Analisi di Diossine, Furani e PCB nel Settore Ambientale con la GC-MS/MS: 7890A/7000B Roberto Riccio

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1 Analisi di Diossine, Furani e PCB nel Settore Ambientale con la GC-MS/MS: 7890A/7000B Roberto Riccio Agilent Technologies roberto_riccio@agilent.comriccio@agilent com

2 Sommario Obiettivi Diossine, Furani e Dioxin Like PCB Il Sistema di Tossicità Equivalente Determinazione dei Congeneri La Strumentazione Hardware Metodo Sensibilità Riproducibilità Linearità Qualità Software Alcuni Dati Conclusioni

3 Obiettivi Valutare le prestazioni del GC-MS/MSinEIperle analisi delle Diossine e PCB Valutare se la GC-MS/MS può essere usata come metodo di screening sensibile e come un alternativa affidabile a basso costo rispetto alla GC-HRMS Verificare se la GC-MS/MS è in grado di determinare i dl-pcbs e ndl-pcb ai livelli di interesse discussi, nel quadro dell armonizzazione degli MRL (Maximum Residue Limits) per i PCB

4 PolyChlorinated Dibenzo-p-Dioxins (PCDD) e DibenzoFurans (PCDF) PCDD PCDF Le diossine sono un gruppo di inquinanti organici persistenti altamente tossici Non sono prodotte deliberatamente ma nascono come sottoprodotto di incenerimento dei rifiuti, nella produzione di pesticidi e pasta/sbiancamento della carta, cioè si formano come prodotti indesiderati nei processi termici e industriali. L aumento dei livelli nell ambiente avviene in parallelo allo sviluppo del industria del cloro L ottanta percento (80%) dell'esposizione umana proviene da alimenti di origine animale. Le diossine si accumulano nei tessuti grassi di manzo, maiale, pollame e frutti di mare. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2378-TCDD) La Diossina più nota

5 PolyChlorinated Biphenyls (PCBs) Cl y 4' 3' 2' 2 3 Cl-atoms Congeners 5' 6' 6 5 Cl x Produzione industriale dal 1929 (> 1,5 Milioni di tonnellate) Proprietà: - lipofili - bassa infiammabilità - stabilità chimica e fisica - limitata degradazione biologica Nomi commerciali: Clophen, Arochlor, Kanechlor, Phenochlor, Fenchlor, Pyralen Total 209 Dioxin Like (dl) PCBs: In base alla loro rotazione libera lungo l asse, i PCB non-orto e mono-orto sostituiti, possono adottare una struttura tt spaziale simile il alla 2,3,7,8-TCDD e perciò esibiscono effetti tossici comparabili alle diossine ortho-position

6 PolyChlorinated Biphenyls Dioxin Like PCB Non-orto PCB 77, 81, 126, 169 PCB Mono-orto PCB 105, 114, 118, 123, 156, 157, 167, 189 PCBs Indicatori NON (Dioxin Like) PCB 28, 52, 101, (118), 138, 153, 180 La concentrazione dei dl-pcb (specialmente dei non-ortho PCB) negli alimenti è generalmente 1-2 ordini di grandezza minore dei PCB Indicatori

7 Il Sistema di Tossicità Equivalente (TEQ) Il valore TEQ rappresenta la concentrazione totale di PCDD/PCDF e PCB Dioxin Like di un campione considerando la tossicità individuale delle singole diossine e furani sostituite (17) e dei singoli dlpcb (12): il TEQ pesa la tossicità dei composti meno tossici come frazioni della tossicità della diossina più tossica 2,3,7,8-TCDD. Ad ogni composto è attribuito un Fattore di Tossicità Equivalente TEF che indica il grado di tossicità comparato alla 2,3,7,8-TCDD, il cui valore di riferimento è pari ad 1 (la più tossica). Per calcolare la TEQ di una miscela di PCDD/PCDF e PCB Dioxin Like la quantità di ogni congenere è moltiplicata per il suo TEF e poi sommata TEQ = Σ (concentrazione congenere * TEF congenere) Il TEQ si riferisce solo agli effetti nocivi (ad esempio il cancro) e di interazione con i recettori cellulari Ah. Gli altri effetti tossici delle diossine e composti Dioxin Like non sono quantificati con questo metodo. I valori di TEF sono diversi per le diverse specie animali e grazie ad una maggiore conoscenza sono aggiornati di continuo.

