 4 Si F O Cl Br I H Si Più deschermati TMS

45 CHEMICAL SHIFT PROTONICO idrogeni alifatici primari, secondari e terziari risuonano a valori di ppp via via più alti. L elettronegatività del carbonio è bassa per cui tutti e tre i tipi d idrogeno si trovano al di sotto dei 2 ppm

46 CHEMICAL SHIFT PROTONICO Come nel caso delle spettroscopie di assorbimento anche per l NMR è possibile formulare alcune regole di additività che permettono di prevedere, con ragionevole approssimazione, il chemical shift dei vari nuclei. Per quanto riguarda la spettroscopia protonica il calcolo è ristretto a 1) derivati metilenici derivati metilenici 2) derivati etilenici. REGOLE DI SHOOLERY PER I DERIVATI METILENICI Serve per calcolare il chemical shift di derivati del tipo X-CH2-Y. Si parte dal c.s. del metano ( ppm) e si addizionano i contributi tabulati per i vari sostituenti: d=0.233+somma(contributi) -C c c -C-C C C 0.006

47 ANISOTROPIA DI CHEMICAL SHIFT I protoni olefinici (legati a carboni sp 2 ) hanno chemical shifts molto più alti dei protoni legati a carboni sp 3, con valori tipici di d 5-6 ppm. Ciò è dovuto alla nuvola elettronica p che può generare campi magnetici relativamente intensi. I protoni sono deschermati B O H H H C=C H Linee di forza del campo magnetico indotto

48 CORRENTE DI ANELLO NEL BENZENE elettroni p H H DeschermatI B 0 Linee di forza del campo magnetico indotto dagli elettroni p

49 Riassumendo.

50 Riassumendo.

51 aumenta d aumenta lo schermaggio

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53 INTEGRAZIONE L intensità di un segnale nello spettro NMR protonico è proporzionale al numero di protoni che lo genera.

54 CH 3 OH metanolo

55 CH 3 OH metanolo 3 1

56 CH 3 CH 2 OH etanolo 1 H-NMR

57 CH 3 CH 2 OH etanolo 1 H-NMR

58 Es. HO-CH 2 -

59 Es HO-CH 3

60 CH 3 CH 2 OH OH il protone dell OH è ancora meno schermato. Qui scambia rapidamente con le altre molecole ed è quindi disaccoppiato dagli altri nuclei CH 2 I protoni del metilene sono meno schermati di quelli del metile (d più grande). Quartetto 1:3:3:1 per accoppiamento con il CH 3 CH 3 Tripletto 1:2:1 per accoppiamento con il CH 2 Integrali dei multipletti. Sono proporzionali al numero di nuclei che contribuiscono al multipletto.

61 CH 3 CH 2 OH

62 STRUTTURA FINE & ACCOPPIAMENTO SCALARE (SPIN-SPIN) deriva dall interazione magnetica tra i nuclei presenti nella molecola e viene trasmesso attraverso la polarizzazione degli elettroni di legame un gruppo di N nuclei magneticamente equivalenti scompone il segnale NMR di un nucleo o un gruppo di nuclei non magneticamente ai primi in 2NI+1 componenti. nuclei magneticamente equivalenti stesso chemical shift e stesso accoppiamento con altri gruppi di nuclei nella stessa molecola.

63 3 nuclei A equivalenti 2 nuclei B equivalenti n A, n B frequenze di risonanza NMR Se tra i due gruppi di nuclei non ci fosse accoppiamento... n A n B Ma se c è accoppiamento, i nuclei A risentono della situazione dei nuclei B, e viceversa. In tal caso ogni riga dovuta ad un gruppo di nuclei equivalenti si separa (splitting) in un numero di righe corrispondente ai diversi stati di spin del gruppo vicino.

