La microscopia. Dott.ssa A. Romano Centro di Ateneo per lo Sviluppo e l Innovazione nell Industria Alimentare

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1 La microscopia Dott.ssa A. Romano Centro di Ateneo per lo Sviluppo e l Innovazione nell Industria Alimentare

2 BIBLIOGRAFIA Aguilera J.M. and Stanley D.W. (1999). Microstructural Principles of Food Processing and Engineering, Second Edition, Ed. Aspen Publisher Inc., Gaithersburg, Maryland, Dott.ssa A. Romano Centro di Ateneo per lo Sviluppo e l Innovazione nell Industria Alimentare

3 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Struttura e proprietà degli alimenti Vi sono più animali viventi nella patina presente sui denti dell uomo, di quanti non siano gli uomini in un Regno intero. Anthony von Leeuwenhoek ( )

4 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Struttura e proprietà degli alimenti Ad occhio nudo possono essere distinti come separati, due punti che si trovino ad una distanza tra loro di almeno mm; se la distanza è inferiore i due punti non possono essere più distinti e vengono confusi in uno solo.

5 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Alcune tecniche per ingrandire gli oggetti erano note sin dall'antichità (lenti di quarzo, di vetro o di cristalli trasparenti, bocce di vetro riempite d'acqua e altri simili rudimentali accorgimenti). Il telescopio ed il microscopio sono stati inventati in Olanda all inizio del XVII secolo.

6 Modello di Microscopio E. Leitz-Wetzlar del 1913 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Il microscopio ottico composto rappresenta il mezzo diagnostico probabilmente più impiegato nelle scienze mediche e biologiche.

7 Dai suoi esperimenti sulla meccanica dedusse quella che ancora oggi è chiamata legge di Hooke, secondo la quale i corpi elastici reagiscono alle deformazioni con una forza di richiamo di intensità proporzionale all'entità della deformazione. Il termine cellula è stato coniato, osservando al microscopio il sughero, in un lavoro sulla struttura o tessuto del sughero e sulle cellule o pori di altri corpi porosi.

8 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Questi primi microscopi, in particolare quelli composti, non permettevano una buona visione, gli oggetti erano falsati da aloni di luce di vari colori (aberrazione cromatica) e da deformazioni e distorsioni causate dalla curvatura delle lenti (aberrazione sferica). Quest'ultimo problema fu risolto nell'ottocento dal medico inglese Lister che ideò delle lenti particolari, mentre con le tecniche di colorazione introdotte poco dopo si evitavano anche le aberrazioni cromatiche.

9 Il microscopio è lo strumento che consente di osservare oggetti piccoli e vicini a forte ingrandimento. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

10 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Principali unità di misura usate in microscopia Micrometro o micron μ ο μm 0,001mm 10-6 m nanometro nm ο mμ 0,001μm 10-9 m Àngstrom Ă 0,0001μm m

11 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II OTTICA geometrica elettronica

12 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Ottica geometrica Studia i fenomeni e le leggi alle quali è sottoposta la luce nella sua propagazione (anche in mezzi non omogenei) Rifrazione Riflessione Assorbimento

13 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Lenti: Convergenti Divergenti Aberrazioni: Sferica Oggetto Astigmatica Cromatica

14 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Ottica elettronica Studia l emissione elettronica ovvero la produzione nel vuoto di elettroni liberi Emissione termoionica: provocata dal sufficiente riscaldamento di un metallo Emissione di campo (o elettrostatica): provocata da campi elettrici intensissimi Emissione secondaria: provocata dall azione di elettroni a elevata energia su determinati corpi

15 Microscopio Ottico Si usa luce visibile per illuminare gli oggetti e lenti rifrattive per elaborare l immagine e renderla visibile all occhio in forma ingrandita. I microscopi ottici tradizionali sono basati sulle così dette lenti sottili. Le lenti sottili sono dispositivi che permettono la creazione di immagini di dimensioni diverse di quelle dell oggetto che hanno originato l immagine stessa. Esse basano il loro funzionamento sul fenomeno della rifrazione.

16 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Quando un raggio luminoso passa da un mezzo ad un altro, si ha un fenomeno di rifrazione: cioé la direzione del raggio subisce una deviazione all interfaccia dei due mezzi. L indice di rifrazione (I.R.) indica la misura di quanto una sostanza sia capace di rallentare la velocità della luce; la direzione e l ampiezza sono determinate dagli indici di rifrazione dei due mezzi che formano l interfaccia.

17 LENTI E DEVIAZIONE DELLA LUCE θ 1 θ 2 θ 3 θ 4 Deviazione della luce attraverso un prisma. Le linee normali, perpendicolari alla superficie del prisma, sono indicate dalle linee tratteggiate. Come la luce penetra nel vetro, subisce una deviazione della direzione originale (l angolo θ 2 è inferiore all angolo θ 1 ). Quando la luce esce dal vetro per tornare all aria, viene deviata nuovamente rispetto alla seconda direzione (θ 4 è maggiore di θ 3 ). Ciò testimonia la capacità del prisma di deviare i raggi luminosi che lo attraversano.

18 FUNZIONAMENTO DELLA LENTE df I raggi luminosi provenienti da una sorgente posta ad una certa distanza si concentrano nel punto focale F, che è posto ad una distanza df, distanza focale, dal centro della lente. F

19 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II FUNZIONAMENTO DELLA LENTE F Una lente funziona come un insieme di prismi, dove F è il punto focale e df è la distanza focale, dal centro della lente. df

20 La potenza di una lente è in relazione con la distanza focale: una lente con distanza focale breve ha un potere di ingrandimento superiore a quello di una lente più debole avente una distanza focale più lunga. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

21 POTENZA La potenza P di un microscopio è pari a: P = a f 1 f 2 dove a è la distanza tra i due fuochi compresi tra l'obiettivo e l'oculare f 1 e f 2 le distanze focali dell'obiettivo e dell'oculare. La potenza è indipendente dalle capacità dell'osservatore.

