SCELTA DEI TEST EZIOLOGICI A SUPPORTO DELLA DIAGNOSI DI LEISHMANIOSI CANINA
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- Lelia Grilli
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1 SCELTA DEI TEST EZIOLOGICI A SUPPORTO DELLA DIAGNOSI DI LEISHMANIOSI CANINA Saverio Paltrinieri, DVM, PhD, Dipl ECVCP DIAGNOSI EZIOLOGICA DIRETTA (evidenziazione del parassita o di sue componenti) Citologia Istologia (immunoistochimica) Isolamento Xenodiagnosi PCR INDIRETTA (evidenziazione degli anticorpi) ELISA Agglutinazione al latice Immunocromatografia Immunofluorescenza Western Blotting Bari, 12 Novembre
2 CARATTERISTICHE DEI TESTS PATOLOGICI NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) totale Test + veri positivi (VP) falsi positivi (FP) VP + FP Test - falsi negativi (FN) veri negativi (VN) VN + FN totale VP + FN FP + VN TOTALE SPECIFICITA' = VN/(VN+FP) SENSIBILITA' = VP/(VP+FN) ACCURATEZZA = (VP+VN)/TOTALE VALORE PREDITTIVO POSITIVO = VP/(VP+FP) VALORE PREDITTIVO NEGATIVO = VN/(VN+FN) CARATTERISTICHE DEI TESTS SENS = 90% SPEC = 80% PREV 30% PREV 1% Test + PATOLOGICI veri positivi (VP) NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) falsi positivi (FP) totale VP + FP Test - falsi negativi (FN) veri negativi (VN) VN + FN totale VP + FN FP + VN TOTALE SPECIFICITA' = VN/(VN+FP) SENSIBILITA' = VP/(VP+FN) ACCURATEZZA = (VP+VN)/TOTALE VALORE PREDITTIVO POSITIVO = VP/(VP+FP) VALORE PREDITTIVO NEGATIVO = VN/(VN+FN) Test + Test - totale PATOLOGICI NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) totale totale Test + Test - PATOLOGICI 9 1 NON PATOLOGICI (ALTRE PATOLOGIE) totale PPV = 270/410 = 0.66 (66%) NPV = 560/590 = 0.95 (95%) PPV = 9/207 = (4.3%) NPV = 792/793 = (99.9%) Bari, 12 Novembre
3 CARATTERISTICHE DEI TESTS RAPPORTO DI VEROSIMIGLIANZA (sens/1-spec) O LIKELIHOOD RATIO (LR+): Quanto è verosimile che il soggetto con un determinato valore abbia una determinata patologia USANDO UN TEST CON LR+ PARI A X, IN CASO DI RISULTATO POSITIVO LA PROBABILITA CHE IL PAZIENTE ABBIA LA MALATTIA IN ESAME E X VOLTE PIU ALTA RISPETTO ALLA PROBABILITA CHE IL PAZIENTE NON ABBIA LA MALATTIA IN ESAME UTILE PER CALCOLARE LA PROBABILITA DI MALATTIA POST- TEST (in caso di risultato positivo) SULLA BASE DELLA PROBABILITA PRE-TEST CARATTERISTICHE DEI TESTS Sens 94% Spec 80% LR % 50% 90% 90% 98% 50% 80% 5% 18% Bari, 12 Novembre
4 CARATTERISTICHE DEI TESTS Sens 80% Spec 20% LR + 1,0 50% 50% DIAGNOSI EZIOLOGICA DIRETTA (evidenziazione del parassita o di sue componenti) Citologia Istologia (immunoistochimica) Isolamento Xenodiagnosi PCR INDIRETTA (evidenziazione degli anticorpi) ELISA Agglutinazione al latice Immunocromatografia Immunofluorescenza Western Blotting Bari, 12 Novembre
5 SIEROLOGIA - metodi Principio di base SIEROLOGIA - metodi Immunofluorescenza ELISA Patogeno intero su vetrino (promastigote) Reazione rilevata da un anticorpo fluorescente Singoli antigeni su piastra Reazione rilevata da un anticorpo legato a un enzima Bari, 12 Novembre
6 SIEROLOGIA - metodi Immunofluorescenza ELISA Più sensibile (meno falsi negativi)? Meno sensibile (più falsi negativi)? Superabile con antigeni «multipli» SIEROLOGIA - metodi Immunofluorescenza ELISA positivo negativo Lettura al microscopio: Più soggettiva Molte variabili operatore-dipendenti Lettura automatizzata: Più oggettiva Meno variabili operatore-dipendenti POSITIVO = 2-4 volte la soglia del laboratorio Bari, 12 Novembre
7 SIEROLOGIA - metodi Immunocromatografia (test rapidi) Aggiunta campione e migrazione Risultato POSITIVO Risultato NEGATIVO SIEROLOGIA limiti analitici ELISA Immunofluorescenza - Possibili falsi positivi - Cross reattività con altri flagellati (rara-assente in Italia) - Errori tecnici - «rumore di fondo dei kit (ELISA) - Possibili falsi negativi (+ frequenti) - Titolo anticorpale non rilevabile (fase iniziale 6-7 mesi/anni) per: - Bassa quantità di anticorpi - Poca sensibilità analitica del test - Lesioni localizzate (uomo) - Errori tecnici Bari, 12 Novembre
