Riproduzione e ciclo cellulare

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1 Riproduzione e ciclo cellulare

2 La capacità di riprodursi è carattere fondamentale dei viventi. Gli organismi unicellulari più semplici (es batteri ma anche eucarioti unicellulari) si riproducono per divisione cellulare. Negli eucarioti ci sono 2 tipi divisione cellulare: mitosi e meiosi. la mitosi si verifica in tutti I tipi cellulari, la meiosi invece avviene solo nelle cellule progenitrici dei gameti Negli organismi pluricellulari molte divisioni cellulari successive (mitosi) sono necessarie per: Sviluppo di organismo complesso a partire da un unica cell uovo accrescimento Omeostasi dei tessuti (rigenerazione, sostituzione cellule morte, riparazione lesioni e danni tissutali)

3 Il ciclo cellulare procariotico è relativamente semplice e rapido Nei procarioti la divisione cellulare puo essere molto rapida (anche min); durante questo arco di tempo duplicazione del cromosoma circolare adeso a membrana, estensione cellulare distacco delle due copie del cromosoma e divisione della cellula Cromosomi batterici Colorizzata TEM

4 Un tipico ciclo di divisione cellulare prevede fasi di: vaccrescimento cellulare (aumento di volume e duplicazione di organelli) vduplicazione del DNA vseparazione e distribuzione del materiale genetico vdivisione cellulare

5 Il ciclo cellulare eucariotico è una serie ordinata di eventi che si ripete allo stesso modo (conservato durante l evoluzione) e scandisce la vita cellulare terminando in genere con la divisione. Il ciclo è un alternanza tra mitosi (divisione ) ed interfase. Interfase: cellula cresce di volume, svolge attività, interagisce con ambiente est. e si prepara a divisione (circa 95% del ciclo) Divisione: evento cruciale, il più radicale ed evidente del ciclo

6 La mitosi è l unico evento chiaramente riconoscibile al microscopio ottico cambiamenti drastici: si sfalda nucleo, si condensano i cromosomi, si forma struttura citoscheletrica complessa (fuso mitotico)

7 L interfase è suddivisa in periodi in cui si svolgono specifiche attività cellulari G1: cellula metabolicamente attiva e in accrescimento, integra segnali interni ed esterni per decidere se proliferare e quindi procedere in fase S oppure entrare in quiescenza (G0) (max parte dei tessuti in q fase) S: duplicazione del materiale genetico G2: continua accrescimento e prepaparazione a divisione M: mitosi (divisione nucleare)+ citochinesi (divisione citoplasma)

8 Durata delle varie fasi Fasi S ed M hanno durata abbastanza costante per un certo organismo Es nell uomo S : 8-10 ore; M: 1 ora Fasi G1 e G2 variabili secondo tipo cellulare Per un fibroblasto in coltura in vitro durata tot ciclo circa 24 ore

9 Nelle prime fasi di sviluppo embrionale spesso cicli rapidi con G1 e G2 quasi assenti: solo veloce alternanaza tra replicazione DNA e mitosi (oganelli, macromolecole e strutture cellulari già presenti perchè precedentemente accumulate in cell uovo) In alcuni casi numerose endoreplicazioni del DNA (senza successiva divisione) cromosomi giganti

10 Negli adulti ci sono tessuti stabili e tessuti sottoposti a continuo ricambio Neuroni e cell muscolo : cell. molto specializzate in G0, hanno perso capacità di dividersi Fibroblasti e epatociti in G0 ma possono rientrare in ciclo (riparazione/rigenerazione in risposta a determinati stimoli) Tessuti dinamici: continuo ricambio per attività proliferante di cell staminali e morte delle cell differenziate

11 La divisione della cell. staminale è asimmetrica Il destino delle cell figlie influenzato da ambiente esterno: contatto con lamina basale Le cellule che iniziano percorso diffrenziativo perdono quasi del tutto capacità di dividersi e sono destinate a morte programmata