64 3 nuclei A equivalenti 2 nuclei B equivalenti J = 0 Gli integrali dei due multipletti stanno nello stesso rapporto del numero di protoni equivalenti corrispondenti n A n B 3 : 2 J J J J J J Tripletto di righe Quartetto di righe

65 Accoppiamenti uguali con nuclei vicini

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67 J(Hz) costante di accoppiamento scalare Poiché l accoppiamento spin-spin è dovuto alle interazioni tra i momenti magnetici nucleari, che sono indipendenti dal campo magnetico applicato B0, le costanti di accoppiamento J sono indipendenti dal campo magnetico applicato e risultano uguali in qualunque spettrometro. Il valore di J decresce con l aumentare del numero di legami tra i nuclei accoppiati

68 Functional Group J HH (Hz) a,a: 8-14 a,e: 0-7 e,e: 0 5 cis: 6-12 trans: 4-8

69 TRIANGOLO DI PASCAL Le intensità relative dei segnali di un multipletto generato dalla vicinanza di N nuclei a spin ½ possono essere previste sulla base dei valori numerici del TRIANGOLO DI PASCAL numero di H Numero e intensità delle righe ecc.

70 I=1/2 Triangolo di Pascal

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73 Se due nuclei (o gruppi di nuclei) non chimicamente equivalenti accoppiano con il medesimo nucleo (o gruppo di nuclei), l effetto dei nuclei va considerato separatamente. esempio CH 3 CH 2 CH 2 CH 2.

74 Accoppiamenti diversi con nuclei vicini

75 spettro del primo ordine le differenze in chemical shift sono maggiori della costante di accoppiamento (d»j), e l identificazione dei nuclei magneticamente equivalenti e di facile risoluzione. Molteplicità 2nI+1 Triangolo di Pascal se I=1/2 Segnali equidistanti

76 spettro di ordine superiore le differenze in chemical shift sono comparabili con le costanti di accoppiamento (d J) e l attribuzione dei segnali risulta più complicata. In tal caso bisogna ricorrere all'analisi quanto meccanica dello spettro.

77 CH 3

78 CH 3

79 13 C-NMR 2,2-DIMETILBUTANO

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81 STRUTTURA FINE DEGLI SPETTRI 13 C-NMR Accoppiamento 1 J CH Dominante negli spettri NMR del 13 C

82 Spettro 13 C Accoppiato

83 Spettro 13 C Accoppiato Spettro 13 C Disaccoppiato

84 I TEMPI DI RILASSAMENTO T 1 E T 2 L energia assorbita dai nuclei sottoposti alla risonanza magnetica viene dissipata mediante processi di rilassamento magnetico nucleare, che regolano il ritorno all equilibrio della magnetizzazione. Questi processi sono chiamati Rilassamento spin-reticolo (che comporta uno scambio di energia tra il nucleo e l ambiente circostante) Rilassamento spin-spin (che comporta uno scambio diretto di energia elettromagnetica tra gli spin nucleari) I due processi sono rispettivamente regolati da due constanti di tempo T 1 e T 2 il cui valori dipendono dalla struttura molecolare del campione e dal suo stato di aggregazione (solido, liquido)

85 NMR in biologia Nei campioni biologici ha permesso l identificazione di composti di rilevanza farmacologica-tossicologica (es. ricerca di un farmaco, pesticidi, droghe d abuso, veleni). Attraverso l identificazione di biomarcatori in patologie oncologiche è possibile diagnosticare alcune forme di cancro. Informazioni sulla possibilità di molecole di piccole dimensioni di legarsi ad un recettore proteico alterandone la funzionalità. La risonanza magnetica nucleare viene utilizzata per determinare la struttura di macromolecole

86 NMR di biomolecole Etanolo Problema: Come si fa ad assegnare tutti i segnali di uno spettro NMR di una proteina?

87 SPETTROSCOPIA NMR BI-DIMENSIONALE 2D-NMR

88 Etil crotonato

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91 glicina isoleucina valina

92 glicina isoleucina valina val leu

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94 Spettro NMR di una Miscela di aminoacidi??? Esempio: Estratto acquoso di Bottarga (amino acidi, nucleotidi, ac.organici, )

95 HETeronuclear CORrelation(COSY 1 H- 13 C) HETCOR HETCOR non è altro che la versione eteronucleare dell esperimento di correlazione COSY. La tecnica Hetcor correla gli shifts del 13 C con quelli dell 1 H attraverso l accoppiamento tramite un legame. Gli shifts dei carboni e degli idrogeni che sono legati l uno all altro sono letti come segnali fuori diagonale. Tale tecnica permette di misurare gli shifts dei due nuclei in un solo esperimento, e allo stesso tempo permette di stabilirne la connettivita.

96 HETeronuclear CORrelation(COSY 1 H- 13 C)

97 J-resolved Spectra