Regolazione del ciclo cellulare negli eucarioti. Copyright (c) by W. H. Freeman and Company

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1 Regolazione del ciclo cellulare negli eucarioti

2 Il ciclo vitale delle cellule La divisione cellulare avviene quando una cellula, dopo un periodo di crescita, si divide e dà vita a due cellule figlie. La gran parte delle cellule eucariotiche segue il ciclo cellulare, un orologio interno che determina le fasi della crescita e della divisione cellulare. La progressione attraverso il ciclo cellulare è controllata in corrispondenza di punti di controllo ( checkpoints ). Le cellule possono uscire dal ciclo cellulare e differenziarsi per svolgere funzioni specializzate. Le cellule possono andare incontro a morte cellulare programmata (apoptosi) per poter bilanciare la crescita cellulare o per generare nuove strutture durante lo sviluppo.

3 Il ciclo vitale delle cellule Verso la fine degli anni ottanta divenne chiaro ai ricercatori che i processi molecolari che regolano gli eventi principali del ciclo cellulare - duplicazione dei cromosomi e divisione cellulare - sono sostanzialmente simili in tutte le cellule eucariotiche. Nelle cellule eucariotiche la duplicazione cellulare è controllata soprattutto regolando la collocazione temporale di due eventi critici del ciclo cellulare: la replicazione del DNA e la mitosi.

4 Ciclo cellulare di una cellula eucariotica

5 La divisione cellulare Nei vertebrati e nei lieviti diploidi, le cellule in G 1 possiedono un numero diploide di cromosomi (2n). Nelle cellule aploidi (es. alcuni lieviti) le cellule in G 1 possiedono un solo cromosoma di ciascun tipo (1n). Nelle cellule animali che si duplicano rapidamente l intero ciclo cellulare ha una durata di circa 24 ore: M 30 G 1 9 ore S 10 ore 4,5 ore. G 2

6 Il ciclo cellulare è una serie ordinata di eventi che portano alla duplicazione delle cellule. G 1, S, G 2 = Interfase

7 Le fasi della mitosi e della citocinesi in una cellula animale

8 Le fasi della Mitosi Profase: cromatidi condensano; rottura membrana nucleare Metafase: I cromosomi si muovono verso l equatore della cellula e si allineano Anafase: I due cromatidi fratelli si separano in 2 cromosomi indipendenti. Telofase: Attorno ai nuclei si formano le nuove membrane nucleari. I cromosomi despiralizzano.

9 Modello che mostra come avviene il compattamento della cromatina e l impalcatura cromosomica dei cromosomi metafasici

10 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

11 La fosforilazione di proteine controlla la progressione attraverso il ciclo cellulare. I complessi eventi macromolecolari del ciclo cellulare vengono regolati da un piccolo numero di protein chinasi eterodimeriche, formate da una subunità catalitica ed una subunità regolatrice. La concentrazione delle subunità regolatrici di queste chinasi, chiamate cicline, aumenta e diminuisce in fase con il ciclo cellulare. Le subunità catalitiche sono chiamate chinasi ciclina-dipendenti (Cdk, cyclin-dependent kinase), perchè non possiedono attività chinasica a meno che non siano associate con una ciclina. Ciascuna subunità catalitica Cdk può unirsi a diverse cicline ed è la ciclina ad essa associata a determinare le proteine che vengono fosforilate dal complesso Cdk-ciclina.

12 Due componenti chiave del sistema di controllo del ciclo cellulare: ciclina e Cdk Un complesso di ciclina con Cdk agisce come una proteina chinasi per attivare processi a valle. Senza la ciclina Cdk è inattiva

13 Si pensa che Cdk si associ successivamente con cicline diverse per attivare i diversi processi a valle. La fine dell attività di Cdk è determinata dalla degradazone della ciclina

14 La degradazione regolata di proteine controlla la progressione attraverso il ciclo cellulare. I complessi proteici della via mediata da Cdc34 e di quella mediata dall APC poliubiquitinano substrati specifici (es.: l inibitore della fase S, l inibitore dell anafase, e le cicline mitotiche), avviandoli alla degradazione da parte dei proteasomi. Queste vie spingono il ciclo in un unica direzione dal momento che la degradazione delle proteine è irreversibile.

15 Meccanismo proteolitico mediato da ubiquitina

16 La fosforilazione e la degradazione regolate di proteine controllano la progressione attraverso il ciclo cellulare. Fosfatasi defosforilano le proteine che formano i complessi di pre-replicazione = Complessi chinasi ciclina-dipendenti (Cdk) = Complessi che poliubiquitinano substrati specifici

17 I fattori di crescita Negli organismi superiori, il controllo del ciclo cellulare viene realizzato regolando la sintesi e l attività dei complessi Cdk di G 1. Fattori di crescita extracellulari, detti mitogeni, inducono la sintesi dei complessi Cdk di G 1. Una volta che i mitogeni hanno agito per un tempo sufficiente, il ciclo cellulare procede con la mitosi anche quando essi vengono rimossi. Il punto verso la fine della fase G 1, oltre il quale il passaggio attraverso il ciclo cellulare diventa indipendente dai mitogeni è detto punto di restrizione.

18 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

19 Per identificare ed isolare le proteine che controllano il ciclo cellulare sono stati utilizzati diversi metodi sperimentali. Cellule in coltura Il lievito Saccharomyces cerevisiae che si divide per gemmazione Il lievito Schizosaccharomyces pombe che si divide per scissione Xenopus laevis

20 Fattori diffusibili regolano il ciclo cellulare Se cellule in interfase (G 1, S o G 2 ) vengono fuse con cellule in mitosi, il loro involucro nucleare si frammenta in vescicole ed i loro cromosomi si condensano Ora sappiamo che questi fattori diffusibili sono i complessi Cdk mitotici Fusione di cellule mitotiche con cellule interfasiche in G 1 Analoghi esperimenti hanno portato ad identificare fattori diffusibili di una cellula in fase S (poi definiti come complessi Cdk della fase S) che possono indurre la sintesi del DNA in un nucleo di una cellula in G 1 ma non in quello di una cellula in G 2.