8 SIEROLOGIA limiti analitici Immunocromatografia (test rapidi) - Possibili problemi legati a fluidità del campione - Titolo? - Però è rapido. test di screening? Screening di popolazioni con BASSA prevalenza/probabilità: PPV basso Screening di popolazioni con ALTA prevalenza/probabilità: PPV alta CONTROLLARE I POSITIVI CON ALTRI METODI Preferibili test sensibili a test specifici VEROSIMILMENTE I POSITIVI SONO VERI POSITIVI Preferibili test specifici a test sensibili SIEROLOGIA limiti analitici Immunocromatografia (test rapidi) - Vantaggio: antigeni particolari? Anticorpi anti-kinesine (proteine prodotte da leishmanie in replicazione) Secrete rapidamente dopo infezione Non presenti in animali vaccinati con antigeni «secreti/escreti» Bari, 12 Novembre
9 SIEROLOGIA limiti analitici Immunocromatografia (test rapidi) - Vantaggio: antigeni particolari? Spec: 100% / Sens 98% Spec: 100% / Sens 63% SIEROLOGIA limiti «biologici» Primo contatto con l'antigene Quantità di anticorpi IgM IgG Settimane Successivi contatti con l'antigene Il test indica solo che sono stati prodotti anticorpi Quantità di anticorpi Settimane IgM IgG Bari, 12 Novembre
10 SIEROLOGIA limiti «biologici» Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo positività PCR midollare Titolo anticorpale Mesi La produzione di anticorpi richiede del tempo (2-22 mesi, mediana = 5 mesi) L entità del titolo può indicare infezione «attiva» DIAGNOSI EZIOLOGICA DIRETTA (evidenziazione del parassita o di sue componenti) Citologia Istologia (immunoistochimica) Isolamento Xenodiagnosi PCR INDIRETTA (evidenziazione degli anticorpi) ELISA Agglutinazione al latice Immunocromatografia Immunofluorescenza Western Blotting Bari, 12 Novembre
11 XENODIAGNOSI - COLTURA Gold standard Laborioso e non utilizzabile nella pratica Foto: Dr. Luigi Gradoni Foto: Dr. Luigi Gradoni XENODIAGNOSI - COLTURA Gold standard Laborioso e non utilizzabile nella pratica Foto: Dr. Luigi Gradoni Foto: Dr. Luigi Gradoni Bari, 12 Novembre
12 CITOLOGIA Rapida da eseguire CITOLOGIA Specificità del 100%, soprattutto in presenza di reperti indicativi di infezione «attiva» Bari, 12 Novembre
13 CITOLOGIA Sensibilità? MIDOLLO >50% MIDOLLO + LINFONODO >80% LINFONODO>30% MILZA >30% SANGUE n.d. (bassa) CUTE (lesioni) >50% ISTOLOGIA Specificità 100% Sensibilità n.d. ma presumibilmente elevata Foto: Dr. Chiara Giudice Bari, 12 Novembre
14 IMMUNOISTOCHIMICA Specificità 100% Sensibilità n.d. ma presumibilmente elevata Limiti: tempo di processazione Foto: Prof. Eugenio Scanziani, MAPLab di Fondazione Filarete Dr. Raffaella Bergottini Helab - Milano PCR - METODI PCR tradizionale E E E E E E E Bari, 12 Novembre
15 PCR - METODI PCR «nested» E E E E PCR - METODI Bari, 12 Novembre
16 PCR - METODI PCR quantitativa E E E Informazione sul numero di copie di DNA presenti nel campione PCR - RESA DIAGNOSTICA PCR tradizionale - nested 1 LINFONODO Alta Sens e Spec Facile esecuzione MIDOLLO OSSEO Alta Sens e Spec Prelievo più complesso 2 SANGUE (BUFFY COAT) Spec, poco Sens SANGUE INTERO Poco Spec poco Sens 3 MILZA Sensibilità dell 86% in sintomatici CONGIUNTIVA Sensibilità 92% Specificità 100% Positivo a 45 gg. p.i. CUTE? Bari, 12 Novembre
17 PCR - RESA DIAGNOSTICA PCR quantitativa PCR - RESA DIAGNOSTICA PCR quantitativa Bari, 12 Novembre
18 Sierologia e PCR - INTERPRETAZIONE Sierologia e PCR - INTERPRETAZIONE Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo La «colonizzazione» dei tessuti avviene in tempi variabili? positività PCR midollare Mesi Il 50% dei cani infetti nel giro di qualche mese risulta negativo a PCR su midollo Bari, 12 Novembre
