Interferon-alpha ELISA

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1 Istruzioni per l Uso Interferon-alpha ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Interferone-alpha (IFN-alpha) umana nel siero e plasma umani e nei supernatanti di colture cellulari. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 5a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D-5 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE. USO PREVISTO. SOMMARIO. PRINCIPIO DEL TEST 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 4 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 6 0. PROCEDURA DEL TEST 8. CALCOLO DEI RISULTATI. LIMITI DELLA PROCEDURA. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 4. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 5 5. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 6 6. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 7 7. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (7) /8

3 . Uso Previsto L Interferon-alpha ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo dell IFN-α umana. L Interferon-alpha ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche.. Sommario Gli interferoni sono proteine con attività antivirale secrete dalle cellule in risposta a una varietà di stimoli. Nei mammiferi, i geni dell interferone di classe I (IFN-) formano una superfamiglia che consiste in tre famiglie di geni, i geni dell interferone-alfa (IFN-α), dell interferone-beta (IFN-β) e dell interferone-omega (IFN-ω). Nell essere umano, la famiglia INF-α comprende più di 0 geni e pseudogeni che originano 5 diversi prodotti genici funzionali. Le diverse specie di IFN-α umano sono strettamente correlate in termini di sequenze amminoacidiche, con omologie comprese tra l 80 e il 00 %. Il peso molecolare delle specie di IFN-α ricombinante umano è di circa 9 kda, costituito da 66 (65 per l IFN-α) residui amminoacidici privi di N-glicosilazione (α4 ha una N-glicosilazione). I legami disolfuro mediati dalla cistina sono essenziali per l attività biologica dell IFN-α. È stato determinato che la struttura secondaria dell IFN-α è principalmente ad α-elica. Analisi mirate dell IFN-α umano suggeriscono che l unità funzionale sia un monomero. I geni che codificano per tutti gli interferoni noti di classe I sono stati localizzati sul cromosoma 9 e le sequenze di codificazione (cdna) sono state subclonate e caratterizzate. In E. coli è stata raggiunta un elevata espressione degli interferoni, determinando la formazione di una proteina essenzialmente identica a quella naturale. Gli interferoni presentano un elevatissimo numero di effetti biologici. L attività antivirale ha determinato il nome interferone e serve a definire l unità di attività dell interferone. Con la purificazione degli interferoni leucocitari umani naturali (IFN-α), si è riscontrato che tutte le frazioni che mostravano attività antivirale mostravano anche attività antiproliferative. Questa osservazione è stata confermata con interferoni ricombinanti purificati ed estesa ad altre attività come: stimolazione delle attività citotossiche dei linfociti e dei macrofagi, attività dei linfociti natural killer e aumento dell espressione di alcuni antigeni associati ai tumori. Le attività antiproliferative e antitumorali dell interferone hanno portato alla sua applicazione come agente antitumorale. Gli interferoni modulano anche la differenziazione cellulare. Un effetto importante degli interferoni è la modulazione degli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Tutti gli interferoni inducono un aumento dell espressione superficiale degli antigeni MHC di classe I. Anche l espressione dei recettori Fc è stimolata dall interferone. Le alterazioni degli antigeni superficiali possono rappresentare un importante meccanismo con il quale l'interferone può modulare le interazioni cellulari. L interazione degli interferoni con i loro recettori determina gli eventi biochimici e la modulazione delle funzioni cellulari. Si tratta di un processo complesso, analizzato da poco tempo. Il ruolo dell IFN-α come marcatore di malattia e marcatore per gli approcci immunoterapeutici è stato dimostrato per diverse indicazioni e situazioni patologiche: - Durante la fase acuta di un infezione virale, i livelli di IFN-α sono significativamente aumentati nella maggior parte dei pazienti. I livelli di IFN-α si riducono in modo significativo durante il periodo di convalescenza nel momento in cui test di sieroconversione indicano un infezione virale. - Livelli più elevati di IFN-α sono stati riscontrati nella maggior parte dei pazienti affetti da artropatie infiammatorie come poliartrite giovanile, artrite reumatoide, spondilite anchilosante, policondrite, artrite psoriasica, polimialgia reumatica e sclerodermia. Livelli elevati di IFN-α sono stati osservati anche per altri disturbi autoimmuni come il lupus sistemico eritematoso e la vasculite sistemica. - I livelli sierici di IFN-α possono aiutare a differenziare i bambini affetti da dolore addominale a-specifico o adenite mesenterica da quelli affetti da appendicite acuta. - Nella recidiva locale resistente del carcinoma mammario e nella diffusione metastatica, l infiltrazione locale di IFN-α rappresenta un nuovo, interessante, approccio. L interferone somministrato per via intrapleurica determina concentrazioni sieriche misurabili correlate alla degenerazione delle cellule maligne (7) /8