21 Visualizzazione di cellule in fase S mediante autoradiografia dopo somministrazione di 3 H-timidina Se cellule in G 1 vengono fuse con cellule in fase S e se le cellule fuse vengono esposte a timidina marcata con un radioisotopo, la radioattività viene incorporata nel DNA dei nuclei in G 1, indicando che poco dopo la fusione in questi nuclei inizia la sintesi del DNA. Esempio di visualizzazione di cellule in fase S dopo trattamento con 3 H-timidina

22 Visualizzazione di cellule in fase S dopo somministrazione dell analogo artificiale della timidina bromo-deossiuridina (BrdU) mediante colorazione con anticorpi anti-brdu

23 Per identificare i fattori che controllano l entrata delle cellule nelle fasi S e M del ciclo cellulare sono stati necessari esperimenti genetici e biochimici

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25 Analisi genetica utilizzata per identificare mutanti temperatura-sensibili del ciclo cellulare nei lieviti

26 I mutanti temperatura-sensibili che presentano difetti di proteine necessarie per il passaggio attraverso il ciclo cellulare sono facilmente riconoscibili al microscopio e possono pertanto essere isolati agevolmente. 23 ºC 36 ºC Le cellule figlie di S. cerevisiae vengono generate attraverso la formazione di una gemma, le cui dimensioni aumentano rispetto a quelle della cellula parentale nel corso del ciclo cellulare Le cellule mutanti di S. cerevisiae che presentano un difetto del ciclo cellulare sono facilmente identificabili in quanto, alla temperatura non permissiva, il loro ciclo cellulare si arresta durante il processo di gemmazione. Queste cellule sono chiamate mutanti cdc (cell-division cycle, ciclo di divisione cellulare)

27 I mutanti temperatura-sensibili che presentano difetti di proteine necessarie per il passaggio attraverso il ciclo cellulare sono facilmente riconoscibili al microscopio e possono pertanto essere isolati agevolmente.

28 I mutanti temperatura-sensibili che presentano difetti di proteine necessarie per il passaggio attraverso il ciclo cellulare sono facilmente riconoscibili al microscopio e possono pertanto essere isolati agevolmente. Le cellule di S. pombe aumentano la lunghezza e in seguito si dividono nella parte centrale per produrre le cellule figlie In questi lieviti i mutanti cdc crescono senza dividersi e formano cellule estremamente allungate. Altri mutanti di chiamati wee ( piccolo in scozzese) si dividono prima che la cellula abbia raggiunto la lunghezza normale, formando cellule che sono più corte

29 Procedimento per isolare i geni normali del ciclo di divisione cellulare (CDC) da cellule di S. cerevisiae che possiedono mutazioni di questi geni recessive e sensibili alla temperatura

30 Procedimento per isolare i geni umani che controllano il ciclo di divisione cellulare human cdna human cdna Poichè molte delle proteine che regolano il ciclo cellulare sono estremamente conservate, spesso i cdna umani clonati in vettori di espressione di lievito possono complementarsi con il DNA di cellule di lievito con mutazioni che influenzano il ciclo cellulare, consentendo di isolare i geni umani che codificano per proteine che controllano il ciclo cellulare.

31 Per effettuare studi biochimici è necessario preparare estratti cellulari a partire da molte cellule. Per gli studi biochimici sul ciclo cellulare sono particolarmente adatti uova ed embrioni precoci di anfibi ed invertebrati marini. In questi organismi numerosi cicli cellulari sincroni fanno seguito alla fecondazione di uova di grandi dimensioni. Isolando un gran numero di uova dalle femmine e facendole contemporaneamente fecondare mediante l aggiunta di spermatozoi (o trattandole in modo da simulare la fecondazione), i ricercatori possono ottenere gli estratti necessari per l analisi delle proteine e delle attività enzimatiche che regolano il ciclo cellulare

32 Studi biochimici su ovociti, uova ed embrioni precoci

33 Un uovo maturo di Xenopus, pronto per essere fecondato

34 Crescita dell oocita e segmentazione dell uovo di Xenopus

35 Meiosi

36 Maturazione e attivazione dell uovo di Xenopus

37 Il fattore che promuove la maturazione degli ovociti (MPF, maturation-promoting factor)

38 Saggio dell MPF mediante iniezione in oocita di Xenopus L MPF (Maturation promoting factor) può essere individuato in quanto determina il passaggio dell oocita nella fase M.

39 Oscillazioni dell attività dell MPF durante i cicli cellulari meiotici degli ovociti di Xenopus e delle cellule di embrioni precoci di rana cicli mitotici sincroni

40 L MPF promuove la mitosi delle cellule somatiche L attività di MPF, inizialmente identificata nelle rane, è stata evidenziata nelle cellule somatiche di tutte le specie sottoposte al saggio. Se il citoplasma di cellule somatiche di mammifero in coltura bloccate in mitosi (per es. con colchicina che inibisce l assemblaggio dei microtubuli), viene iniettato in ovociti di Xenopus bloccati in G 2, gli ovociti maturano in uova. Se il citoplasma di cellule somatiche di mammifero, bloccate in mitosi viene iniettato in cellule interfasiche, queste ultime intraprendono la mitosi. L MPF è pertanto il fattore diffusibile identificato per la prima volta in esperimenti di fusione cellulare, che promuove l entrata in mitosi. MPF sta anche per fattore che promuove la mitosi (mitosis-promoting factor)

41 L MPF è un dimero di una ciclina mitotica e di una chinasi ciclina-dipendente (cdk). L aumento della concentrazione dell MPF richiede la sintesi di nuove proteine Studi biochimici con uova ed embrioni di riccio di mare ed altri invertrebati marini hanno portato all identificazione della componente ciclina dell MPF, la ciclina B. Analogamente a quanto avviene negli embrioni precoci di rana, nell embrone precoce di riccio di mare i primi cicli cellulari avvengono in modo sincrono

42 L MPF è un dimero di una ciclina mitotica e di una chinasi ciclina-dipendente (cdk). Il cdna clonato codificante la ciclina B di riccio di mare fu utilizzato come sonda per isolare il cdna omologo che codifica la ciclina B di Xenopus laevis. Il western blot di MPF purificato da uova di Xenopus, eseguito utilizzando l anticorpo preparato contro la cilclina B di Xenopus, dimostrò che una delle subunità di MPF è in effetti la ciclina B La subunità catalitica è stata identificata mediante esperimenti genetici effettuati su lieviti.