8 Calcolo del TEQ - World Health Organization Compound Result WHO-TEFs Single TEQ Tetra-CDD 0,31 1 0, Penta-CDD 0,64 1 0, Hexa-CDD 0,16 0,1 0, Hexa-CDD 0,5 0,1 0, Hexa-CDD 0,33 0,1 0, Hepta-CDD 4,7 0,01 0, Octa-CDD 25 0,0001 0, Tetra-CDF 2,22 0,1 0, Penta-CDF 0,34 0,05 0, Penta-CDF 0,34 0,5 0, Hexa-CDF 0,12 0,1 0, Hexa-CDF 0,07 0,1 0, Hexa-CDF n.d. 0, Hexa-CDF 0,11 0,1 0, Hepta-CDF 0,28 0,01 0, Hepta-CDF n.d. 0, Octa-CDF 1,92 0,0001 0, WHO-TEQ 1,5 Step 1: Moltiplicazione delle singole diossine per il corrispondente TEF Step 2: Somma dei singoli risultati 17 = TEQ Totale

9 Considerazioni sul calcolo del LOQ per il TEQ Nel caso in cui singoli congeneri risultino non quantificabili esistono diverse modalità per calcolare il loro TEQ partendo dal LOQ: Il concetto di upperbound, limite superiore richiede l uso luso del limite di quantificazione per il contributo di ogni congenere non-quantificato al TEQ (CongenereTEQ = LOQ * TEF) Il concetto di lowerbound, limite inferiore richiede l uso dello zero per il contributo di ogni congenere non-quantificato al TEQ. (CongenereTEQ = 0 * TEF) Il concetto di mediumbound, limite medio richiede l uso luso della metà del limite di quantificazione calcolando il contributo di ogni congenere nonquantificato al TEQ (CongenereTEQ = LOQ/2 * TEF)

10 Valori TEF - WHO 1998 / 2005

11 7890A-7000B GC-MS/MS 86 cm 103 cm 86 cm di profondità

12 Sorgente, Inerte, ad alta Temperatura con Extraction Lens Analizzatore Lineare GC-MS/MS Quadrupoli di quarzo monolitici, iperbolici, riscaldati, con rivestimento in oro Detector Triple-Axis Con Iris Lens dinamica e HED Nuova cella di collisione (esapolo) Pompa Turbo Split Flow

13 Sorgente Inerte Materiale Inerte, Solido mono blocco non danneggiabile dalla pulizia Design Stay-Clean (350ºC) si estendono i periodi tra una manutenzione e l altra, anche con campioni sporchi. All aumentare della Temperatura c è un aumento della risposta per molte famiglie di composti Divisione tra i compartimenti della sorgente e dell analizzatore grazie alla pompa a doppio stadio Più robustezza 350 C Miglior risposta per i composti che hanno la tendenza a depositarsi o a interagire con le parti in 325 C metallo Migliore Peak Shape per i composti alto bollenti 300 C Autotune, tutte le migliori impostazioni per i 275 C Parametri necessari al funzionamento dello 230 C Spettrometro sono trovati in modo automatico per essere utilizzati dai Metodi Il Doppio filamento riduce l intervallo della manutenzione P l ti H d b (PAH) Polyaromatic Hydrocarbon (PAH)

14 Quadrupoli di Quarzo Riscaldati Alta temperatura (200ºC) maggiore affidabilità con I campioni i sporchi I metodi MS/MS sono usati generalmente per campioni sporchi ed i benefit dell Alta Temperatura sui quadrupoli sono evidenti Elimina Virtualmente il bisogno di manutenzione sui quadrupoli Tunes e metodi più stabili per un lungo periodo di tempo.