12 Metodi per lo studio del ciclo cellulare Citofluorimetria e analisi del contenuto di DNA/cellula (per cellule diploidi varia da 2n a 4n) Colorante fluorescente per DNA Popolazione cellulare analizzata al citofluorimetro (sensore misura fluoresecenza delle singole cellule, una ad una) Frazione di cellule con DNA 2n (G1) Frazione di cellule con DNA 4n (G2) e frazione con quantità intermedia (S) L altezza del picco indicativa della durata della fase

13 Un profilo a 2 picchi indica cellule proliferanti (non sincronizzate) Un singolo picco (DNA 2n) indica cellule non proliferanti (es ferme in G0 o colte tutte in G1 perchè sincrone)

14 MIcroscopia e traccianti del DNA A) Uso di traccianti radioattivi: es timidina tritiata (precursore del DNA) incorporata in fase S; radioattività passa da strato basale ad apicale epitelio intestinale B) Marcatura di cellule in fase S con BrdU (precursore del DNA al posto della timidina) e anticorpi per BrdU microscopia a fluorescenza

15 Uso di strategie/farmaci bloccanti per sincronizzare il ciclo di cellule in coltura blocco reversibile in modo da ottenere popolazioni sincronizzate Es nocodazolo: impedisce formazione microtubuli e quindi fuso mitotico blocco in M Rimozione fattori di crescita arresto in G0 Aggiunta di inbitori sintesi nucleotidi arresto in fase S

16 Modelli sperimentali per lo studio del ciclo cellulare Lievito: analisi dei geni coinvolti nel controllo del ciclo; uova di anfibio, di molluschi o di riccio di mare studi biochimici (Nurse, Hartwell e Hunt- Nobel Medicina, 2001 per studi sul ciclo cellulare)

17 La progressione del ciclo è sottoposta a rigido/raffinato sistema di controllo: transizione da fase a successiva solo dopo verifica segnali boichimici indicativi di condizioni sia intracellulari che esterne (controlli intrinseci ed estrinseci) In organismi unicellulari conta soprattutto condiz ambientale (nutrienti) in multicellulari anche segnali chimici da altre cellule (fattori solubili quali mitogeni, fattori di crescita, di sopravvivenza, ) 3 principali checkpoint il non superamento del checkpoint G1 S determina uscita dal ciclo ed ingresso in G0

18 Le transizioni avvengono solo se sono soddisfatte alcune condizioni Monitoraggio fattori nutrienti e di crescita, Controllo sullo stato del DNA (danno/riparazione, completamento replicazione) Dimensione/volume cellulare Allineamento cromosomi/aggancio sul fuso Se condizioni non soddisfatte blocco del ciclo

19 Il macchinario molecolare che regola il ciclo cell. eucariotico si basa sull interazione di 2 processi: 1) Orologio molecolare indipendente che segue le varie fasi del ciclo e si basa sul ritmico alternarsi di sintesi e degradazione delle cicline. Le cicline associandosi ad enzimi CdK (complessi ciclina-cdk) formano complessi che, grazie a loro attività enzimatica, permettono superamento dei checkpoint 2) Processo regola l orologio in base a segnali intra- ed extra-cellulari avvalendosi di proteine/enzimi che + o direttamente modulano attività di cicline e CdK NB: Il macchinario molecolare che regola il ciclo cell. eucariotico è molto conservato.

20 Diversi approcci sperimentali hanno contribuito a definire il complesso di interruttori molecolari coinvolto nel controllo del ciclo Anni 70: esperimenti di fusione cellulare tra cell di mammifero in diverse fasi del ciclo Esistenza di fattori in grado di: - indurre ingresso in mitosi - e replicazione del DNA (solo su cellule G1)

21 Effetto della fusione cellulare. La fusione di cellule in mitosi con cell in G1 e G2 induce la condensazione cromatinica; con cell in S, cromosomi sensibili si spezzano e si polverizzano (Rao e Johnson)

22 Risultati poi confermati da studi biochimici su oociti di anfibio Microiniezione di estratti proteici ottenuti da oociti in divisione (meiosi) induce meiosi Nel citoplasma di una cellula mitotica esiste un MPF (meiosis/maturation promoting factor) di natura proteica e diffusibile in grado di indurre la maturazione di oociti