43 L estratto di uovo di Xenopus: un formidabile sistema sperimentale Tutte le componenti cellulari necessarie per i primi cicli cellulari che seguono la fecondazione sono immagazzinate nelle uova non fecondate. In particolare tutti gli mrna necessari per le prime divisioni cellulari sono già presenti nell uovo non fecondato

44 L estratto di uovo di Xenopus: un formidabile sistema sperimentale (b) Se la cromatina ottenuta da uno spermatozoo interfasico di rana viene aggiunta ad un estratto di uovo di Xenopus, attorno alla cromatina si compone un involucro nucleare e in tal modo si forma un nucleo aploide Il DNA dello spermatozoo quindi si replica Dopo la replicazione, i cromosomi dello spermatozoo si condensano e l involucro nucleare si frammenta in vescicole, proprio come accade nelle cellule intatte che intraprendono la mitosi 10 dopo la frammentazione dell involucro, tutta la ciclina B viene degradata repentinamente come accade nelle cellule intatte durante l anafase Dopo la degradazione della ciclina, i cromosomi si decondensano ed attorno ad essi si riforma l involucro nucleare, come avviene nelle cellule intatte alla fine della mitosi. Dopo circa 20 il ciclo comincia di nuovo

45 Studio del ciclo cellulare in un sistema acellulare

46 Il livello di ciclina B e l attività dell MPF variano di pari passo in estratti di uova di Xenopus in ciclo - sequenza di distruzione = eventi mitotici precoci (condensazione cromosomi, frammentazione involucro nucleare) = eventi mitotici tardivi ( decondensazione cromosomi, ricomposizione involucro nucleare) La ciclina B è una proteina fondamentale per l attività dell MPF

47 La degradazione delle cicline mitotiche, mediata dall ubiquitina, promuove l uscita dalla mitosi Nelle cellule animali esistono 3 tipi di cicline mitotiche che possono agire come la ciclina B (A, B1 e B2). Tutte le cicline mitotiche sequenziate contengono una sequenza omologa vicino all estremità amminica, la sequenza di distruzione.

48 L ubiquitina etichetta le proteine destinate alla distruzione L ubiquitina, una piccola proteina di 8,5 kd altamente conservata presente in tutte le cellule eucariotiche è il segnale che identifica le proteine destinate alla distruzione. Il residuo di glicina in posizione carbossiterminale dell ubiquitina si lega covalentemente ai gruppi ε-amminici di alcuni residui di lisina della proteina destinata alla degradazione.

49 Il legame isopeptidico che lega l ubiquitina alla proteina bersaglio L energia per la formazione del legame isopeptidico proviene dall idrolisi dell ATP Il legame è detto isopeptidico perché coinvolge i gruppi ε-amminici e non α- amminici.

50 Coniugazione dell ubiquitina Cys Cys Cys 1) L enzima attivatore dell ubiquitina E1 (enzima di attivazione), adenila l ubiquitina (Ub) e la trasferisce a uno dei suoi residui di cys. 2) L ubiquitina è poi trasferita a un residuo di cys di un secondo enzima (E2 - enzima di coniugazione) che coniuga l ubiquitina. 3) L ubiquitina-proteina ligasi o E3 trasferisce l ubiquitina a un gruppo ε-amminico della proteina bersaglio.

51 Il legame con un unica molecola di ubiquitina rappresenta un segnale debole di degradazione. La combinazione con l ubiquitina è una reazione progressiva: catene di poliubiquitina si generano mediante il legame del gruppo ε- amminico del residuo 48 di una molecola di ubiquitina e il carbossiterminale di un altra. Tetraubiquitina Le catene di 4 o più molecole di ubiquitina rappresentano un segnale efficace di degradazione.

52 La degradazione delle cicline mitotiche, mediata dall ubiquitina, promuove l uscita dalla mitosi L addizione di ubiquitina ad una ciclina mitotica richiede 3 tipi di enzimi, E1 (enzima di attivazione), E2 (enzima di coniugazione) ed E3 (ubiquitina ligasi). La E3 per la ciclina B, che rende questa proteina bersaglio della poliubiquitinazione, è il complesso che promuove l anafasel (APC).

53 Il proteasoma digerisce le proteine associate all ubiquitina A ciascuna estremità dell unità catalitica 20S è attaccato un cappuccio 19S con funzioni regolatrici

54 Il proteasoma 20S

55 Evoluzione del proteasoma

56 La regolazione dell attività di APC controlla la degradazione della ciclina B Quando, durante la metafase, l attività dell MPF raggiunge il massimo, MPF fosforila ed in tal modo attiva APC. La degradazione della ciclina B da parte dell APC diminuisce l attività dell MPF; una proteina fosfatasi può pertanto rimuovere i gruppi fosfato dall APC riducendone l attività. L APC viene ulteriormente inattivato nella G 1 avanzata del successivo ciclo cellulare mediante fosforilazione da parte del complesso Cdk della fase G 1.

57 Studi genetici su Schizosaccharomyces pombe L identificazione della subunità catalitica dell MPF ed ulteriori delucidazioni sulla sua regolazione sono derivati dagli studi genetici sul ciclo cellulare del lievito S. pombe, che si riproduce per scissione

58 Il lievito Schizosaccharomyces pombe che si divide per scissione Nota: in S. pombe ed in altri lieviti, durante la mitosi, l involucro nucleare non si frammenta

59 Due classi di mutazioni producono in S. pombe cellule allungate o cellule molto piccole Le cellule di S. pombe aumentano la lunghezza e in seguito si dividono nella parte centrale per produrre le cellule figlie. In questi lieviti i mutanti cdc, che non riescono a passare attraverso una delle fasi del ciclo cellulare, crescono senza dividersi e formano cellule estremamente allungate. Altri mutanti, chiamati wee ( piccolo in scozzese), si dividono prima che la cellula abbia raggiunto la lunghezza normale, formando cellule che sono più corte. I mutanti wee spesso mancano delle proteine che impediscono alle cellule di dividersi se troppo piccole.

60 Fenotipi mutanti cdc2 di S. pombe Mutazione recessiva Mutazione dominante con fenotipo wee Generalmente, i fenotipi recessivi sono il risultato della perdita della funzione della protena normale, mentre i fenotipi dominanti sono dovuti ad un incremento della funzione della proteina. L assenza dell attività della Cdc2 impedisce l entrata in mitosi delle cellule, un aumento dell attività della Cdc2 Copyright porta (c) by W. alla H. Freeman mitosi and Company prima del normale.