15 Perchè il Quench Gas (He) in Cella di Collisione? La presenza dell Elio metastabile in GC/MS Source He* + Quad Analyzer Collision Cell Precursor Ions In 1.5 ml/min N 2 Collision Gas collision induced dissociation Quad Analyzer Product Ions Out + He* Al detector, l elio metastabile genera rumore dovuto ai neutri. Detector Un elevata popolazione di elio metastabile altamente energetico è prodotto dalle sorgenti EI; l elio metastabile non è carico, ma possiede un energia cinetica che gli permette di attraversare indistrurbato gli analizzatori di massa e la cella di collisione e raggiungere il rivelatore (EM o FM) In GC/MS, il rumore dovuto ai neutri è coperto dal rumore chimico. In GC/MS/MS, il rumore chimico è grandemente ridotto, così che il rumore dei neutri torna ad essere una sorgente critica di rumore.

16 Perchè il Quench Gas (He) in Cella di Collisione? Cosa succede con il Quench Gas Collision Cell 1.5 ml/min N 2 Collision Gas Quad Analyzer Quad Analyzer Source He* + Precursor Ions In collision induced dissociation Product Ions Out + He* Detector He Buffer Gas 2.25 ml/min p He* + He 2 He + calore La quantità di elio metastabile che raggiunge g il detector è fortemente ridotta. Inoltre le geometrie fisiche e le Lenti presenti nel detector Triple-Axis riducono ulteriormente il rumore dei neutri.

17 Perchè il Quench Gas (He) in Cella di Collisione? Helium Quench Gas OFF Stesso Segnale Testato t con Hexachlorobenzene Riduzione del Rumore S/N 341:1 Helium Quench Gas ON S/N 1294:1 Stesso Segnale In MS il rumore dei neutri non è visibile, ma comporta un maggior rumore chimico. La MS/MS elimina il rumore chimico i chemical noise, il rumore dei neutri è visibile e deve essere minimizzato.

18 Alte Performance del Detector Triple-Axis con la nuova Dynamically Ramped Iris Dynamically Ramped Iris Incremento della sensibilità all aumentare del rapporto m/z Massima riduzione del rumore hyperbolic quartz dovuto ai neutri (rumore proveniente dagli ioni secondari) La combinazione i del Quench Gas He ed il design del Triple-Axis Detector contribuiscono ad abbattere il rumore (già presente sulle 5975) Incremento della durata e linearità Elettromoltiplicatore a Triplo Canale Gain Normalization Stabilità dei risultati nel tempo transmission quadrupole analyzer Y ion beam steering rod shield for secondary particles X Offset Z high energy dynode triple channel electron multiplier

19 7890A-7000B GC-MS/MS Configurazione base per le Diossine 2uL cold splitless injection CO 2 Multi Mode Inlet 7000B TQ 60m x 0.25mm ID x 0.25um DB5-MSUI ( UI) MS-Tee Helium 1.0 ml/min Constant flow 7890A Inlet temp program: 100 C (0.05 min) 600 C/min 300 C Oven temp program: 130 C (2 min) 10 C/min 220 C (16 min) 5 C/min 235 (7 min) 5 C/min 350 (0 min) C

20 B GC-MS/MS Configurazione per le Diossine con Pre-Column Back Flush 2uL cold splitless injection CO 2 MMI PCM 60m x 0.25mm ID x 0.25um DB5-MSUI ( UI) 7000B TQ 0.9 ml/min Constant flow 2.0m x 0.25mm ID Uncoated deactivated Fused silica MS-Tee G3186B 1.0 ml/min Constant flow 7890A Inlet temp program: 100 C (0.05 min) 600 C/min 300 C Oven temp program: 130 C (2 min) 10 C/min 220 C (16 min) 5 C/min 235 (7 min) 5 C/min 350 (0 min) C

