De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e Genetica, II Ed. Capitolo 7. Replicazione del DNA Preparazione alla divisione Citodieresi

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1 Replicazione del DNA Preparazione alla divisione Citodieresi

2 Durata del ciclo cellulare: 24 ore nei fibroblasti; 2 ore nel lievito; 30 minuti nei procarioti

3 Quando una cellula non si divide per un periodo di tempo lungo, esce dal ciclo cellulare e va in fase G0: neuroni e cellule muscolari stazionano per tutta la loro vita in fase G0, mentre altri tipi cellulari restano per lunghi periodi in G0 per poi rientrare nel ciclo (es, epatociti e fibroblasti) Fase G1: integrazione dei segnali proveniente dall esterno, es: fattori di crescita Fase G2: integrazione dei segnali provenienti dall interno della cellula, es: verifica dell integrità del genoma La durata di queste due fasi è diversa nei vari tipi cellulari, tipicamente 9-11 ore G1 e 4 ore per G2; La fase M (mitosi) dura circa 1 ora; la fase S dura 8-10 ore. Durante lo sviluppo embrionale il ciclo è molto rapido e G1 e G2 diventano quasi indistinguibili.

4 Nei tessuti che rinnovano di continuo si osserva una rigenerazione continua per tutta la vita dell organismo. Da un lato le cellule si dividono mentre dall altro si differenziano e muoiono Nelle cellule dell epidermide le cellule a contatto con la lamina basale di dividono. Una delle due cellule figlie si differenzia, mentre l altra rimane staminale (quella che rimane in contatto con la lamina)

5 Il ciclo cellulare può essere descritto come un alternanza dei cambiamenti della ploidia. In G1 sono diploidi; in fase S la situazione è eterogenea; in G2 avranno il patrimonio cromosomico raddoppiato (4n)

6 1) Checkpoint che controlla l ingresso in fase S (transizione G1>S): controlla che il DNA sia integro e che vi siano gli elementi nutrivi necessari per la crescita cellulare (fattori di crescita). Se il checkpoint non viene superato la cellula esce dal ciclo e va in G0. 2) Checkpoint che controlla l ingresso in fase M (transizione G2>M): controlla che il DNA non abbia subito danni o mutazioni (verifica della corretta dupicazione prima di entrare in M) 3) Checkpoint che controlla il completamento della fase M (metafase > citodieresi): controlla la corretta interazione tra fuso mitotico e cromosomi ed il loro appropriato allineamento lungo la piastra metafasica

7 MPF cdc2 Esperimenti con gli eterocarionti, con gli oociti di rana e con i mutanti condizionali di lievito permisero di identificare un fattore regolativo in regolare alcuni importanti passaggi del ciclo cellulare

8 Nel lievito tra i geni Cdc il più importante è Cdc2. I mutanti si bloccavano nella transizione G1>S e G2>M. Questo gene è una serina treonina chinasi. Nell uomo esistono degli ortologhi di Cdc2 che possono complementare la mutazione nel lievito. Questo dimostra che il macchinario del ciclo cellulare è evolutivamente conservato

9 Nel riccio di mare lo zigote va incontro a rapide divisioni cellulari. Durante il ciclo, due proteine si accumulano durante l interfase per poi scomparire durante la mitosi (degradate). Per via di questa oscillazione legata al ciclo cellulare sono chiamate cicline (A e B). MPF è un complesso formato da due subunità: una catalitica (chinasica), omologa di Cdc2; ed una regolativa richiesta per l attività enzimatica che si accumula durante il ciclo cellulare, omologa delle cicline

10 Il complesso chinasi-ciclina è il fattore che promuove la mitosi; senza la ciclina la chinasi non è attiva. La chinasi è chiamata Cdk (Cyclin dependent kinase). I complessi ciclina-cdk che si formano prima della mitosi non sono attivi, ma l attività chinasica si innesca rapidamente al momento della mitosi. L attivitàdi Cdkviene controllata da chinasi.

11 Cdk in assenza di ciclina forma una struttura (Tloop) che autoinibisce il sito catalitico di Cdk. L interazione con la ciclina apre il T-loop (preattivazione). Latreonina161 che si trovava sul T-loop può essere fosforilata dacak (CdK activating kinase). Questa fosforilazione allontana ulteriormente il T- loop dal sito catalitico e rafforza l interazione con la ciclina (piena attivazione). Altri due aminoacidi sono importanti per la regolazione di Cdk:treonina14 e tirosina15. Si trovano vicino il sito catalitico e una loro fosforilazione ha una azione inibitoria. La fosforilazione di questi residui è ad opera della chinasiwee1. La deforilazione di questi residui è ad opera della fosfatasicdc25. Il dualismo tra Wee1 e Cdc25 è l ultima verifica prima dell attivazione di MPF e della transizione G2>M)