61 L eterodimero Cdc2-Cdc13 di S. pombe è equivalente all MPF di Xenopus (Cdc2 è cdk, Cdc13 è la ciclina B) Il gene cdc2 + non mutante è stato identificato per la sua capacità di complementare i mutanti cdc2 - e presentava omologia con le protein chinasi degli eucarioti. Un cdna umano codificante una proteina omologa alla Cdc2 di S. pombe è in grado di complementare i mutanti cdc2 - Anche l MPF purificato da uova di Xenopus fu saggiato come proteina chinasi. L altra subunità dell MPF di Xenopus, oltre alla ciclina B, aveva le stesse dimensioni di Cdc2 e cross-reagiva con anticorpi prodotti contro la regione della Cdc2 conservata nella proteina omologa umana. Quindi, l MPF di Xenopus è un eterodimero formato dalla ciclina B e da una proteina chinasi simile alla Cdc2 di S. pombe. Un secondo gene cdc di S. pombe (cdc13 + ) codifica per una proteina omologa alla ciclina B di riccio di mare e di Xenopus. In S. pombe, l MPF è costituito dall eterodimero formato da Copyright Cdc13 (c) by W. H. Freeman e Cdc2 and Company

62 Altri geni influenzano l attività protein-chinasica dell MPF di S. pombe Le sequenze dedotte di Cdc25 e Wee1 e gli studi biochimici hano dimostrato che queste proteine regolano l attività di MPF fosforilando e defosforilando specifici siti regolatori di Cdc2, la subunità catalitica. Cdc25 stimola l attività dell MPF di S. pombe, Wee1 è una proteina chinasi Cdc25 è una proteina fosfatasi Wee1 la inibisce

63 La fosforilazione della subunità catalitica regola l attività chinasica dell MPF Tirosina 15 = residuo inibitorio Treonina 161 = residuo stimolatorio Chinasi che attiva la Cdc2 (Cdc2-activating kinase) La Cdc13 (ciclina M) contribuisce alla specificità del legame con i substrati formando parte della superficie di legame per i substrati, che comprende anche il residuo Y15

64 Attivazione di M-Cdk

65 Le variazioni conformazionali indotte dal legame della ciclina e dalla fosforilazione aumentano l attività dell MPF Sito attivo Sito attivo ATP ATP Ansa T Ansa T Treonina 161, stimolatoria Cdk2 di uomo libera, inattiva e non legata alla ciclina A Complesso Cdk2-ciclina A non fosforilato ed a bassa attività. Complesso Cdk2-ciclina A fosforilato ed a elevata attività. Il residuo inibitorio (Tyr15) si trova in una regione della proteina a cui si legano i gruppi fosfato dell ATP. La fosforilazione di questo residuo impedisce il legame dell ATP.

66 Attività equivalenti a quelle di Wee1 e di Cdc25 di S. pombe sono stati identificati anche in altre specie Enzimi con attività equivalenti a quelle di Wee1 e di Cdc25 di S. pombe sono stati identificati negli estratti di uova in divisione di Xenopus. In Xenopus, durante l interfase, l attività di Wee1 è elevata, mentre l attività di Cdc25 è bassa; l MPF, assemblato a partire da Cdc2 e dalla ciclina B neosintetizzata, viene così mantenuto nello stato inattivo. Quando gli estratti danno inizio agli eventi della mitosi, l attività della Wee1 diminuisce, mentre l attività della Cdc25 aumenta, così che MPF viene convertito nella forma attiva. Le attività di Wee1 e Cdc25 devono essere opportunamente regolate perchè le cellule possano regolarmente passare attaverso i cicli cellulari.

67 Meccanismi molecolari nella regolazione degli eventi mitotici Abbiamo visto come un aumento regolato dell attività dell MPF induce l entrata in mitosi delle cellule. L entrata in mitosi è una conseguenza della fosforilazione di proteine specifiche da parte dell attività chinasica dell MPF. Solo alcuni dei substrati dell MPF sono noti.

68 La struttura della lamina nucleare Il doppio strato lipidico della membrana nucleare interna è sostenuto dalla lamina nucleare, costituita dalle tre lamine A, B e C. Le lamine A e C sono derivate dallo stesso gene mediante splicing alternativo La lamina B, codificata da un gene differente, è legata, mediante un gruppo isoprenilico alla membrana nucleare interno.

69 Come tutte le proteine dei filamenti intermedi le lamine nucleari possiedono un dominio centrale conservato e sono organizzate in filamenti in modo analogo. Le lamine formano dimeri che contengono un dominio centrale a forma di bastoncino, costituito da α-eliche superavvolte, e 2 domini globulari, uno testa e uno coda. I dimeri, attarverso interazioni testa-testa e coda-coda, polimerizzano e formano i filamenti intermedi che formano la lamina nucleare.

70 La fosforilazione, in corrispondenza di residui di serina, delle tre lamine nucleari da parte dell MPF provoca la frammentazione dell involucro nucleare.

71 Dimostrazione sperimentale che la fosforilazione della lamina A nucleare è necessaria per la depolimerizzazione delle lamine che contribuisce alla frammentazione dell involucro nucleare durante la mitosi. Colorazione: Anticorpo monoclonale marcato per fluorescenza specifico per la lamina A umana e colorante fluorescente che si lega al DNA. Cellule di criceto in coltura Nel mutante, residui di alanina sostituiscono i residui di serina che normalmente vengono fosforilati nella lamina A normale. In presenza di questo mutante l involucro Copyright (c) by W. H. nucleare Freeman and Company non si frammenta.

72 L attività fosfatasica è necessaria per il riassemblaggio dell involucro nucleare La rimozione dei fosfati dalle lamine durante la telofase coincide con la loro ripolimerizzazione e con la ricomposizione della lamina nucleare associata ai nuclei delle cellule figlie. Al termine dell anafase anafase, quando l MPF viene inattivato, fosfatasi specifiche rimuovono i fosfati regolatori dalle lamine e permettono il riassemblaggio della lamina e dell involucro nucleare. Le vescicole derivate dalla frammentazione dell involucro nucleare si associano inizialmente alla superficie dei cromosomi in fase di decondensazione e formano due membrane continue intorno a ciascun cromosoma. La fusione di questi mininuclei, detti cariomeri, associati a ciascun polo del fuso porta alla formazione dei nuclei delle cellule figlie.

73 La fosforilazione delle proteine SMC (structural maintenance of cromosomes) è responsabile della condensazione dei cromosomi Le proteine SMC (structural maintenance of chromosome), identificate originariamente in S. cerevisiae e poi anche in Xenopus, fanno parte di un complesso proteico chiamato condensina. Esperimenti di immunoprecipitazione hanno dimostrato che se la condensina viene rimossa da un estratto di uovo di Xenopus utilizzando anticorpi anti-smc, l estratto perde la capacità di promuovere la condensazione della cromatina di spermatozoo ad esso aggiunta. In vitro, la condensina fosforilata è in grado di legare il DNA attraverso una reazione che richiede l idrolisi di ATP e ne determina l avvolgimento in superelica. Modello proposto: l MPF o una proteina da esso regolata, fosforilano la condensina ed inducono la condensazione dei cromosomi.

74 Condensina Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) La condensina, costituita da 5 subunità,, può formare una struttura ad anello che in qualche modo utilizza l energia fornita dall idrolisi dell ATP per promuovere il compattamento dei cromatidi fratelli. La condensina è in grado di modificare l avvolgimento l delle molecole di DNA in provetta e la fosforilazione delle subunità da parte di M-Cdk stimola questa attività.