22 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II IL POTERE DI RISOLUZIONE (PDR) L APERTURA NUMERICA (AN) Il potere di risoluzione di un sistema ottico consiste nella capacità di distinguere due punti dell oggetto che stiamo osservando come due punti distinti fra di loro L occhio umano ha un potere risolutivo di mm.

23 La distanza minima (d) tra due oggetti che consente di individuarli come entità distinte, e non come un oggetto unico, è data dalla seguente equazione: d = 0,5λ nsin a dove lamba (λ) rappresenta la lunghezza d onda della radiazione n è l indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente e campione a è il semiangolo della lente dell obiettivo Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

24 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Riducendo d la risoluzione aumenta, consentendo l individuazione nel campione dei particolari più fini. Il PdR rappresenta una delle caratteristiche fondamentali del sistema ottico che compone il microscopio ed è diretta funzione delle lenti, dell indice di rifrazione dei mezzi interposti fra campione e lente e della lunghezza d onda della luce impiegata.

25 Il limite di risoluzione può essere migliorato (diminuito): diminuendo λ (λ è nm per la luce visibile, nm per la luce UV, e solo 0,04 nm per elettroni accellerati a 100 kv) aumentando il prodotto nsena (detto apertura numerica, AN) per esempio interponendo fra obiettivo e campione un olio con un indice di rifrazione simile a quello del vetro (1,518). L AN è tipicamente 0,65 per un obiettivo a secco e 1,25-1,6 per un obiettivo ad immersione Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

26 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II L Apertura Numerica (AN) è un valore che descrive le qualità della lente ed è un parametro così importante che le case produttrici stampano questo dato direttamente sulla struttura esterna dell obiettivo L Apertura Numerica (n sinq) della lente dell obiettivo ovvero il suo angolo d accettazione della luce è influenzata dall indice di rifrazione del mezzo interposto fra oggetto e lente e dalla distanza di lavoro della lente dall oggetto

27 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Obiettivo Distanza di lavoro Vetrino per campione a a Apertura numerica del microscopio. L apertura angolare a è pari alla metà dell angolo del cono di raggi raccolti dalla lente e provenienti da un campione. L illustrazione a destra ha maggiore apertura numerica e angolare; la sua risoluzione è superiore, mentre la sua distanza di lavoro è inferiore.

28 La distanza minima (d) tra due oggetti che consente di individuarli come entità distinte, e non come un oggetto unico, è data dalla seguente equazione: d = 0,5λ nsin a dove lamba (λ) rappresenta la lunghezza d onda della radiazione n è l indice di rifrazione del mezzo interposto fra lente e campione a è il semiangolo della lente dell obiettivo

29 Riducendo d la risoluzione aumenta, consentendo l individuazione nel campione dei particolari più fini. Il PdR rappresenta una delle caratteristiche fondamentali del sistema ottico che compone il microscopio ed è diretta funzione delle lenti, dell indice di rifrazione dei mezzi interposti fra campione e lente e della lunghezza d onda della luce impiegata.

30 PROFONDITÀ DI CAMPO (PDC) E PROFONDITÀ DI FUOCO (PDF) La profondità di campo rappresenta la distanza fra due piani, al di sopra ed al di sotto del campione da osservare, messi contemporaneamente a fuoco dall obiettivo. La PdC è inversamente proporzionale alla AN dell obiettivo. È piuttosto evidente che, se il campione da esaminare ha un certo spessore e l obiettivo ha una profondità di campo ridotta, si potranno avere delle difficoltà nella messa a fuoco.

31 La profondità di fuoco rappresenta invece il range di messa a fuoco dell immagine. Questo parametro ha importanza analoga al PdC, ma presenta una importante differenza: aumentando il potere di ingrandimento dell obiettivo la PdC diminuisce, mentre la PdF invece aumenta.

32 CONTRASTO Con questo termine si intende indicare grossolanamente la quantità di sfumature di grigio o di colore presenti nell immagine di un campione Il contrasto nel microscopio ottico avviene come conseguenza dell assorbimento della luce da parte dei coloranti usati sul campione da esaminare: come risultato di questo fenomeno meno luce arriverà all occhio dell osservatore e la parte più intensamente colorata apparirà più scura. Nel microscopio ottico composto contrasto e risoluzione si escludono vicendevolmente poiché aumentando il contrasto si avrà, come conseguenza, una diminuzione del potere di risoluzione.

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34 TIPI DI MICROSCOPI microscopi semplici: un solo sistema di lenti (lenti di ingrandimento, i primi microscopi ); microscopi composti: due sistemi di lenti (i microscopi moderni con obiettivi e oculari)

35 Microscopio semplice a luce trasmessa È costituito da una lente d ingrandimento munita di sostegno. L'oggetto da osservare viene posto su un altro sostegno, forato, per permetterne l'illuminazione dal basso. L'ingrandimento è dato dalla formula: G = 25 f dove: 25 = distanza della visione distinta (cm), f = distanza focale della lente (cm); La formula è valida solo per piccole distanze focali.

36 Microscopio composto a luce trasmessa È il comune microscopio definito anche microscopio in campo chiaro, perché forma un immagine scura su uno sfondo luminoso. Organismi e cellule viventi, non colorate, possono essere osservate al microscopio in campo scuro semplicemente cambiando le modalità di illuminazione.

37 ANATOMIA DI UN MICROSCOPIO fotocamera o telecamera oculari revolver con obiettivi stativo fonte di illuminazione vite macrometrica e micrometrica tavolino traslatore condensatore diaframma di campo

38 ANATOMIA DEL MICROSCOPIO Alla base è collegata una sorgente luminosa formata da uno specchio o una lampada elettrica. Nel braccio sono inserite due manopole per aggiustare il fuoco, una manopola per la messa a fuoco grossolana (macrometrica) e una manopola per la messa a fuoco di precisione (micrometrica), che possono muovere o il tavolino o il portaobiettivi così da focalizzare l immagine. Il tavolino sorregge i vetrini da esaminare trattenuti da un fermo del traslatore meccanico. Il traslatore meccanico consente all operatore di imprimere varie posizioni al campione usando le manopole di regolazione del tavolino.