12 Il transito attraverso la mitosi si accompagna alla degradazionedella ciclina (e il conseguente spegnimento dell attività chinasica di MPF) ad opera del sistema ubiquitina-proteasoma. Durante la mitosi il complesso multiproteico APC (Anaphase Promoting Complex) promuove l ubiquitinazione della ciclina B

13 Le proteine target di MPF: Le lamine nucleari quando fosforilate depolimerizzano e consentono la vescicolazione dell involucro nucleare. GM130 dell Apparato di Golgi che provoca la frammentazione MAP4 controlla la stabilità dei microtubuli e permette la formazione del fuso mitotico. Ruolo nella compattazione della cromatina??? La fosforilazione delle condensine, proteine coinvolte nell organizzazione della struttura della cromatina

14 Nei mammiferi esistono diverse cicline e diversi Cdk. In diverse fasi del ciclo si hanno diverse combinazioni ciclina / Cdk Inoltre differenti complessi ciclina / Cdk sono in grado di modulare altri processi biologici, come il differenziamento e la trascrizione

15 Un controllore fondamentale nella transizione G1>S è costituito dal fattore di trascrizione E2F che come eterodimero (E2F-DP1) si lega ai promori di molti geni necessari per l ingresso in fase S (MYC, ciclina E, E2F). E2F/DP1 può essere associato alla proteina RB. RB ha una azione inibitoria sulla funzione di E2F. RB recluta HDAC causando un compattamento della cromatina ed una inibizione della trascrizione da parte di E2F/DP1. Quando la cellula deve progredire nel ciclo, RB viene fosforilato da complessi Cdk/cicline rilasciando così E2F/DP1. Nella fase G0. RB non è fosforilato. Mutazioni di RB (retinoblastoma) impediscono il controllo limitato del ciclo cellulare e contribuiscono alla trasformazione cancerosa. RB è anche bersaglio di alcune proteine virali (adenovirus, papillomavirus) che inducono la proliferazione cellulare attivando E2F/DP1.

16 De Leo - Fasano - Ginelli Biologia e La Genetica, rimozione II Ed. dei Capitolo fattori 7 di crescita dal terreno di coltura porta le cellule in fase G0. L aggiunta di fattori di crescita nel terreno stimola il rientro delle cellule nel ciclo. L attivazione dei recettori per i fattori di crescita causa una cascata di reazioni che porta all attivazione trascrizionale di alcuni geni (proto-oncogeni) come myc, jun e fos, regolatori della sintesi proteica e proteine del citoscheletro. Queste proteine portano successivamente alla trascrizione delle cicline D che attivano Cdk4 che fosforila RB inattivandolo. Mutazioni o iperespressione della ciclina D sono state osservate in diversi tipi di tumore (linfomi e cancro al seno)

17 Quando il DNA è danneggiato (es, rottura del doppio filamento di DNA causato da radiazioni ionizzanti) si attiva la proteina ATM (atassia telangectasia). ATM (ser-thre kinase) attiva altre chinasi, es: Chk2 (checkpoint kinase 2) Queste chinasi a loro volta fosforilano, altre proteine tra cui CDC25 etp53. CDC25 è la fosfatasi che attivampf. CDC25 fosforilata fuoriesce dal nucleo e la sua attività fosfatasica viene indebolita. CDK non viene così attivato, causando il blocco del ciclo.

18 In genere il livello di TP53 nelle cellule è molto basso per via della continua degradazione da parte del proteasoma. TP53 viene ubiquinato dalla E3 ligasi MDM2. Se TP53 è fosforilato da Chk2 viene allontanato MDM2 e TP53 si accumula rapidamente nelle cellule

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20 Uno dei target trascrizionali di TP53 èp21. P21 si lega ai complessi Cdk/ciclina inibendoli (fase G1 ed S) ed arrestando il ciclo cellulare allo scopo di riparare il DNA. Alcuni fattori extracellulari sono in grado di bloccare il ciclo, es TGF β. Quando legato al suo recettore attiva una via di trasduzione del segnale che aumenta l espressione di un inibitore del complesso Cdk4/ciclinaD (CKI) detto p15 (INK4). Questo causa l ingresso della cellula in G0 (RB non può più essere fosforilato). Mutazioni di questo gene sono state individuate nel melanoma L aumento della densità cellulare provoca un arresto del ciclo (inibizione da contatto). In questo caso viene espresso un altro CKI detto p27. In genere tutti i CKI, avendo un dominio con una struttura simile all ATP, si legano nel sito di Cdk che dovrebbe legare l ATP, pregiudicandone così la funzione.