75 L inizio dell anafase dipende anche dalla poliubiquitinazione di altre proteine oltre alla ciclina B I cromosomi sono evidenziati con un colorante fluorescente che lega il DNA, i microtubuli che costituiscono il fuso mitotico sono evidenziati mediante l aggiunta di tubulina marcata con rodammina fluorescente La degradazione della ciclina B è necessaria per la depolimerizzazione dei microtubuli del fuso e per la decondensazione dei cromosomi durante la telofase. La degradazione della ciclina B, e la conseguente inattivazione dell MPF, non sono necessarie per la segregazione dei cromosomi durante l anafase

76 Un peptide derivato dalla ciclina B, contenente la sequenza di distruzione (aa ) è in grado di inibire la segregazione dei cromosomi. Interpretazione: Il peptide funge da inibitore competitivo della poliubiquitinazione di proteine bersaglio la cui degradazione è necessaria per la segregazione dei cromosomi.

77 La coesione dei cromatidi fratelli dipende da un grande complesso proteico detto coesina, che è depositato in molti punti lungo l asse maggiore di ogni cromatide fratello mentre il DNA viene replicato in fase S. Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

78 L anafase inizia con l improvvisa l rottura della coesione fra i cromatidi fratelli, che permette la loro separazione e il movimento a poli opposti del fuso Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

79 La separazione dei cromatidi fratelli dipene dall APC e dà inizio all anafase I cromatidi fratelli sono tenuti insieme da complessi multiproteici chiamati coesine, costituiti, tra l altro anche da membri della famiglia delle SMC. Il funzionamento delle coesine viene regolato dalla securina, che previene la degradazione delle coesine da parte della proteasi separasi. La securina è una delle proteine bersaglio della poliubiquitinazione diretta dall APC APC. La degradazione della securina porta alla degradazione delle coesine e permette la segregazione dei cromosomi.

80 Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

81 Controllo della proteolisi da parte di APC/C L attivazione di APC/C richiede la proteina Cdc20. La sintesi di Cdc20 aumenta quando la cellula si avvicina alla mitosi, a causa di un aumento di trascrizione del suo gene. La fosforilazione di APC/C aiuta il legame di Cdc20 contribuendo a creare un complesso attivo. Tra le chinasi che fosforilano APC/C vi è M-Cdk

82 L APC/C è attivato in mitosi dall associazione con la subunità attivante Cdc20, che riconosce sequenze amminoacidiche specifiche sulla ciclina M e su altre proteine bersaglio Figure 17-20a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

83 L APC controlla l entrata in anafase e l uscita dalla mitosi Cdc20 Cdc 20 (?) + Cdh1 Securina E importante che la ciclina B sia inattivata dopo le securine e quindi che l MPF sia attivo sino alla fine dell anafase, per mantenere i cromosomi condensati sino a quando non sono segregati. Probabilmente il fattore Cdc20 che indirizza APC/C alla securina è diverso e viene attivato prima del

84 Cdc20-APC Nei cicli embrionali precoci,, l attivitl attività Cdc20-APC/C sale alla fine della metafase, scatenando la distruzione della ciclina M. L attività M-Cdk stimola Cdc20-APC/C e pertanto la perdita della ciclina M porta all inattivazione di APC/C dopo la mitosi e quindi permette nuovamente l accumulo l delle cicline M

85 Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

86 Cdh1-APC In cellule che contengono una fase G 1, è presente un altra proteina che attiva APC/C, Cdh1,, stretto parente di Cdc20. Mentre il complesso Cdc20-APC/C è attivato da M- Cdk,, il complesso Cdh1-APC/C è inibito da M-Cdk, che fosforila Cdh1 direttamente. La caduta dell attivit attività M-Cdk alla fine della Mitosi porta nelle cellule che hanno una fase G1 e esprimono Cdh1, all attivazione attivazione di Cdh1-APC/C con conseguente soppressione costante dell attivit attività delle M-Cdk richiesta in G 1.

87 Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

88 Durante la citocinesi, i filamenti di actina e di miosina che costituiscono l anello contrattile scorrono uno sull altro per formare il solco di divisione.

89 L attività fosfatasica è necessaria per la citochinesi All inizio della mitosi, l MPF fosforila la catena leggera della miosina, inibendo la sua capacità di associarsi con I filamenti di actina L inattivazione dell MPF verso la fine dell anafase anafase, permette alle fosfatasi costitutive di defosforilare la miosina ed attivare quindi l apparato contrattile La citochinesi non può avvenire prima del completamento dell anafase anafase!

90 Il lievito che si divide per gemmazione Saccharomyces cerevisiae Nel lievito S. cerevisiae, così come nella maggioranza delle cellule dei vertebrati, la decisione principale che determina se la cellula si dividerà o no è la decisione di entrare nella fase S. Le cellule di S. cerevisiae si dividono per gemmazione. Quando le cellule in G 1 sono cresciute a sufficienza, avviano un programma di espressione genica che porta all entrata nella fase S. Il punto della fase G 1 avanzata oltre il quale le cellule di S. cerevisiae in fase di crescita sono irreversibilmente destinate ad entrare nella fase S ed a passare attraverso il ciclo cellulare, anche se trasferite in un mezzo povero di nutrienti, viene chiamato punto di partenza (START).

91 Il ciclo cellulare del lievito che si divide per gemmazione Saccharomyces cerevisiae

92 Cdc28 di S. cerevisiae è funzionalmente equivalente a Cdc2 dis. pombe Tutte le cellule di S. cerevisiae che possiedono una mutazione di un particolare gene cdc alla temperatura non permissiva si arrestano con una gemma di dimensione caratteristica. Ogni tipo di mutante esprime un fenotipo finale caratterizzato da determinate dimensioni della gemma: Nessuna gemma = cdc28 Il comportamento fenotipico dei mutanti temperatura-sensibili cdc28 dimostra che la funzione della Cdc28 è fondamentale per l entrata nella fase S: alla temperatura non permissiva le cellule cdc28 bloccate in G 1 continuano a crescere ma non formano la gemma, non sintetizzano il DNA e non duplicano il corpo polare del fuso; queste cellule, cioè, non possono passare attraverso il punto START ed entrare nella fase S. Il gene CDC28 normale è stato isolato sfruttando la sua capacità di complementare cellule cdc28 alla temperatura non permissiva. La proteina da esso codificata è omologa alle note proteine chinasi e se espressa in E. coli esibiva attività chinasica Le proteine Cdc2 di S. pombe e Cdc28 di S. cerevisiae presentano notevole omologia e il gene CDC28 di S. cerevisiae può complementare un mutante cdc2 - di S. pombe. Ciascun ceppo di lievito contiene una sola proteina chinasi ciclina-dipendente dipendente: S. pombe la Cdc2 e S. cerevisiae la Cdc28.