19 APPROCCIO DIAGNOSTICO 1 DATI ANAMNESTICI (esposizione al flebotomo) 2 REPERTI CLINICI COMPATIBILI (sistemici, cutanei, oculari, ecc..) 3 RILIEVO REPERTI DI LABORATORIO COMPATIBILI (anemia, inversione rapporto A/G, gammopatia, ins. renale o sindrome nefrosica, ecc ) APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA Citologia? Istologia? Immunoistochimica? PCR? Sierologia? Bari, 12 Novembre
20 APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) Approccio d elezione: citologia Foto: Dr. Fabrizio Ibba APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) Citologia POSITIVA MALATO Bari, 12 Novembre
21 APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) Citologia NEGATIVA ma compatibile Istologia e/o immunoistochimica POSITIVA MALATO APPROCCIO DIAGNOSTICO Citologia NEGATIVA ma compatibile 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CI SONO lesioni campionabili? (linfoadenomegalia, splenomegalia, lesioni cutanee nodulari) PCR o sierologia (vedi oltre) Bari, 12 Novembre
22 APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA NON CI SONO lesioni campionabili? (solo sintomi sistemici, lesioni cutanee non nodulari, ecc..) Citologia midollo POSITIVA MALATO APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA NON CI SONO lesioni campionabili? (solo sintomi sistemici, lesioni cutanee non nodulari, ecc..) Citologia midollo NEGATIVA ma compatibile Vedi sopra (citologia lesioni) Bari, 12 Novembre
23 APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA Bari, 12 Novembre
24 APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo MALATO INFETTO/ESPOSTO positività PCR midollare Titolo anticorpale Mesi APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA? SIEROLOGIA QUANTITATIVA TITOLO ALTO (>4 volte il valore soglia del laboratorio) TITOLO BASSO (<4 volte il valore soglia del laboratorio) MALATO INFETTO/ESPOSTO Bari, 12 Novembre
25 APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA E TITOLO BASSO? PCR SU LESIONE O MIDOLLO Andamento di positività midollare e titoli anticorpali nel tempo INFETTO/ESPOSTO positività PCR midollare Titolo anticorpale Mesi APPROCCIO DIAGNOSTICO 4 CONFERMA DIAGNOSTICA CITOLOGIA (ISTOLOGIA) NEGATIVA E TITOLO BASSO? PCR SU LESIONE O MIDOLLO NEGATIVO POSITIVO ESPOSTO INFETTO Considerare altre diagnosi e monitorare sierologia MALATO se vengono escluse altre diagnosi Bari, 12 Novembre
26 CANI VACCINATI? CANI VACCINATI? (%) T0 1 : : : 80 T21 T42 T100 1 : 40 Negative Figure 3:IFATpositivity(%),Group3. 1 anno Bari, 12 Novembre
27 CANI VACCINATI? (%) T0 T21 T42 T250 T405 1 : : 80 1 : 40 Negative Figure 2:IFATpositivity(%),Group2. 1 anno e seconda annualità CANI VACCINATI? (%) T0 T250 T405 T770 1 : 80 1 : 40 Negative Figure 1:IFATpositivity(%),Group1. 1 anno, 2 anno e terza annualità Bari, 12 Novembre
28 CANI VACCINATI? (Vannucci et al, 2017) CANI VACCINATI? (Vannucci et al, 2017) Bari, 12 Novembre
29 RIASSUMENDO 1 DATI ANAMNESTICI (esposizione al flebotomo) 2 REPERTI CLINICI COMPATIBILI (sistemici, cutanei, oculari, ecc..) 3 RILIEVO REPERTI DI LABORATORIO COMPATIBILI (anemia, inversione rapporto A/G, gammopatia, ins. renale o sindrome nefrosica, ecc ) 4 conferma diagnostica mediante: Citologia/istologiaPOSITIVA (lesioni o midollo) titolo anticorpale ALTO (se citologia/istologia NEGATIVA) PCR POSITIVA se titolo anticorpale BASSO (dopo avere escluso altre diagnosi) LEISHMANIOSI Citologia DELLE LESIONI (incluso il midollo se mancano lesioni evidenti) INDIPENDENTEMENTE dal titolo Negativo Positivo TITOLO ALTO TITOLO BASSO Lesioni cutanee No lesioni cutanee Istologia / immunoisto / PCR Su lesioni cutanee PCR Su midollo / linfonodo MALATO Positivo Negativo Positivo Negativo INFETTO ESPOSTO INFETTO ESPOSTO Bari, 12 Novembre
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