4 . Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-ifn-α umano. Figura Micropozzetto Rivestito L IFN-α umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti e vi viene aggiunto l anticorpo FN-α anti-umano coniugato con l HRP, che si lega alla FN-α umano catturata dal primo anticorpo. Figura Anticorpo di Rivestimento Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato HRP Dopo l incubazione, il IFN-α anti-umano coniugato all HRP e non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura Seconda Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di IFN-α umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IFN-α umano e si determina la concentrazione della IFN-α umano. Figura 4 Substrato post-reazione 5..4 (7) /8

5 4. Reagenti Forniti busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonali anti-ifn-α umano flaconcino (00 µl) con Coniugato-HRP (anticorpi monoclonali anti-ifn-α umano) flaconcini con Standard IFN-α umano liofilizzato, 000 pg/ml dopo ricostituzione flaconcino di Controllo alto, liofilizzato flaconcino di Controllo basso, liofilizzato flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 0x (PBS con %Tween 0 e 0 % BSA) flaconcino (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 0x (PBS con %Tween 0) flaconcino (5 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) flaconcino (5 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico M) Copripiastra adesivi 5. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a -8 C eccetto i controlli. Conservare i controlli liofilizatti a -0 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a -8 C e i controlli a -0 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -0 C, per evitare la perdita di IFN-α umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 4 ore, possono essere conservati a una temperatura tra C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela (7) 4/8

6 7. Materiali necessari ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 0 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 00 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 60 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo ora a.5 C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di.0 %. Lasciare minimo 0 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (7) 5/8

7 9. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i concentrati dei tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i concentrati dei tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 9.. Soluzione Tampone di Lavaggio (x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio concentrato (0x) in un cilindro graduato pulito da 000 ml. Portare il volume finale a 000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra C e 5 C. Il Tampone di Lavaggio (x) è stabile per 0 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrato (0x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (0x) in un cilindro graduato pulito da 00 ml. Portare il volume finale a 00 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperature comprese fra C e 5 C. Il Tampone di Dosaggio (x) è stabile per 0 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (x) secondo la tabella seguente; Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (0x) (ml) Acqua Distillata (ml) Preparazione di Coniugato-HRP Il Coniugato-HRP deve essere utilizzato entro 0 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato-HRP concentrato deve essere diluito :00 con Tampone di Dosaggio (x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (x) (ml) Standard IFN-α Umano Ricostituire lo Standard IFN-α umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 000 pg/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per 0-0 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 0.c.) oppure nei tubi (vedi 9.4.) (7) 6/8

8 9.4.. Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S, S, S, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali : per lo standard nel seguente modo: Pipettare 5 ul di Tampone di Dosaggio (x) a tutti tubi. Pipettare 5 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 000 pg/ml) nel primo tubo, etichettato S, e mescolare (concentrazione dello standard = 500 pg/ml). Pipettare 5 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 5). Il Tampone di Dosaggio (x) serve come bianco. Figura 5 Transferire 5 µl S S S S4 - S7 Standard Ricostituito IFN-α Umana Tampone di Dosaggio (x) 5 µl Buttare 5 µl 9.5. Controlli Ricostituire aggiungendo 00 µl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (0-0 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -0 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento (7) 7/8

9 0. Procedura del Test a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a -8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 0-5 secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 5 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.4.) Aggiungere 00 µl di Tampone di Dosaggio (x) in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 00 µl standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 000 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A e A (vedi Tavola ). Mescolare il contenuto dei pozzetti A e A attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard, S = pg/ml) e trasferire 00 µl, rispettivamente, ai pozzetti B e B (vedere Figura 6). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 7.8 pg/ml. Buttare 00 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G e G) (7) 8/8