93 Differenze nella fisiologia dei lieviti S. pombe e S. cerevisiae. Anche se cdc2 + e CDC28 codificano proteine chinasi ciclina-dipendenti equivalenti, alla temperatura non permissiva i fenotipi mutanti sono diversi: la maggior parte delle cellule cdc2 - di S. pombe si arrestano in G 2 la maggior parte delle cellule cdc28 di S. cerevisiae si bloccano in G 1. Nelle cellule di S. pombe il controllo del ciclo cellulare viene esercitato soprattutto a livello della transizione G 2 M (entrata in mitosi) In S. cerevisiae la regolazione del ciclo cellulare viene esercitata principalmente a livello della transizione G 1 S (entrata nella fase S) Molti mutanti cdc2 -, alla temperatura non permissiva conservano un attività della Cdc2 tale da consentire l entrata in fase S, ma non sufficiente a permettere l entrata in mitosi; tali cellule si arrestano in G 2. Al contrario cellule cdc28 parzialmente difettive si arrestano in G 1. L osservazione che le cellule completamente difettive sia cdc2 - che cdc28 si bloccano in G 1 o in G 2 dimostra che : la Cdc2 e la Cdc28 sono necessarie sia per l entrata nella fase S che per l entrata in mitosi.

94 Un fattore che promuove la fase S in S. cerevisiae? Se il fattore che promuove la mitosi (MPF) è formato da due subunità, una proteina chinasi ed una ciclina mitotica è possibile che: 1) in S. cerevisiae esiste un fattore che promuove la fase S (SPF, S phasepromoting factor) che fosforila e regola le proteine necessarie per la sintesi del DNA 2) l SPF è un eterodimero formato da Cdc28 e da una ciclina che agisce nella fase G 1? Come identificare queste cicline della fase G 1.

95 Test genetico per identificare i geni delle cicline della fase G 1, basato sulle ipotetiche interazioni tra la Cdc28 e le cicline della fase G 1, in cellule normali e sensibili alla temperatura. I ricercatori si sono messi alla ricerca di un gene che, se espresso ad alti livelli, potesse sopprimere alcune mutazioni cdc28 sensibili alla temperatura

96 Tre cicline della fase G 1 si associano alla Cdc28 per formare i fattori che promuovono la fase S Sono stati isolati due geni per le cicline della fase G 1, CLN1 e CLN2, in grado di complementare mutanti cdc28. Con un approccio diverso è stato identificato anche un terzo gene che codifica per una ciclina della fase G 1 il gene CLN3. I tre geni codificano proteine affini che mostrano omologie con le cicline mitotiche. Esperimenti di Knockout hanno dimostrato che le cellule di S. cerevisiae possono crescere in un mezzo ricco se possiedono uno qualsiasi dei tre geni CLN. I complessi formati dalla Cdc28 e dalle tre cicline di G 1 (Cln1, Cln2 e Cln3) di S. cerevisiae possiedono attività di protein chinasi e sono i fattori che promuovono l entrata in fase S (SPF).

97 Le cicline della fase G 1 si associano alla Cdc28 per formare i fattori che promuovono la fase S La Cln3 viene espressa ad un livello pressocchè costante durante il ciclo cellulare Cln1 e Cln2 vengono espresse durante la seconda metà della G 1, durante la quale la loro concentrazione aumenta rapidamente, raggiungendo il massimo all inizio della fase S, per diminuire dopo, tanto da risultare assenti all inizio della mitosi.

98 Le cicline di G 1 (Cln1, Cln2 e Cln3) regolano l entrata nella fase S delle cellule di S. cerevisiae G 1 G 2 Cellule colorate con un colorante fluorescente che si lega al DNA separate con citofluorimetro a flusso La sovrapproduzione di una delle proteine Cln diminuisce la frazione delle cellule in G 1. In assenza delle proteine Cln le cellule si arrestano in G 1. L eterodimero Cdc28-ciclina della fase G 1 è necessario per l entrata delle cellule nella fase S

99 L attività chinasica dei complessi Cdc28-ciclina della fase G 1 preparano le cellule per la fase S. L attività del complesso Cdc28-Cln3 viene regolata, con meccanismo non ancora completamente definito, dalle dimensioni raggiunte dalla cellula. Il complesso Cdc28-Cln3 fosforila e attiva due fattori di trascrizione, SBF e MBF, attivando conseguentemente i geni CLN1 e CLN2, oltre ad altri geni necessari per la replicazione del DNA. Uno dei substrati dei complessi Cdc28-Cln1 e Cdc28-Cln2 èilfattore che promuove l anafase (APC), che, attivato durante la mitosi dall azione dell MPF, viene inattivato da questa nuova fosforilazione nella fase tardiva della G 1 (fosforilano e inattivano Cdh1-APC/C). Anche i due geni per le cicline di tipo B (cicline della fase S), CLB5 e CLB6, sono attivati dall MBF a partire dalla G 1 avanzata. Le proteine Clb5 e Clb6 si accumulano grazie all inattivazione dell APC, che altrimenti ne causerebbe la degradazione.

100 L inibitore della fase S, Sic1 Gli eterodimeri Cdc28-Clb5 e Cdc28-Clb6 (cicline della fase S) vengono inattivati dal legame della Sic1, che viene espressa verso la fine della mitosi e l inizio della G 1. La Sic1 funge da inibitore della fase S, inibendo in modo specifico i complessi Cdc28-ciclina di tipo B, ma non i complessi Cdc28- ciclina della fase G 1 (Cln1, -2 e -3). Le cellule entrano nella fase S quando Sic1 viene rapidamente degradato, dopo la sua poliubiquitinazione da parte del complesso Cdc34- SCF. Dopo la degradazione della Sic1, le Cdc28-Clb5 e Cdc28-Clb6 chinasi inducono la sintesi del DNA a partire dalle origini di replicazione, fosforilando substrati ancora non tutti identificati

101 La degradazione dell inibitore della fase S Sic1 induce la replicazione del DNA Cdc34= enzima per la coniugazione dell ubiquitina (E 2 ); SCF = ubiquitina ligasi (E 3 )

102 I coplessi di poliubiquitinazione e la regolazione del ciclo cellulare La proteolisi diretta da due diversi complessi per la poliubiquitinazione, il Cdc34-SCF e l APC, controllano quindi le tre principali transizioni del ciclo cellulare: l inizio della fase S, l inizio dell anafase e l uscita dalla mitosi. L APC deve essere attivato prima che l anafase possa procedere; l attività della Cdc34-SCF non è regolata direttamente, ma viene controllata avviando il suo substrato, la SIC1, alla poliubiquitinazione mediante la fosforilazione da parte del Cdc28-ciclina della fase G 1. APC ha parecchi substrati (inibitore dell anafase, cicline di tipo B), che devono essere degradati in tempi diversi durante il ciclo; l entrata nella fase S richiede la degradazione solo di Sic1. Dal momento che la degradazione delle proteine è un processo non reversibile, le cellule procedono in modo irreversibile attraverso il ciclo cellulare.