39 Nella porzione superiore del braccio è inserito il corpo base cui sono attaccati un portaobiettivi e uno o più oculari. I più comuni sono dotati di due oculari, per cui sono definiti microscopi bioculari. Regolatore interpupillare Il corpo contiene una serie di specchi e di prismi, così che i cilindri contenenti gli oculari possono essere spostati in vario modo per adattarli alle caratteristiche dell osservatore.

40 ANATOMIA DEL MICROSCOPIO Il portaobiettivo contiene da tre a cinque obiettivi, ciascuno con lenti di vario potere di ingrandimento, e può essere ruotato per posizionare l obiettivo più idoneo al di sotto del corpo. L obiettivo rappresenta l elemento più critico ed importante del microscopio poiché è soprattutto la qualità delle sue lenti che condiziona le prestazioni ed il valore dello strumento.

41 L obiettivo è rappresentato da un doppio sistema di lenti convergenti a corta focale che proietta l immagine ingrandita ed invertita dell oggetto sotto osservazione nel piano focale inferiore dell oculare in modo che questo possa "vederla" ed ingrandirla ulteriormente. In teoria, un microscopio dovrebbe essere confocale (a fuoco costante), cioè l immagine dovrebbe rimanere a fuoco anche cambiando gli obiettivi. All osservazione microscopica, l ingrandimento totale del campione si ottiene moltiplicando tra loro l ingrandimento dell obiettivo e quello dell oculare

42 Ogni obiettivo porta sulla sua montatura alcune sigle che è opportuno conoscere perché descrivono le potenzialità, i limiti e le istruzioni d uso per ogni particolare obiettivo. In generale, ogni obiettivo riporta sempre le stesse indicazioni: se si tratta di un obiettivo apocromatico (ovvero che produce un immagine corretta per le aberrazioni cromatiche), se si tratta di un obiettivo planare (ovvero che produce una immagine corretta per le aberrazioni di curvatura), l ingrandimento dell immagine (ad es. 100X), l apertura Numerica (A.N.), la lunghezza che deve avere il tubo porta-oculare per cui è destinato l obiettivo

43 OBIETTIVO Ad immersione A secco

44 Si definiscono ad immersione quegli obiettivi che possono essere usati unicamente interponendo una goccia di liquido fra la loro lente frontale ed il vetrino coprioggetto del campione. Tutti i microscopi impiegati in campo biomedico e microbiologico hanno, nel loro corredo di ottiche, un obiettivo ad immersione; si tratta in generale di obiettivi dotati di forte potere di ingrandimento del campione e la sostanza in cui vengono immersi è quasi invariabilmente olio minerale per microscopia, per cui portano scritto, sulla loro montatura oil (oppure Hl) e sono in genere contrassegnati da una riga di colore bianco o nero.

45 Con un obiettivo a secco il mezzo interposto è aria che ha un indice di rifrazione (n) pari ad 1. Nessuna lente che opera in un mezzo di propagazione come l aria può avere un apertura numerica superiore ad 1. Il solo modo per ottenere un apertura numerica superiore e quindi raggiungere un potere di risoluzione piú elevato è quello di aumentare l indice di rifrazione mediante l uso di olio da immersione, un liquido incolore che presenta lo stesso indice di rifrazione del vetro.

46 MEZZO INDICE DI RIFRAZIONE acqua 1,33 Alcool etilico 1,36 Aria (1atm e 20 C) 1,0003 polietilene 1,50-1,54 fluorite 1,43 Quarzo fuso 1,46 Cloruro di sodio 1,53

47 Funzionamento di un obiettivo ad immersione in olio, all aria e con olio da immersione aria olio Vetrino coprioggetto Vetrino

48 ANATOMIA DEL MICROSCOPIO I campioni da esaminare al microscopio ottico devono essere illuminati perché si possa formare una loro immagine visibile nell oculare e, di solito, questo viene ottenuto con "luce trasmessa", ovvero la luce attraversa i campioni stessi.

49 In basso il diaframma di campo con il sistema ad iride che permette di regolare l ampiezza del fascio di luce che arriva al condensatore; prima di questo sistema è in genere inserito un banco di filtri che permette di cambiare il colore della luce bianca proveniente dalla fonte luminosa. Quest ultima è costituita da una lampada alogena (munita di sistemi di allineamento e di reostato per la regolazione dell intensità) che produce una luce bianca.

50 Segue il condensatore, munito di un ulteriore diaframma ad iride (diaframma di apertura) che permette di mettere a fuoco il fascio di luce sul preparato (mediante una vite laterale) o di variare fase e ampiezza del fascio di luce (contrasto di fase e campo oscuro). Notare il sistema di viti che permette la centratura del condensatore. Il tavolino traslatore, sul quale si pone l oggetto da osservare, è munito di viti per gli spostamenti longitudinali e trasversali.

51 La funzione del condensatore è quella di mettere a fuoco sul piano focale posteriore dell obiettivo l immagine della sorgente luminosa, cosicché ogni punto del campione diviene a sua volta una sorgente luminosa e la sua immagine potrà essere vista nitidamente attraverso l oculare. Per ottenere questo, è necessario che vengano soddisfatte due condizioni fondamentali: 1. regolazione perfetta in altezza del condensatore (pena la comparsa di distorsioni cromatiche e lo scadimento generale della nitidezza dell immagine trasmessa); 2. chiusura opportuna del diaframma di apertura in rapporto all AN dell obiettivo in uso (pena la diminuzione del potere di risoluzione e la formazione di immagini di qualità scadente).