21 B GC-MS/MS Configurazione per le Diossine con Pre-Column Back Flush MMI PCM 0.9 ml/min Constant flow 1.0 ml/min Constant flow QQQ MS-Tee MMI PCM 15 minuti dopo l iniezione iniezione, la pre-colonna è in Back Flush ad un flusso elevato che porta via tutti i residui non voluti e la matrice, contribuendo a mantenere il sistema Colonna/Spettrometro pulito, mentre la corsa cromatografica continua sulla colonna principale QQQ 5.0 ml/min Constant flow MS-Tee 1.0 ml/min Constant flow

22 PCDD / PCDF GC-QQQ MRM TS Segment Start Time (min.) Peak Number Analyte RT (min.) Pre-cursor 1 Product 1 CE (V) Pre-cursor 2 Product 2 CE (V) C-2378-TCDF TCDF C-1234-TCDD C-2378-TCDD TCDD C PCDF PCDF C PCDF PCDF C PCDD PCDD C HxCDF HxCDF C HxCDF HxCDF C HxCDF HxCDF C HxCDD HxCDD C HxCDD HxCDD C HxCDD HxCDD C HxCDF HxCDF C HpCDF HpCDF C HpCDD HpCDD C HpCDF HpCDF C-OCDD OCDD C-OCDF OCDF

23 PCB GC-QQQ MRM

24 PCDD Nativi e PCDF Isomeri Tetra Penta Hexa Hepta Octa

25 PCB

26 Separazione Cromatografica dell HxCDFs e HxCDDs HxCDF HxCDF HxCDF HxCDD HxCDF HxCDD HxCDD

27 PCDD / PCDF Ottimizzazione Energia di Ionizzazione Experiment 1: ev Experiment 2: ev È stata scelta un energia di ionizzazione di 70 ev per tutti i Time Segment

28 PCB Ottimizzazione Energia di Ionizzazione Experiment 1: ev Experiment 2: ev Un energia di ionizzazione di 78 ev è ottimale per i PCB se acquisiti da soli, altrimenti optare per un energia di ionizzazione di 70 ev se con PCDD/F

29 PCDD / PCDF Determinazione dei Product Ions Diverse Scansioni in Product Ion a diverse Energie di Collisione rivelano che lo ione [M-COCl] + ha sempre la risposta più intensa [M+2] +

30 PCB Determinazione dei Product Ions Diverse Scansioni in Product Ion a diverse Energie di Collisione rivelano che lo ione [M-2Cl] + ha sempre la risposta più intensa

31 PCDD / PCDF Ottimizzazione Energia di Collisione Esperimento 1: V ricerca Esperimento 2: Energie di Collisione mirate

32 PCB Ottimizzazione Energia di Collisione Esperimento 1: V ricerca Esperimento 2: Energie di Collisione mirate

33 PCDD / PCDF Analisi Faster con Post-run Back Flush 2uL cold splitless injection CO 2 MMI PCM 20m x 0.18mm ID x 0.18um DB-5MS ( ) 2.0 psig constant pressure 7000B QQQ 0.9 ml/min Constant flow MS-Tee G3186B 0.65m x 0.15mm ID Uncoated deactivated Fused silica 7890A Inlet temp program: 100 C (0.05 min) 600 C/min 300 C Oven temp program: 100 C (2 min) 10 C/min 120 C (5 min) 5 C/min 300 C (0 min)

34 PCDD / PCDF Analisi Faster con Post-run Back Flush TCDF TCDD PCDF PCDD HxCDF HxCDD HpCDF HpCDD OCDF OCDD Tempo di analisi < 40 minuti

35 PCDD / PCDF Analisi Faster con Post-run Back Flush 13 C TCDD 13 C TCDD EPA 1613B :

36 PCDD / PCDF Analisi Faster con Post-run Back Flush HxCDF HxCDF EC :

37 PCDD / PCDF Nativi - Standard (100 fg in colonna) TCDF TCDD PCDF PCDD HxCDF HxCDD HpCDF HpCDD OCDD 500 fg

38 10 Repliche del livello a 100fg della 2378-TCDD Noise region Media S/N = 10 :1 Area del Picco RSD = 8.3