103 Cicline diverse indirizzano l attività chinasica della Cdc28 durante le varie fasi del ciclo. In S. cerevisiae, verso la fine della fase S ha inizio la trascrizione dei geni che codificano per altre due cicline di tipo B, Clb3 e Clb4, che pure si associano con Cdc28 per formare protein chinasi. Clb3 e Clb4, contribuiscono all attivazione della sintesi del DNA durante il resto della fase S ed avviano anche la formazione del fuso mitotico all inizio della mitosi. Tra la fine della fase S e l inizio della G 2 vengono quindi espresse altre due cicline di tipo B, la Clb1 e la Clb2 che agiscono come cicline mitotiche.

104 Ogni gruppo di cicline indirizza l attività chinasica della Cdc28 verso funzioni specifiche associate a varie fasi del ciclo cellulare Clnb1, 2= Cicline M Cln3= Ciclina G 1 Il Cdc28-Cln3, durante la G 1 avanzata attiva la trascrizione fosforilando ed attivando i fattori di trascrizione SBF e MBF. Le cicline Cln 1, 2 e 3 non sono sensbili alla degradazione da parte di Cdh1-APC/C I Cdc28-Cln1 e Cdc28-Cln2 inibiscono l APC (fosforilano e inattivano Cdh1- APC/C), rendendo possibile l accumulo delle cicline di tipo B, ed attivano la proteolisi di Sic1 I complessi Cdc28-Clb5, -Clb6, -Clb3 e -Clb4 inducono la sintesi del DNA I Cdc28-Clb3 e -Clb4 stimolano anche la formazione del fuso mitotico Clnb5, 6, 3 e 4= Cicline S Cln1 e 2= Cicline G 1 I complessi Cdc28-Clb1 e -Clb2 inducono la divisione nucleare.

105 La replicazione a livello di ogni origine viene iniziata soltanto una volta durante il ciclo cellulare. I cromosomi eucariotici vengono replicati a partire da numerose origini, in alcune delle quali la sintesi del DNA viene avviata all inizio della fase S, mentre in altre successivamente. In nessuna delle numerose origini di replicazione la sintesi del DNA ha inizio più di una volta durante ciascuna fase S. ORC= origin recognition complex. La ORC rimane associata alle origini di replicazione durante tutte le fasi del ciclo cellulare All inizio della fase S, l attivazione del Cdc-Clb, che segue alla degradazione dell inibitore SIC1, induce l accensione delle origini di replicazione e l inibizione dell assemblaggio di nuovi complessi di prereplicazione. Tale inibizione dura sino alla successiva fase G 1, quando l attività dell APC inibisce il complesso Cdc-Clb inducendo la degradazione delle cicline.

106 Il controllo della duplicazione dei cromosomi Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

107 Il controllo dell inizion della replicazione del DNA Geminin è il bersaglio di APC/C e il suo livello quindi aumenta nelle fasi S e M quando APC/C è inattivo Figure Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

108 L ORC rimane associato con un origine di replicazione per tutto il,ciclo In G1 precoce Cdc6 e Cdt1 si associano con ORC Si associa quindi il complesso MCM (elicasi( elicasi) ) formando il complesso pre-replicativo replicativo (pre-rc) Figure (part 1 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

109 S-Cdk stimola l assemblaggio di numerose proteine addizionali all origine per formare un complesso di preinizio. La DNA polimerasi e altre proteine replicative vengono reclutate all origine, MCM vengono attivati come elicasi e lo svolgimento del DNA permette l inizio della replicazione Blocco della rereplicazione Figure (part 2 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008) Geminin è il bersaglio di APC/C e il suo livello quindi aumenta nelle fasi S e M quando APC/C è inattivo

110 I componenti del pre-rc (Cdc6, Cdt1, MCM) non possono formare un nuovo pre- RC all origine fino a che M-Cdk non viene inattivato e l APC/C è attivato alla fine della Mitosi Figure (part 3 of 3) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

111 Per vedere questa immagine occorre QuickTime e un decompressore Animation.

112 Il controllo del ciclo cellulare nelle cellule dei mammiferi

113 Il controllo del ciclo cellulare nelle cellule dei mammiferi Negli organismi pluricellulari, la duplicazione cellulare viene controllata da un complesso sistema di vie di trasmissione del segnale che integrano i segnali provenienti dall ambiente extracellulare con i segnali intracellulari relativi alle dimensioni ed al programma di sviluppo delle cellule. La maggior parte delle cellule di un organismo adulto abbandona il ciclo cellulare durante la fase G 1 per differenziarsi, entrando in G 0. Alcune delle cellule differenziate possono essere indotte a rientrare nel ciclo cellulare e a dividersi (es.: fibroblasti, linfociti). Molte cellule differenziate non rientrano mai nel ciclo cellulare per duplicarsi di nuovo (cellule postmitotiche).

114 Il punto di restrizione del ciclo cellulare dei mammiferi è analogo al punto START del ciclo cellulare dei lieviti. La gran parte degli studi sul controllo delo ciclo cellulare dei mammiferi è stata condotta su cellule in coltura. Le cellule in coltura richiedono alcuni fattori di crescita polipeptidici (mitogeni) che le stimolano a compiere il ciclo cellulare. In assenza di fattori di crescita le cellule si arrestano in G 0. Se al mezzo di coltura vengono aggiunti i mitogeni, dopo ore le cellule quiescenti passano attraverso il punto di restrizione e 6-8 ore più tardi entrano nella fase S. Come il punto START nei lieviti, il punto di restrizione è il punto del ciclo cellulare oltre il quale le cellule dei mammiferi diventano impegnate ad entrare nella fase S ed a completare il ciclo cellulare.