52 Le regole di base per una corretta regolazione del condensatore sono le seguenti: centrare correttamente il condensatore attraverso le due piccole viti di posizionamento; regolare in altezza il condensatore, generalmente 1 2 mm al di sotto del tavolino traslatore; togliere un oculare e, guardando attraverso il tubo portaottiche, aprire il diaframma del condensatore fino a circa 7/8 del campo luminoso visibile

53 PREPARAZIONE ED IMPOSTAZIONE DEL MICROSCOPIO 1. Accendere la fonte luminosa del microscopio ed impostarla alla intensità desiderata 2. Aggiustare la distanza interpupillare agendo sul sistema binoculare del portaoculari.

54 3. Posizionare correttamente (con la parte da esaminare rivolta verso la lente) il vetrino sul tavolino traslatore. 4. Mettere a fuoco il campione agendo sulle manopole macro e micrometriche.

55 5. Ricontrollare la messa a fuoco con il solo occhio destro. 6. Aggiustare la messa a fuoco anche con l occhio sinistro agendo sulla ghiera di regolazione diottrica.

56 7. Selezionare l ottica 10X; chiudere completamente il diaframma di campo ed abbassare il condensatore fino ad avere il diaframma a fuoco nell obiettivo. 8. Centrare il diaframma di campo nel campo di osservazione agendo sulle viti di centratura ed aprire il diaframma di campo fino a quando la sua apertura non occupi tutto il campo di osservazione

57 10. Riportare il condensatore alla giusta altezza (1-2 mm al di sotto del tavolino traslatore) e regolare il diametro del diaframma di apertura, in relazione all AN dell obiettivo in uso 11. Buon lavoro (S. Cerevisiae, 400x)

58 t= 15 min t= 30 min

59 t= 45 min t= 60 min

60 Microscopio in campo scuro Un particolare tipo di condensatore nell osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato. Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo scuro. In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico.

61 OSSERVAZIONE IN CAMPO SCURO

62 Microscopio a fluorescenza Questo tipo di microscopio utilizza radiazioni ultraviolette, per ottenere, nei preparati in cui ciò è possibile, la fluorescenza. Un oggetto, infatti, può essere osservato anche per la luce che esso stesso irradia; è questo il principio su cui si basa il microscopio a fluorescenza.

63 Quando alcune molecole assorbono energia radiante, sono eccitate e restituiscono, sotto forma di luce, parte dell energia intrappolata. Qualsiasi luce irradiata da una molecola eccitata avrà una lunghezza d onda superiore (o un energia minore) rispetto alla radiazione originariamente assorbita. La luce fluorescente è emessa molto rapidamente dalla molecola eccitata, come lei rilascia l energia intrappolata per ritornare ad una condizione più stabile.

64 I campioni sono trattati con coloranti detti fluorocromi, molecole queste che risultano fluorescenti se esposte alla luce di una particolare lunghezza d onda; esistono tuttavia microrganismi che sono dotati di fluorescenza propria. Questo microscopio forma un immagine dei campioni marcati con fluorocromi sfruttando la luce che essi emettono quando sono resi fluorescenti. Un filtro barriera posto dopo l obiettivo sopprime qualunque rimanente luce ultravioletta, che potrebbe danneggiare gli occhi dell osservatore, o luci blu e violetta che potrebbero ridurre il contrasto dell immagine. Il microscopio a fluorescenza trova largo impiego essenzialmente nella microbiologia medica e nella ecologia microbica.

65 Microscopio a contrasto di fase Il microscopio a contrasto di fase trasforma piccole differenze dell indice di rifrazione e della densità del campione in variazioni dell intensità luminosa facilmente individuabili. Questo tipo di microscopio ottico trova ampio impiego nell osservazione delle cellule viventi, poichè le cellule possono essere osservate senza bisogno di colorazione e senza alcun tipo di alterazione conservativa.

66 Il condensatore di un microscopio a contrasto di fase è dotato di un diaframma di fase, di un disco opaco trasparente solo lungo una sottile corona circolare o anello, che produce un cono luminoso cavo.

67 Un batterio (Lb. sakei), Contrasto di fase, 400x Una muffa (G. candidum), Contrasto di fase, 400x

68 Un attinomicete Contrasto di fase, 400x Una muffa (R. oligosporus), Contrasto di fase, 400x

69 Microscopio polarizzatore È un microscopio con due filtri posti sul percorso della luce: 1. il polarizzatore prima degli obiettivi 2. l'analizzatore (che è un altro filtro polarizzatore ma per la funzione che ha viene detto analizzatore) posto dopo il campione e prima degli oculari e il sistema di rilevamento ottico.

70 Il polarizzatore (1) sul condensatore illumina il preparato (3) tramite il condensatore con luce polarizzata linearmente. L'analizzatore (5) è disposto dietro all'obiettivo - non troppo lontano dalla sua pupilla d'uscita - con un'angolazione di 90 rispetto al polarizzatore (1). La lente del tubo (6) forma l'immagine intermedia (7). Quando i piani di polarizzazione tra i due prismi di Nicol sono incrociati ad angolo retto, il campo dello strumento appare scuro, tranne che nelle zone corrispondenti a sostanze birifrangenti o dotate di potere rotatorio.

71 In queste sostanze, dette birifrangenti, l'indice di rifrazione dipende dalla direzione di oscillazione della luce incidente. Ciò avviene particolarmente nei cristalli, come l'amido e i minerali, ma anche nei polimeri. Se questi materiali vengono osservati al microscopio polarizzatore, con polarizzatore ed analizzatore incrociati, nell'immagine vengono viste zone luminose, perchè parte della luce "ruotata" viene fatta passare dall'analizzatore.

72 BIRRA

73 Microscopio confocale o microscopio a scansione a doppia focalizzazione Il principio di questo microscopio fu brevettato da Marvin Minsky nel 1961, ma venne sfruttato solo dopo il La microscopia confocale a scansione laser si è affermata da alcuni anni come una potente tecnologia in grado di migliorare la qualità delle osservazioni in microscopia ottica nonché di aprire nuove possibilità di indagine e nuove applicazioni in campi assai vari della ricerca scientifica (dalla biologia cellulare alla fisica dei materiali).