10 Figura 6 Transferire 00 µl S S S S4 - S7 Standard Ricostituito IFN-α Umana Tampone di Dosaggio (x) 00 µl Buttare 00 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.4.) pipettare 00 µl di queste diluizioni standard (S S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola. Tavola Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: 4 A Standard (500.0 pg/ml) Standard (500.0 pg/ml) Campione Campione B Standard (50.0 pg/ml) Standard (50.0 pg/ml) Campione Campione C Standard (5.0 pg/ml) Standard (5.0 pg/ml) Campione Campione D Standard 4 (6.5 pg/ml) Standard 4 (6.5 pg/ml) Campione 4 Campione 4 E Standard 5 (. pg/ml) Standard 5 (. pg/ml) Campione 5 Campione 5 F Standard 6 (5.6 pg/ml) Standard 6 (5.6 pg/ml) Campione 6 Campione 6 G Standard 7 (7.8 pg/ml) Standard 7 (7.8 pg/ml) Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione (7) 9/8

11 d. Dispensare 00 µl di Tampone di Dosaggio (x) in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 80 µl di Tampone di Dosaggio (x) in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 0 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Preparare il Coniugato-HRP (vedere la preparazione del Coniugato-HRP 9.) h. Dispensare 50 µl di Coniugato-HRP a ciascun pozzetto. i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (8-5 C) per ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. k. Pipettare 00 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. l. Incubare le strisce a temperatura ambiente (8-5 C) per circa 0 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 60 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di m. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 00 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro ora se le strip sono conservate in un luogo buio a -8 C. n. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (60 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 60 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi (7) 0/8

12 . CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 0 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IFN-α umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di IFN-α umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IFN-α umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulai sono stati diluiti :5 (0 µl campione + 80 µl Tampone di Dosaggio (x)). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (5x). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IFN-α umano. Questi campioni richiedono un ulteriore prediluizione esterna secondo i valori stimati dell IFN-α umano, con Tampone di Dosaggio (x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IFN-α umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IFN-α umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 7 Curva standard rappresentativa per l IFN-α umano ELISA. L IFN-α umano è stato diluito in fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 0.0 Interferon-alpha ELISA DO (450 nm) (pg/ml) 5..4 (7) /8

13 Tavola Dati tipici relativi all uso dell IFN-α umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 60 nm Standard Concentrazione D.O. IFN-α Umana (pg/ml) (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi.. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (7) /8

14 . Caratteristiche di Prestazione.. Sensibilità Il limite di rilevamento dell IFN-α umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più deviazioni standard), è stato determinato di. pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti)... Riproducibilità... Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IFN-α umano. Per ogni micropiastra sono state create curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IFN-α umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola ). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.0 %. Tavola La concentrazione media di IFN-α umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione media di IFN-α umano (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (7) /8

15 ... Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IFN-α umano. Per ogni micropiastra sono state create curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IFN-α umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7. %. Tavola 4 La concentrazione media di IFN-α umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Concentrazione media di Coefficiente di IFN-α Umano (pg/ml) Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di IFN-α umano in un pool di siero umano normale e campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di esperimenti indipendenti, ognuno con 8 replicati. In questi esperimenti il siero non addizionati sono stati usati come bianchi. Il recupero aveva un range dal 85 % al 98 % nei campioni di siero con un recupero medio complessivo del 9 %..4. Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di IFN-α umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 88 % al % con un recupero medio complessivo del 08 % (vedere Tavola 5) Tavola 5 Campione 4 Diluizione :5 :0 :0 :40 :5 :0 :0 :40 :5 :0 :0 :40 :5 :0 :0 :40 Concentrazione Attesa di IFN-α Umano (pg/ml) Concentrazione Misurata di IFN-α Umano (pg/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di IFN-α Umano (%) (7) 4/8