39 Curva di Calibrazione, 2378-TCDD: 100fg - 10pg in colonna pg/ul 5.0 pg/ul 2ul Iniettati R 2 per curve di tipo Lineare e Media dei Fattori di Risposta, origine inclusa e nessun peso per i punti

40 Curva di Calibrazione Multi Livello (7 punti) con ISTD (Linear Fit, 100fg 10pg in colonna) Analyte R 2 Analyte R TCDD TCDF PCDD PCDF HxCDD PCDF HxCDD HxCDF HxCDD HxCDF HpCDD HxCDF OCDD * HxCDF HpCDF * 500fg 50pg injected HpCDF OCDF

41 PCB Calibrazione Multi Livello (7 punti) con ISTD

42 Criteri di Qualità Criteri per la separazione GC come nel Regolamento (CE) N. 1883/2006. Abbiamo già visto come il metodo più spinto dal punto di vista cromatografico PCDD / PCDF Analisi i Faster con Post-run Back Flush riusciva a rispettare il criterio. Criteri per la MS come nella Commission Decision 2002/657/EC ci basiamo sui punti di identificazione (IP) per i composti non legali/banditi e quanto previsto per la Tolleranza delle Intensità relative. Lo Smoothing e il problema del non Noise nel LOQ

43 Il sistema dei Punti di Identificazione (Identification i Point) Technique Number of Ions Monitored Identification Points GC MS (EI or CI) n n GC MS (EI and CI) 2(EI) + 2(CI) 4 GC MS (2 deriv) 2 (derivative A) + 2 (derivative B) 4 GC MS/MS 1 precursor + 2 products 4 GC MS/MS 2 precursors, each with 1 product 5 GC HRMS n 2n Tabella per la determinazione del numero di ioni necessari alla identificazione dei congeneri nelle diverse tecniche analitiche. Per confermare la presenza di composti tossici è necessario monitorare 4 ionii in GC/MS, ma solo 2 transizioni i i in GC/MS/MS. L uso di un diverso numero di punti nelle varie tecniche analitiche tiene conto delle rispettive specificità e selettività.

44 Tolleranza delle Intensità Relative Target / Qualificatore rel. intensity (% of base peak) GC-MS/EI GC-MS/CI, GC-MS/MS n LC-MS, LC-MS-MS n > 50 % ± 10 % ± 20 % >20%- 50 % ± 15 % ± 25 % > 10 % - 20 % ± 20 % ± 30 % 10 % ± 50 % ± 50 % Una procedura automatica di aggiornamento delle Tolleranze delle Intensità Relative in base alla Relative Response è disponibile nel Software MassHunter

45 Lo Smoothing nei nuovi Sistemi MS/MS Senza Smoothing Con Smoothing Smoothing: ricostruzione dei picchi dal noise alle basse concentrazioni o in metodi di screening spinti con dwell time per transizione i inferiore i ai 20msec

46 Il problema del non Noise nei Moderni Sistemi MS/MS PCB 167 Come calcolare un S/N di 3:1? H 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD

47 Il problema del non Noise nei Moderni Sistemi MS/MS Il rapporto Signal-to-Noise non può essere preso come fattore per la stima del limite di rivelazione LOD. Smoothing e Noise

48 Precisione e rapporto S/N: cosa considerare? In MS/MS è difficile fare una misura significativa del rumore se questo è estremamente basso Un alto rapporto S/N può derivare da mancanza di rumore anche quando il segnale è povero Anche con un rumore ultra basso, il segnale più alto sarà sempre correlato da una migliore precisione nell area dei picchi Per il rapporto degli ioni, il Qualificatore è generalmente meno intenso e meno preciso del Target (Quantificatore) pertanto più a rischio o in considerazione di un rischio calcolato Una bassa precisione aumenta la probabilità di: Errori nella conferma in analisi qualitativi per l identificazione dei composti Scarsi risultati in quantitativa Aiuti?