74 Un microscopio confocale si differenzia strutturalmente da un tradizionale microscopio a fluorescenza per l utilizzo di una sorgente luminosa laser (che consente di migliorare drasticamente la qualità delle immagini grazie all intensità e alla coerenza della luce emessa) e per la presenza di un sistema ottico ed elettronico che permette di effettuare la scansione di una sezione del campione osservato (sezione ottica), ricostruendo poi sullo schermo di un computer l immagine risultante. Viene utilizzato per l'esame di un campione di un certo spessore, in quanto permette di analizzare ad alta risoluzione piani al di sotto della superficie.

75 Queste caratteristiche di base, oltre a migliorare la qualità delle osservazioni (risoluzione più alta, migliore contrasto, rapidità di acquisizione e archiviazione delle immagini) hanno aperto la strada a nuove e rivoluzionarie applicazioni della microscopia ottica, come la ricostruzione tridimensionale a video dei campioni osservati Nei moderni microscopi confocali la luce di un laser viene fatta convergere dalle lenti dell'obiettivo in un punto estremamente piccolo del campione osservato. Il punto stesso, attraverso un sistema di specchi oscillanti, viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell'obiettivo così da effettuare una scansione completa di tutto il piano focale.

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77 Le caratteristiche della luce laser (estrema coerenza, alta intensità e lunghezza d'onda unica) consentono di evitare fenomeni di aberrazioni e diffrazioni tipiche invece della luce prodotta da tradizionali lampade a incandescenza. Inoltre, le lenti dell'obiettivo fanno sì che l'intensità della luce laser sia sufficiente a eccitare i fluorocromi soltanto nel punto di massima concentrazione del raggio, corrispondente al piano di messa a fuoco dell'obiettivo.

78 In questo modo le aree superiori ed inferiori al piano di fuoco, non venendo eccitate, non contribuiscono alla formazione dell'immagine, limitando la formazione di aloni e riducendo il rumore di fondo. Il segnale elettrico in uscita dal fotomoltiplicatore viene quindi digitalizzato e inviato ad un computer che registra i valori di intensità misurati per ogni punto.

79 Questi valori vengono utilizzati per ricostruire l'immagine a video: ogni punto del campione verrà cioè a corrispondere ad un pixel dello schermo, e l'intensità luminosa del punto verrà rappresentata da una corrispondente tonalità di grigio. L'accostamento di tutti i singoli pixel corrispondenti ai punti scanditi dal fascio laser nel campione darà così l'immagina finale.

80 Spostando lungo l'asse verticale il campione dopo ogni scansione, è possibile eseguire serie di scansioni successive corrispondenti a piani focali via via più profondi all'interno del campione. Queste scansioni prendono il nome di sezioni ottiche e la loro sovrapposizione ordinata, eseguita via software, consente di ricostruire un'immagine complessiva dell'intero volume scandito, in cui tutti i piani sono contemporaneamente a fuoco.

81 L'archiviazione su computer dei dati corrispondenti a tutti i pixel delle singole sezioni ottiche consente di eseguire elaborazioni dell'immagine sia in termini di regolazione del contrasto, cromia, ecc, sia in termini di rotazione virtuale del volume acquisito attraverso la scansione.

82 Latte in polvere: in giallo sono mostrati i globuli di grasso, in blue le proteine. I globuli di grasso all interno delle particelle sono generalmente <2μm. Latte e cioccolato: in blue sono mostrati i globuli di grasso, in verde le proteine, in rosso i granuli di cacao, in verde scuro/nero i cristalli di zucchero. I cristalli di zucchero rientrano generalmente in un range tra 5-25μm.

83 ALLESTIMENTO DI PREPARATI BIOLOGI PER L OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO Fissazione Disidratazione Inclusione in paraffina/resina Sezionamento al microtomo/ ultramicrotomo Colorazione/contrasto Montaggio

84 FISSAZIONE La fissazione è il processo con cui le strutture interne ed esterne delle cellule vengono conservate e bloccate (fissate) nelle loro posizioni. Questa procedura inattiva gli enzimi che potrebbero alterare la morfologia cellulare e stabilizza la struttura della celllula in modo tale da evitarne qualsiasi modificazione durante la colorazione e l osservazione.

85 FISSAZIONE CHIMICA FISICA uso di fissativi chimici: Coagulanti Non coagulanti calore congelamento essiccamento

86 La formaldeide e l alcol etilico possono essere utilizzati da soli e sono i fissativi più utilizzati. Generalmente vengono usate miscele fissatrici come miscele a base di acido picrico (Fissativo di Bouin), miscele a base di bicromato di potassio, miscele a base di formalina.

87 Fissazione chimica di campioni di cibo viscoso concentrazione in capsule con agar gelificato (Proc. 4th Europ. Reg. Conf. Electron Microsc. Rome 11, 37-38, 1968). rimozione delle capsule, affinchè i campioni possano essere manipolati come dei campioni solidi più grandi. Questa tecnica è utile per la microscopia del cibo viscoso come: yogurt, crème, mayonese, ecc. Incapsulamento a caldo: sciogliere agar al 3% a C, rilasciare il materiale nelle capsule contenenti l agar. Far solidificare l agar.

88 Incapsulamento a freddo I campioni termosensibili potrebbero danneggiarsi a contatto con agar caldo, è stato così sviluppato il sistema di incapsulamento del cibo viscoso a bassa temperatura. VelikyI A., Kaláb M., (1990). Encapsulation of viscous high-fat foods in calcium alginate gel tubes at ambient temperature. Food Structure, 9,

89 LAVAGGIO Dopo la fissazione il fissativo deve essere allontanato dal tessuto poiché potrebbe influenzare sfavorevolmente l inclusione e/o la colorazione. Il tampone fosfato è molto utilizzato nel lavaggio.