115 Varie Cdk e cicline regolano il passaggio delle cellule di mammifero attraverso il ciclo cellulare Il punto di restrizione è analogo allo START

116 Varie Cdk regolano il passaggio delle cellule di mammifero attraverso il ciclo cellulare A differenza delle cellule di S. cerevisiae e S. pombe, che producono una sola chinasi ciclina-dipendente (Cdk) per regolare il ciclo, le cellule di mammifero utilizzano una famiglia di Cdk affini per il controllo della loro progressione attraverso il ciclo. Le principali Cdk delle cellule dei mammiferi sono: Cdk1, 2, 4 e 6. Cdk1 è stata isolata in quanto capace di complementare i mutanti cdc2 - di S. pombe (anche nota come Cdc2 umana). Cdk2 è stata isolata in quanto capace di complementare i mutanti cdc28 di S. cerevisiae. Cdk4 e Cdk6 sono state isolate in base alla loro omologia con altre Cdk. La Cdk3 e la Cdk5 non vengono espresse a livelli significativi nelle cellule dei mammiferi.

117 Varie cicline regolano il passaggio delle cellule di mammifero attraverso il ciclo cellulare Le cellule di mammifero, come le cellule di S. cerevisiae, esprimono numerose cicline. Le cicline A e B agiscono durante la fase S, durante la G 2 e all inizio della mitosi, e sono state identificate originariamente in esperimenti su cellule a replicazione sincrona da embrioni precoci di riccio di mare e di mollusco bivalve. Proteine omologhe alle cicline A e B sono state identificate in tutti gli eucarioti superiori studiati. I cdna umani codificanti tre cicline di tipo D affini tra loro e la ciclina E sono stati isolati grazie alla loro capacità di complementare cellule di S. cerevisiae mutanti in tutti e tre i geni CLN, che codificano le cicline della fase G 1. Le ciline D e E vengono espresse durante la G 1 e sono indispensabili per il passaggio attraverso il punto di restrizione.

118 La ciclina D è necessaria per il passaggio attraverso il punto di restrizione del ciclo cellulare dei mammiferi (a). 8 BrdU= bromodeossiuridina, analogo della timina

119 La ciclina D è necessaria per il passaggio attraverso il punto di restrizione del ciclo cellulare dei mammiferi Analisi 16 ore dopo l iniezione di cellule microiniettate con anticorpi di coniglio anti-ciclina D 8 ore dopo l aggiunta dei fattori di crescita Colorante per il DNA che emette una fluorescenza blu Anticorpo monoclonale coniugato con la fluoresceina,, specifico per la BrdU. Anticorpi di capra, coniugati con il rosso Texas, specifici per gli anticorpi di coniglio, utilizzati per identificare le cellule trattate con anticorpi di coniglio anti-ciclina D. Le cellule trattate con anticorpi anti-ciclina D non incorporano BrdU,, cioè non entrano in fase S

120 La ciclina D è necessaria per il passaggio attraverso il punto di restrizione del ciclo cellulare dei mammiferi (c). Una volta che le cellule hanno superato il punto di restrizione, non hanno più bisogno della ciclina D per entrare nella fase S 6-8 ore più tardi

121 Varie Cdk e cicline regolano il passaggio delle cellule di mammifero attraverso il ciclo cellulare In assenza di fattori di crescita, le cellule in G 0 in coltura non esprimono nè le cicline, nè le Cdk. I fattori di crescita inducono l uscita dalla G 0 attivando i geni che codificano per queste proteine.

122 L espressione regolata di due classi di geni permette alle cellule in G 0 di mammifero di rientrare nel ciclo cellulare. L aggiunta di fattori di crescita a cellule di mammifero bloccate in G 0 induce la trascrizione dei geni a risposta precoce. Molti dei geni a risposta precoce codificano per fattori trascrizionali (es. c-fos e c-jun). Le proteine codificate dai geni a risposta precoce inducono la trascrizione dei geni a risposta tardiva. Gli inibitori della sintesi proteica, non inibiscono l induzione dei geni a risposta precoce, ma inibiscono l espressione dei geni a risposta tardiva e la riduzione della trascrizione dei geni a risposta precoce. Alcuni geni a risposta tardiva codificano fattori di trascrizione come gli E2F, altri codificano le cicline di tipo D, la ciclina E, la Cdk2, la Cdk4 e la Cdk6. La Cdk4, la Cdk6 e le cicline di tipo D vengono espressi per prime, la Cdk2 e la ciclina di tipo E vengono espresse successivamente.

123 I geni a risposta tardiva La Cdk4, la Cdk6, le cicline di tipo D e il fattore E2F vengono espressi per primi E2F* L attivazione di E2F da parte dei complessi Cdk4 e Cdk6-ciclina D è necessaria per l attivazione dei geni per la Cdk2 e le cicline E e A

124 I fattori di trascrizione E2F La trascrizione dei geni che codificano molte delle proteine implicate nella sintesi del DNA e dei deossiribonucleotidi viene indotto mentre le cellule procedono attraverso la transizione G1 S. La famiglia dei fattori trascrizionali E2F è necessaria per la trascrizione di molti di questi geni e di quelli che codificano la Cdk2 e le cicline A ed E. I fattori E2F, autostimolano la trascrizione dei geni da cui sono codificati. La capacità dei fattori E2F di attivare la trascizione viene inibita se essi sono legate alla proteina Rb e a due proteine ad essa affini, la p170 e la p130. Il legame con la Rb converte i fattori E2F da attivatori in repressori della trascrizione.

125 Il legame con la Rb converte i fattori E2F da attivatori in repressori, dato che la proteina Rb interagisce con i complessi delle istone deacetilasi.

126 Ruolo delle mutazioni somatiche spontanee del gene Rb nel retinoblastoma, una malattia dell infanzia caratterizzata da tumori della retina. La proteina Rb fu identificata come il prodotto del gene RB, il prototipo degli Copyright oncosoppressori. (c) by W. H. Freeman and Company

127 Regolazione dell attività di Rb e di E2F durante la fase G 1 avanzata. La fosforilazione della proteina Rb inibisce la sua funzione di repressore della trascrizione.

128 Il passaggio attraverso il punto di restrizione dipende dall attivazione dei fattori di trascrizione E2F L attivazione del complesso Cdk2-ciclina E rende indipendente l attivazione di E2F, e quindi il passaggio attraverso il ciclo cellulare, dall attività dei complessi Cdk4/6-ciclina D. La progressione ha luogo anche se i mitogeni vengono rimossi ed il livello di ciclina D diminuisce. Il punto di restrizione è stato superato! La proteina Rb viene mantenuta fosforilata durante le fasi S, G 2, e M dai complessi Cdk2- e Cdk1- ciclina. La diminuzione del livello dei complessi Cdk-ciclina al termine della mitosi porta alla defosforilazione di Rb da parte delle fosfatasi, la cui attività non è più contrastata, ed all inibizione Copyright (c) by conseguente W. H. Freeman and Company degli E2F.