49 Noise: Baseline Subtract On/Off Deselezione questa casella per non sottrarre la linea di base in automatico (LOQ per il TEQ) Disponibile nel Software MassHunter Acq. GC/MS/MS dalla revisione B.05.01

50 Noise: Baseline Subtract On/Off Senza sottrazione Con sottrazione

51 Calcolo del LOD, LOQ e MDL MDL, LOQ e LOD sono calcolati in automatico dal Software MassHunter fornendo 7 campioni vicino al LOD e determinando la SD e la t-distribution. (the students' t value appropriate for a 99% confidence level and a standard deviation estimate with n-1 degrees of freedom) MDL = SD * t-value LOQ = 10 * SD LOD = 3 * SD 40 CFR 136, EPA MDL Procedure (ANALYTICAL DETECTION LIMIT GUIDANCE & Laboratory Guide for Determining Method Detection Limits - Wisconsin Department of Natural Resources - Laboratory Certification Program - April PUBL-TS )

52 Software: MassHunter MS Workstation Unica piattaforma per tutti i Sistemi Agilent LC/SQ, LC/QQQ, LC/TOF, LC/QTOF GC/QQQ, GC/MSD ICP/MS

53 MassHunter Quant: ISTD e Calcolo del Recupero

54 MassHunter Quant B.04.xx: Compounds at a Glance Totalmente personalizzabile

55 Analisi di Diossine e Furani: 240fg - 100pg in colonna (480fg - 200pg Hepta e Octa, 960fg- 400pg HxDD) Per Gentile Concessione di ph S.r.l. Tavarnelle Val di Pesa (FI)

56 Analisi di Diossine e Furani: 240fg - 100pg in colonna (480fg - 200pg Hepta e Octa, 960fg- 400pg HxDD) Per Gentile Concessione di ph S.r.l. Tavarnelle Val di Pesa (FI)

57 Analisi di Diossine e Furani: 240fg - 100pg in colonna (480fg - 200pg Hepta e Octa, 960fg- 400pg HxDD) Per Gentile Concessione di ph S.r.l. Tavarnelle Val di Pesa (FI)

58 Analisi di PCB no ASB: 10fg - 20pg in colonna (ASB = Automatically Subtract Baseline)

59 Analisi di PCB no ASB: 10fg - 20pg in colonna (ASB = Automatically Subtract Baseline)

60 Conclusioni Il Sistema Agilent 7000B GC/MS-MS Triplo Quadrupolo permette di avere: Risultati Cromatografici che soddisfano i requisiti legislativi per lo screening Buona linearità e riproducibilità per l analisi delle Diossine e dei dl- e ndl-pcbs in matrici ambientali nell intero range di interesse Rivelazione a concentrazioni dell ordine dei femtogrammi (WHO-TEQ/g) Valori della TEQ della GC-HRMS e della GC-MS/MS sono confrontabili e generalmente nel range di +/- 20% Ai valori più bassi di TEQ (concentrazioni upperbound) la differenza tra la HRMS e la MS/MS è di un valore 2-3 volte migliore sul sistema HRMS L analisi dei ndl-pcb a concentrazioni < 10 ng/g (come somma dei PCB Indicatori) si effettua senza alcun problema

61 Ringraziamenti Dr.ssa Anna Calì Agilent Technologies Italia S.p.A. - Roma Analisi di Diossine, Furani e PCB nel settore ambientale e alimentare con la GC-MS/MS: 7890A/7000B Dr. Marco Pucci ph S.r.l. - Tavarnelle Val di Pesa (FI) Dati di Analisi di Diossine e Furani Dr. Joerg Riener Agilent Technologies D GmbH - Waldbronn Dati di Analisi di Dioxin Like PCB Dr. Chris Sandy Agilent Technologies UK Ltd - Wokingham Determination of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and polychlorinated dibenzo-p-furans (PCDFs) in Foodstuffs using the 7000B Tandem Quadrupole GC-MS/MS System Dr. Maurizio Guidotti Arpalazio Sezione di Rieti - Rieti Dr. Nicola Cimino Agilent Technologies Italia S.p.A. - Roma Detection of Dioxins and Furans PCDDs / PCDFs in marine sediments by Triple Quad GC/MS/MS Instrument

62 Domande?