90 DISIDRATAZIONE Effettuata allo scopo di allontanare completamente i fluidi presenti nel campione è necessaria per poterlo successivamente sottoporre ai procedimenti di inclusione. Concentrazioni crescenti di soluzioni alcooliche: 50% 70% min 95% 100%

91 INCLUSIONE Il campione biologico, per essere osservato al microscopio ottico, deve essere sezionato in fettine sottili (2-5 micron), perciò il campione deve assumere una sufficiente durezza e compattezza. Si include in paraffina, che ha una consistenza plastica variabile in rapporto al suo punto di fusione. Si distinguono: paraffine molli (punto di fusione da 45 a 54 C) paraffine dure (punto di fusione da 58 a 60 C)

92 SEZIONAMENTO Viene effettuato al microtomo rotativo costituito da una lama fissa mentre il portaoggetti viene avvicinato alla lama con un dispositivo a manovella. Le sezioni ottenute sono dello spessore di 2-6 micron. Si usano anche microtomi a slitta e microtomi a congelazione (criostati).

93 COLORAZIONE Colorazioni istomorfologiche che evidenziano le varie strutture del campione in esame Colorazioni istochimiche che evidenziano le sostanze chimiche contenute nei tessuti Colorazione semplice (viene usato un solo agente colorante) Colorazione differenziale (colorazione di Gram)

94 Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei preparati Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio. Si possono distinguere: Coloranti vitali: le cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamento; oggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse Coloranti che richiedono fissazione: le cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule.

95 Coloranti naturali (di derivazione animale o vegetale) Coloranti artificiali: composti organici aromatici

96 MONTAGGIO Il mezzo di montaggio deve conservare al riparo dall aria la sezione senza alterarne la colorazione e deve unire stabilmente il vetrino coprioggetto al portaoggetto. Si usa il balsamo del Canada (resina naturale) o resine artificiali (Eukitt, DPX). Utile per ottenere preparati permanenti

97 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Struttura e proprietà degli alimenti Con la denominazione microscopio elettronico si raggruppano differenti tipi di strumenti, con caratteristiche e possibilità applicative assai diverse, che hanno come elemento comune quello di utilizzare, per la formazione dell immagine, gli elettroni.

98 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Struttura e proprietà degli alimenti Le immagini ottenuti tramite microscopia elettronica vengono generate usando elettroni al posto della luce visibile che viene usata nei comuni strumenti ottici, come il microscopio ottico. Gli elettroni possono essere più utili dei fotoni poichè essi possono muoversi con lunghezze d onda più piccole della luce.

99 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Struttura e proprietà degli alimenti Il potere risolutivo cresce proporzionalmente al decrescere della lunghezza d onda della radiazione impiegata, infatti la scoperta che gli elettroni hanno una radiazione di bassissima lunghezza d onda ha suggerito la possibilità di usare fasci di elettroni per ottenere poteri risolutivi assai elevati.

100 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II MICROSCPIA ELETTRONICA Studia l EMISSIONE ELETTRONICA ovvero la produzione nel vuoto di elettroni liberi. Emissione termoionica: provocata dal sufficiente riscaldamento di un metallo Emissione di campo (o elettrostatica): ottenuta per azione di campi elettrici intensissimi Emissione secondaria: provocata dall azione di elettroni a elevata energia su determinati corpi.

101 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II OTTICA ELETTRONICA LENTI: Magnetiche Sempre Convergenti ABERRAZIONI: Aberrazione sferica Astigmatismo Aberrazione cromatica

102 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II ABERRAZIONI Sferica Oggetto Astigmatica Cromatica

103 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Quando elettroni veloci bombardano un campione, entrano nello stesso e possono interagire con gli atomi contenuti in tutta una regione (volume di interazione). Tra gli elettroni incidenti e gli atomi del campione hanno luogo fondamentalmente un tipo di interazione in grado di generare fotoni X. L'insieme di queste transizioni tra livelli atomici dà luogo ad un insieme di raggi X distribuiti secondo uno spettro discreto di energie dette righe caratteristiche di quell'elemento.

104 Schema di diversi tipi di emissione da parte di un solido bombardato da un fascio primario di elettroni Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Fascio primario Raggi X forniscono informazioni di tipo compositivo. Fotoni Elettroni retrodiffusi forniscono informazioni di tipo compositivo. Elettroni secondari forniscono informazioni di tipo morfologico Elettroni assorbiti Elettroni trasmessi

105 Il microscopio elettronico è essenzialmente composto da una sorgente elettronica di conveniente intensità (filamento) e da un dispositivo che imprime forti accelerazioni al fascio di elettroni emesso, sottoponendoli ad una elevata tensione in un range che và da 20 a 100 mila Volt. Il fascio di elettroni accelerato attraversa un condensatore, incide sul campione, viene raccolto su un obiettivo e passando attraverso un oculare va a formare l immagine per l osservazione visiva. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

106 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II In linea di principio un microscopio elettronico opera come un normale microscopio ottico qualora si usasse luce con lunghezza d onda bassissima. Poiché però i normali dispositivi ottici non deviano gli elettroni, si ricorre a lenti elettrostatiche o a lenti magnetiche che, agendo sulla carica elettrica degli elettroni, ne provocano la deviazione. Naturalmente quanto descritto avviene nel vuoto ultra spinto.