23 Studi genetici su lievito: mutanti cdc (cell division cycle) temperatura sensibili A temperatura non permissiva i mutanti si bloccano in una particolare fase del ciclo Es: mut cdc28 (S. cerevisiae) si blocca in G1 cdc2 (S. pombe) si blocca in G1 e G2

24 I genicdc 28 e cdc2 codificano per enzimi-chinasi simili tra loro ortologhi trovati anche nell uomo Saggi di complementazione: gene umano introdotto in lievito mutante ripristina normale ciclo forte conservazione evolutiva del sistema di controllo del ciclo

25 Analisi proteica di estratti da uova di riccio di mare scoperta delle cicline Proteine con concentrazione citosolica oscillante /fluttuante legata ai vari stadi del ciclo

26 I diversi approcci hanno permesso identificazione biochimica di MPF (isolato da uova di anfibio) MPF è un enzima proteina-chinasi dimerico: - subunità catalitica (ortologo a cdc28 e cdc2 di lievito) CDK1 - e subunità regolatrice (ciclina B, mitotica) necessaria per sua attività ciclina

27 C è corrispondenza tra variazione di 1) fase nel ciclo cellulare 2) Attività di MPF 2) Concentrazione di ciclina

28 Infatti la chinasi (CDK1) dipende per la sua attività dalla ciclina (ecco perchè si chiama Cdk: cyclin dependent kinase) L attività kinasi quindi riflette andamento ciclico della ciclina B ma non perfettamente: infatti la cdk si attiva repentinamente solo dopo che ciclina ha iniziato ad accumularsi da un bel po!... Come mai??

29 In effetti l attività di CDK dipende: -da un lato dai livelli di ciclina -dall altro da un complesso pattern di fosforilazionedefosforilazione sulla CDK stessa (altri enzimi kinasi e fosfatasi sono coinvolti in q. sistema di regolazione). L attivazione completa è favorita con meccanismo a feedback positivo innescato dalla formazione stessa del complesso cdk-ciclina aumento esplosivo/rapido dell attività chinasica di cdk.

30 La kinasi Wee1 inibisce il complesso CDK-ciclina mentre la fosfatasi cdc25 stimola il complesso Infatti in lievito mutazione di wee1 cellule piccole (mitosi prematura) Mutazione di cdc25 cellule lunghe (mitosi ritardata)

31 L attività di CDK1 è spenta dalla degradazione ubiquitina-proteasoma-dipendente della ciclina La ubiquitinazione della ciclina è indotta dal complesso APC (anaphase promoting complex) a sua volta indotto dalla stessa CDK funzionalità di CDK quindi è limitata ad una precisa finestra temporale e CDK contribuisce al proprio spegnimento (feedback negativo)

32 Una volta attivata la CDK1 (MPF) fosforila proteine target cruciali per ingresso e progressione in fase M (CDK è una serina-treonina chinasi) Esempio - fosforila lamìne nucleari disgreagazione dell involucro nucleare - Fosforilazione delle MAP (microtubule associated protein) Riorganizzazione dei microtubuli e formazione del fuso - Fosforilazione di enzimi condensine (?) compattamento della cromatina

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34 - In lievito la stessa chinasi (gene cdc28) associandosi a diverse cicline riconosce diversi substrati e quindi regola transizione tra varie fasi del ciclo - Negli organismi multicellulari invece esistono diverse cdk e diversi complessi cdk-ciclina che regolano diverse fasi del ciclo cellulare I complessi attivi cdk-ciclina fosforilano proteine che + o direttamente presiedono ad attività/strutture necessarie per passaggio a nuova fase del ciclo

35 Le diverse cicline dei mammiferi operano in fasi diverse del ciclo

36 I vari complessi cdk-ciclina subiscono stesso schema di regolazione Oltre che dalle cicline e dalla fosforilazion/defosforilazione le CDK sono controllate anche dal legame con inibitori CKI (cdk inhibitors) Il livello dei CKI risente di segnali interni (lesioni al DNA) ed extracellulari (ormoni, fattori di crescita, contatto fisico con altre celule) anche i CKI sono degradati dal sistema ubiquitina-proteasoma