16 .5. Stabilità dei Campioni.5.. Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -0 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di IFN-α umano. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del IFN-α umano..5.. Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero e supernatanti di cultura celulari (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -0 C, -8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 7 C e il livello di IFN-α umano ne è stato determinato dopo 4 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del IFN-α umano..6. Specificità Il saggio evidenzia sia l IFN-α umana naturale che quello ricombinante. La reattività crociata e l interferenza di fattori circolanti del sistema immunitario sono state valutate addizionando queste proteine in concentrazioni fisiologicamente rilevanti ad un siero positivo di IFN-α Umano. L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero IFN-α umano positivo. È stata osservata reattività crociata con gli interferoni leucocitari naturali umani IFN-(IFN-α), IFN-αa, IFN-αb e IFN-αc. Non si è constatata alcuna reattività crociata con IFN-α, IFN-β (Fibroblast IFN-), IFN-γ, IFN-ω, TNFα, TNFβ, IL-, IL-6, IL-8 and IL-0 umani..7. Valori Attesi Per l IFN-α umano è stato testato un pannello di 40 campioni di siero ed EDTA, citrato e plasma eparinato di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). Elevated human IFN-α Umano levels depend on the type of immunological disorder. I livelli misurati possono variare con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di IFN-α umano misurati vedi la Tavola 6. Tavola 6 Matrice di Numero di Campioni Intervallo Media dei Valori % Rilevable Campione Esaminati (pg/ml) Rilevabile (pg/ml) Siero 40 nd* 0 -- Plasma (EDTA) 40 nd* Plasma (Citrato) 40 nd* 0 -- Plasma (Heparina) 40 nd* *nd = non-detectable (non rilevabile), i campioni misurati sotto il punto standard più basso sono stati considerati non rilevabili. 4. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina. IBL@IBL-International.com (7) 5/8

17 5. Sommario: Preparazione dei Reagenti 5.. Soluzione Tampone di Lavaggio (x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 0x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 0x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) Coniugato-HRP Fare una diluizione :00 di Coniugato-HRP nel Tampone di Dosaggio (x): Numero di strisce Acqua Distillata (ml) Coniugato-HRP (ml) Standard IFN-α Umano Reconstituire il Standard liofilizzato di IFN-α umano con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) 5.5. Controlli Agguingere 00 µl di acqua distillata al controlli liofilizzati. Soluzione Tampone di Dosaggio (x) (ml) 5..4 (7) 6/8

18 6. Sommario di Procedura del Test. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto.. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio.. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 00 µl di Tampone di Dosaggio (x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 00 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 00 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 00 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.4..): Pipettare 00 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 00 µl di Tampone di Dosaggio (x), in duplicati, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 80 µl di Tampone di Dosaggio (x)a tutti i pozzetti. 6. Aggiungere 0 µl di campione in duplicato a tutti i pozzetti. 7. Preparare il Coniugato-HRP. 8. Aggiungere 50 µl di Coniugato-HRP a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare ore a temperatura ambiente (8-5 C). 0. Aggiungere 00 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti.. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 0 minuti a temperatura ambiente (8-5 C).. Aggiungere 00 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti.. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di colture cellulari sono stati diluiti :5 (0 µl di campione + 80 µl Tampone di Dosaggio (x)). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (5x) (7) 7/8

19 7. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO. Adolf, G. R.. Antigenic structure of human interferon omega (interferon alpha II): comparison with other human interferons. J.Gen.Virol. 987; 68 (Pt 6): Grau, G. E.; Roux-Lombard, P.; Gysler, C.; Lambert, C.; Lambert, P. H.; Dayer, J. M.; Guillevin, L.. Serum cytokine changes in systemic vasculitis. Immunology 989; 68: Mazuran, R.; Ikic-Sutlic, M.; Jereb, B.; Stabuc, B.; Krasovec, M. U.; Cerar, O.; Soos, E.. Intrapleural application of natural IFN alpha in breast cancer patients with pleural carcinomatosis. Monitoring of immunotherapy by assaying serum interferon levels. J.Biol.Regul.Homeost.Agents 99; 6: Pestka, S.; Langer, J. A.; Zoon, K. C.; Samuel, C. E.. Interferons and their actions. Annu.Rev.Biochem. 987; 56: Henco, K.; Brosius, J.; Fujisawa, A.; Fujisawa, J. I.; Haynes, J. R.; Hochstadt, J.; Kovacic, T.; Pasek, M.; Schambock, A.; Schmid, J.;.. Structural relationship of human interferon alpha genes and pseudogenes. J.Mol Biol. 985; 85: Chia, Y. W.; Carachi, R.; Armstrong, A. A.; McGarry, G. W.; Carrington, D.. Serum alpha interferon in children with right iliac fossa pain. J.R.Soc.Med. 99; 86: Bernier, J.; Reuter, A.; Vrindts-Gevaert, Y.; Franchimont, P.. Radioimmunoassay of leukocyte (alpha) interferon and its application to some clinical conditions. J.Nucl.Med. 984; 5: (7) 8/8