107 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II SISTEMA DEL VUOTO Si devono rimuovere l aria e gli altri gas presenti nella colonna: L aria interferisce col moto degli elettroni Diminuzione della vita del filamento Contaminazione del campione Si distinguono due grandi categorie di pompe da vuoto: Pompe che aspirano gas dal sistema da vuotare e lo trasferiscono all esterno del sistema stesso (pompe rotative o meccaniche: Pa) Pompe che aspirano in se stesse il gas presente nel sistema, attraverso opportuni metodi di fissazione delle molecole del gas (pompe a diffusione: Pa; pompe turbomolecolari: Pa)

108 Caratteristiche del microscopio ottico, elettronico a trasmissione (TEM) e a scansione (SEM) Microscopio ottico TEM SEM Uso generale Struttura superficiale e sezioni Sezioni sottili Struttura superficiale Risoluzione (nm) , Massimo ingrandimento Sorgente della radiazione Luce visibile Fascio di elettroni Fascio di elettroni Mezzo di propagazione aria Vuoto spinto Vuoto spinto Tipo di lente Vetro elettromagnetica elettromagnetica Origine del contrasto Assorbimento differenziale della luce Diffusione degli elettroni Diffusione degli elettroni Preparazione campione facile difficile facile

109 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Il microscopio elettronico a trasmissione (T.E.M.) La Microscopia Elettronica a Trasmissione (TEM) permette di ottenere, da un campione sufficientemente assottigliato (< 0.1 micron), immagini ad alta risoluzione (< 10 Å) prodotte da elettroni ad alta energia (100 KeV) trasmessi su uno schermo fluorescente o su una pellicola fotografica. Il TEM fornisce informazioni circa la struttura interna del campione analizzato.

110 Nel microscopio elettronico a trasmissione viene sfruttato uno schema del tutto analogo a quello dell ordinario microscopio ottico, nel senso che il fascio incidente arriva, attraversa il campione e proietta oltre la sua immagine. Gli elettroni vengono generati da un filamento di tungsteno ed accelerati da una differenza di potenziale. L apparecchio che genera ed accelera il fascio si dice cannone elettronico. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

111 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

112 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II La focalizzazione del fascio è affidata ad una serie complessa di lenti elettromagnetiche, in genere da sei a otto, costituite da avvolgimenti elettromagnetici disposti simmetricamente rispetto al fascio incidente; hanno il compito di deviare verso l asse del fascio gli elettroni che tendono a deviare dal medesimo. Il tutto deve operare in UHV (Ultra Alto Vuoto). Variando l intensità della corrente nel circuito del condensatore si varia anche l intensità e la convergenza del fascio elettronico incidente. Con la variazione di quella del proiettore si regola l'ingrandimento, mentre variando quella dell'obiettivo si migliora la nitidezza. L'ingrandimento dipende essenzialmente dall intensità di corrente che percorre le bobine del proiettore.

113 Schema di funzionamento del TEM e geometria con cui il fascio incide sui piani di atomi Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

114 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Il fatto che il campione debba essere attraversato dagli elettroni implica che debba essere trasparente ai medesimi, e quindi di spessore ridottissimo, dell ordine delle decine di m m; questo spiega la difficoltà nella preparazione (assottigliamento) dei provini TEM.

115 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Il microscopio elettronico a scansione (S.E.M.) Il microscopio elettronico a scansione (Scansion Electron Microscope) fornisce informazioni sull aspetto, sulla natura e sulle proprietà di superfici e degli strati sottostanti di campioni solitamente solidi, con risoluzione media di 2 5 nanometri (riferita al segnale generato dagli elettroni secondari).

116 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II - emettitore di elettroni - lenti per la focalizzazione e per la scansione del fascio - Fenditure per la collimazione del fascio. - camera porta campione con uscite per la rilevazione dei segnali

117 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

118 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Funziona in un modo analogo ad un sistema televisivo a circuito chiuso. La base del SEM consiste in un fascio di elettroni generato da un cannone elettronico (catodo) situato sulla sommità della colonna, il fascio è attratto verso l'anodo, condensato da lenti collimatrici e focalizzato sul campione attraverso lenti obiettivo. Il fascio elettronico colpisce il campione, producendo tra l'altro, elettroni secondari e retrodiffusi. Questi elettroni sono raccolti da un detector per elettroni secondari ed uno per elettroni retrodiffusi, convertiti in segnali elettrici ed amplificati. Questi vengono convertiti in pixels ed elaborati da un sistema computer.

119 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Quando una superficie è investita da elettroni ad elevata energia sono prodotti diversi tipi di segnali, alla base della microscopia elettronica a scansione sono principalmente due i segnali che interessano elettroni secondari o segnale SE (Secondary Electron) elettroni retroddifusi (backscatterati)

120 Gli elettroni secondari, o segnale SE (Secondary Electron), sono definiti convenzionalmente come gli elettroni uscenti dal campione con energia minore o uguale a 50 ev. Essi provengono da una profondità di pochi nm e forniscono informazioni sulla topografia delle superfici e sulla presenza e distribuzione di campi magnetici o elettrici. L immagine fornita da tali elettroni appare in rilievo, come se l osservatore fosse allo stesso livello del diaframma interno e guardasse l oggetto illuminato da un ipotetica sorgente situata in corrispondenza del rilevatore. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

121 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Immagini in elettroni secondari (topografia, morfologia) L'immagine è formata dagli elettroni secondari estratti dal campione in seguito all'interazione con il fascio degli elettroni primari. Ideale per osservare dettagli minutissimi nella morfologia del campione, variando l'energia del fascio noi possiamo vedere i dettagli della reale superficie del campione (fascio a bassa energia) o rendere la superficie "trasparente" (fascio ad alta energia)

122 Gli elettroni retrodiffusi, o segnale BSE (Back-Scattered Electron), sono elettroni di energia maggiore di 50 ev che derivano principalmente dalle interazioni del fascio primario con i nuclei degli atomi del campione. Gli BSE forniscono informazioni riguardo al numero atomico medio della zona di provenienza (circa qualche μm), alla topografia e alla struttura cristallina del campione. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

123 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Immagine in elettroni retrodiffusi (composizione,topografia) Nell'immmagine il contrasto è funzione delle differenze di numero atomico degli elementi presenti sulla superficie del campione. Anche la topografia della superficie è percepibile con il segnale degli elettroni retroduffusi (BE) anche se la risoluzione è inferiore a quella raggiunta con gli elettroni secondari (SE).