37 I CKI impediscono assemblaggio e/o attività dei complessi CDK-ciclina 2 gruppi principali di inibitori Gruppo I: inibitori che agiscono a livello di transizione G1 S e G2 M Gruppo II: inibitori che agiscono solo a livello di transizione G1 S Aumento densità di popolazione induce p27 fenomeno inibizione da contatto Fattore TGF-β induce differenziamento e ingresso in G0 inducendo p15

38 Effetto della mutazione su p27 (un CKI)

39 Nel complesso esistono ben 4 livelli di regolazione sulle CDK!!

40 La degradazione delle proteine regolative (cicline ed inibitori CKI) garantisce irreversibilità e unidirezionalità del passaggio da fase ad altra del ciclo

41 La degradazione è ubiquitina-proteasoma dipendente

42 Controllo transizione G1 S La cellula di lievito che non supera precise condizioni (danno al DNA, nutrienti, dimensioni) si arresta al punto start Analogamente la cellula di mammifero (danno DNA, contatto con cellule, fattori crescita, dimensioni, bilancio energetico) si arresta al punto di restrizione

43 Controllo transizione G1 S nei mammiferi In assenza di opportuni segnali esterni (es fattori di crescita) prb si lega a fattore trascrizionale E2F e gli impedisce di attivare trascrizione di geni necessari a transizione G1 S (es geni per duplicazione DNA, ciclina E e E2F stesso) L inattivazione trascrizionale è assicurata dal compattamento della cromatina (induce deacetilazione) Presenza di fattori di crescita trasduzione del segnale complessi CDK-ciclineD (E ed A) fosforilano prb distacco da E2F attivazione di geni utili a passaggio di fase prb è gene oncosoppressore, cioè frena la crescita cellulare Se prb muta e/o non funziona neoplasia (retinoblastoma)

44 Presenza di fatttori di crescita I ondata di espressione genica: risposta immediata precoce (vari fattori trascrizionali es proto-oncogeni c-myc, c-fos; proteine citoscheletro, ) II ondata di espressione genica:cilcine D formazione dei complessi cdkciclina e progressione ciclo Assenza fattori arresto in G0

45 Importanza dei segnali interni: integrità del DNA Sensori di danno al DNA innescano cascate di protein-chinasi che bloccano la cellula nella fase in cui si trova impedendole di proseguire e facendo in modo che concentri energie sulla riparazione del danno. Indirettamente inducono blocco della transizione G2-M (inattivando l attivatore di CDK1) Attivano p53 e quindi bloccano fase S o transizione G1-S

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47 Il danno al DNA induce il blocco della transizione G2-M perchè inattiva cdc25 (la chinasi che a sua volta attiva CDK1)

48 P53 è un gene oncosoppressore molto studiato (mutazioni a suo carico nel 50% dei tumori umani) È un fattore trascrizionale normalmente presente nella cellula a bassissimi livelli (continua degradazione ubiquitina dipendente)

49 Danno al DNA aumenta livello di p53: Alternativa 1: induzione di geni che riparano DNA e bloccano ciclo Alternativa 2 induzione di geni che portano a morte cellulare (apoptosi)

50 Blocco del ciclo mediato da p53 P53 induce la trascrizione del gene p21 codificante per inibitore CKI di vari complessi CDK-ciclina

51 Sistema di controllo fa si che DNA sia replicato una sola volta a partire da specifiche origini replicative CDK di fase S fosforila proteine complessi pre-replicazione: in questo stato richiamano enzimi replicazione (inizio sintesi) ma non possono legarsi ad altre origini replicative. Restano fosforilate per tutta fase G2 e M impossibile nuova replicazione In G1 si defosforilano riassemblaggio sulle origini replicative

52 La conoscenza dei meccanismi di controllo del ciclo svela le basi molecolari del tumore In cellule normali: mitogeni (fattori crescita) transizione G1 S In cellule tumorali il punto di restrizione perde funzionalità: cellule cancerose non hanno bisogno di segnali mitogenici esterni per transitare da G1 ad S In cellule tumorali livelli elevati ed abnormi di cicline D (epressione non più controllata da fattori esterni come di norma) In cellule tumorali mutazioni su geni tumore-soppressori che normalmente frenano il ciclo (Es. P53, prb e CKI )