124 Il SEM ha una grande profondità di campo che permette ad una vasta parte del campione di essere a fuoco contemporaneamente. La progettazione delle camere porta campioni è realizzata in modo da facilitare lo scambio dei campioni facendo variare di poco la pressione da quella ambientale a quella di esercizio. Il porta campioni inoltre può variare nelle direzioni X, Y e Z, ruotando intorno ad essi, per esaminare il campione in ogni punto. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

125 Camera e tavolino portacampioni Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

126 . Il SEM produce immagini ad alta risoluzione, ciò significa che particolari molto vicini tra loro possono essere esaminati ad alti ingrandimenti. Per questa ragione il SEM può realizzare un immagine che è una buona rappresentazione tridimensionale della superficie del campione. Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

127 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Il microscopio elettronico a scansione ha la possibilità di rilevare elettroni secondari e retrodiffusi in condizioni di vuoto variabile. Per le osservazioni è necessario però che il campione sia conduttore. Per i campioni conduttori di elettricità lo studio si presenta facile, poiché il flusso di elettroni a terra non è ostacolato riducendo al minimo gli inconvenienti dovuti all accumulo di cariche. Inoltre essendo dei buoni conduttori di calore, la degradazione termica è minima.

128 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Materiali non conduttori sono metallizati, cioè ricoperti con un sottile strato di oro o carbone, utilizzando uno sputter/vaporizzatore. Lo strumento può essere dotato di un accessorio per osservazioni di campioni in criogenia (CRIO-SEM) in condizioni di vuoto variabile, in tale tipo di analisi è necessario fornire le informazioni sui valori di temperatura e pressione in cui la fase che si vuole osservare risulta stabile.

129 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Caratteristiche del microscopio ottico, elettronico a trasmissione (TEM) e a scansione (SEM) Microscopio ottico TEM SEM Uso generale Struttura superficiale e sezioni Sezioni sottili Struttura superficiale Risoluzione (nm) , Massimo ingrandimento Sorgente della radiazione Luce visibile Fascio di elettroni Fascio di elettroni Mezzo di propagazione aria Vuoto spinto Vuoto spinto Tipo di lente Vetro elettromagnetica elettromagnetica Origine del contrasto Assorbimento differenziale della luce Diffusione degli elettroni Diffusione degli elettroni Preparazione campione facile difficile facile

130 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II ESEM: ENVIRONMENTAL SCANNING ELECTRON MICROSCOPE Il microscopio ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope) si presenta non solo come una naturale evoluzione della microscopia elettronica a scansione dal punto di vista elettronico ed informatico, ma come nuovo approccio concettuale che consente di superare il vincolo imposto dalla necessità di operare, come nei microscopi elettronici convenzionali, in condizioni di vuoto elevato.

131 Il diverso funzionamento si basa sull esistenza di una colonna che può lavorare, oltre che in modalità convenzionale (vuoto elevato in tutta la colonna), anche in modalità controllata di vuoto differenziale, elevato nella zona della colonna vera e propria (zona filamento e zona lenti), minore in prossimità del diaframma finale e decisamente più basso nella camera vera e propria ove viene posto il campione, pur mantenendo la risoluzione del SEM convenzionale (circa 4 nm). Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II

132 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II ESEM: ENVIRONMENTAL SCANNING ELECTRON MICROSCOPE SEM convenzionale con valori pressioni differenti tra la colonna e la camera del preparato

133 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II È stata sviluppata una tipologia di rivelatori che possono operare in presenza di gas (vapor d acqua o altro gas) all interno della camera potendo così sfruttare il segnale prodotto dal campione bombardato dal fascio elettronico e amplificato per effetto valanga dal gas flussante stesso. Il gas ottimale è il vapor acqueo Cannone elettronico: 10-7 torr Colonna: 10-5 torr 10-2 torr Camera del preparato: 10 torr Rivelatore: ESD (Environmental Secondary Detector) che amplifica il segnale generato dagli elettroni secondari sfruttando il gas presente nella camera.

134 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Si ottengono in questo modo due effetti: 1. il primo è l estrazione e neutralizzazione di cariche in eccesso dalla superficie del campione, cariche che altrimenti creerebbero un campo elettrostatico sul campione impedendone l osservazione, questo consente l osservazione di campioni anche isolanti senza dover rendere conduttiva la loro superficie. 2. il secondo è la produzione di un segnale morfologico proporzionale agli elettroni secondari rimossi dalla superficie del campione, dando la possibilità di un osservazione superficiale di buona qualità.

135 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Le condizioni sperimentali, all interno della camera, possono essere scelte via software (pressione, temperatura, energia e corrente del fascio primario sul campione, modalità di raggiungimento delle condizioni dinamiche di P e T sul preparato da osservare). Per il controllo della pressione si agisce su valvole di ingresso del gas (normalmente vapori di acqua) e sull aspirazione del sistema pompante, fino al raggiungimento della P impostata, il cui valore può essere modificato in modo continuo anche durante l esperimento.

136 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II Il valore limite per la P, nell attuale configurazione strumentale, è di circa 10 torr, oltre il quale possono esistere notevoli problemi ad acquisire un immagine. Per il controllo in temperatura viene utilizzato un sistema con celle Peltier su cui viene posto il materiale da osservare, questo dispositivo può operare a ± 15 C rispetto alla T del liquido refrigerante (normalmente acqua) che circola a contatto con le celle Peltier, proveniente da un sistema (bagno termostatato) esterno.

137 Dott. A. Romano Università degli Studi di Napoli FEDERICO II APPLICAZIONI: Osservazione diretta di campioni biologici Studio degli effetti dei gas sul preparato Valutazione degli effetti di idratazione e disidratazione del campione Studio di polimeri, olii, grassi, ecc. Studi agronomici (pollini, foglie, ecc.) LIMITI: Effetti di evaporazione di acqua e di danneggiamento termico del preparato che si possono verificare durante l osservazione