L esame del liquido seminale

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1 Seminario Facoltà Scienze Biologiche 8 e 15 maggio 2012 L esame del liquido seminale Dott.ssa Giovanna Tomasi CRA Centro Riproduzione Assistita - Catania

2 Introduzione Liquido Seminale sospensione costituita dagli spermatozoi e dalla secrezione di testicoli e epididimi, dalla secrezione di prostata, vescichette seminali e ghiandole bulbouretrali. 4 Frazioni 1. pre-eiaculatoria 2.iniziale 3.principale 4.terminale 1. prodotta dalle ghiandole di Cowper e Littre, di consistenza mucosa; 2. di produzione prostatica, fluida, contiene spermatozoi. Ha ph acido, è ricca di fosfatasi acida e acido citrico; 3. costituita da una parte liquida e una parte gelatinosa, ricca di spermatozoi proviene dall epididimo, dal deferente e dall ampolla deferenziale 4. è la più abbondante, è gelatinosa, è prodotta dalle vescichette seminali, ricca in fruttosio, ha reazione alcalina.

3 Introduzione SPERMIOGRAMMA Valutare la composizione e le caratteristiche del liquido seminale, la vitalità, la motilità, la morfologia, il numero degli spermatozoi. Volume dell eiaculato Riflette il buon funzionamento dell attività secretoria delle ghiandole. Numero totale di spermatozoi Riflette la produzione di spermatozoi da parte dei testicoli e la pervietà delle vie spermatiche. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

4 Introduzione Esame del Liquido Seminale analisi qualitativa e quantitativa per fornire al medico una diagnosi, indirizzare la coppia alla ricerca consapevole di una gravidanza indagine mirata alla preservazione della fertilità in relazione a tutte quelle condizioni patologiche (neoplasie o altro) e fisiologiche che potrebbero alterarla.

5 Perché eseguire lo spermiogramma Diagnosi PMA Preservare la fertilità L esame del liquido seminale, evidenziando le varie caratteristiche e componenti di questo fluido corporeo, rappresenta ancora oggi la prima ed irrinunciabile indagine diagnostica nello studio dell infertilità maschile. Pertanto l obiettivo dell analisi seminale è da un lato ottenere una risposta rapida attraverso un esame minimamente invasivo sulle possibilità maschili di procreare, dall altro fornire una diagnosi eziologica accurata per inquadrare l infertilità nell ambito di una patologia uro-andrologica e quindi istaurare il corretto approccio terapeutico. Deve essere eseguito da personale qualificato

6 Cosa & quando? Entro 5 minuti dalla produzione del campione riporre il liquido seminale in stufa o in incubatore a 37 C perché avvenga la liquefazione Tra 30 e 60 minuti dalla produzione del campione liquefazione, aspetto e volume del liquido seminale; ph, N di spermatozoi, motilità, valutazione della vitalità. Programmare, quando richieste, altre indagini aggiuntive Entro 3 ore dalla produzione del campione inviare il campione al laboratorio di microbiologia per la ricerca di batteri o miceti. Entro 24 ore dalla produzione del campione saggiare quando richiesti i markers delle ghiandole accessorie e l immunobead test. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

7 Raccolta del campione INFORMAZIONI PRELIMINARI: Il campione deve essere prodotto tramite ipsazione nella sede in cui si svolgerà l esame: analizzato entro 30 minuti dalla eiaculazione per limitare gli effetti delle fluttuazioni della temperatura È bene eseguire l esame su tutto l eiaculato Opportuno periodo di astinenza (3 giorni) Assunzione farmaci / febbre / malessere Fornire al paziente il maggior numero di informazioni possibili, istruzioni chiare, a voce o scritte Storia clinica e anamnesi del paziente

8 Raccolta del campione INFORMAZIONI PRELIMINARI: Il campione prodotto al di fuori del laboratorio deve giungere in sede non oltre un ora dopo la sua produzione durante il trasporto il campione dovrebbe essere mantenuto tra 20 C e 37 C. Se il paziente non riesce a produrre il campione per masturbazione, è assolutamente sconsigliato l utilizzo di condom in lattice a vantaggio di condom non tossici prodotti specificatamente per la raccolta del liquido seminale. Il coitus interruptus è altamente sconsigliato perché andrà persa la prima parte dell eiaculato che contiene spermatozoi, senza considerare la contaminazione batterica del campione e l influenza del ph vaginale che potrebbe alterare la motilità degli spermatozoi. Il campione seminale deve essere raccolto in un contenitore sterile di materiale inerte.

9 In Laboratorio Esame del liquido seminale Analisi Macroscopica Analisi Microscopica Analisi qualitativa e quantitativa del liquido seminale per conoscere le sue caratteristiche in termini di volume, concentrazione e motilità nemaspermiche, caratteristiche morfologiche, vitalità nemaspermica, ricerca di anticorpi anti-spermatozoo.

10 Analisi macroscopica del liquido seminale Aspetto Un normale campione di liquido seminale ha aspetto omogeneo e opalescente. Se la concentrazione di spermatozoi è molto bassa a volte ha aspetto quasi trasparente. Il colore varia dal grigio/bianco, al giallo al rosso se sono presenti tracce di sangue.

11 Analisi macroscopica del liquido seminale Liquefazione La liquefazione è il naturale cambiamento nella consistenza del liquido seminale da semiliquido a liquido. Normalmente entro minuti a 37 C in stufa. Raramente 60 minuti o più. Il caratteristico coagulo del liquido seminale appena prodotto è il risultato di un enzima di origine prostatica su una proteina coagulabile proveniente dalla secrezione delle vescicole seminali, la sua liquefazione è determinata da un enzima di origine prostatica definito seminina. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

12 Analisi macroscopica del liquido seminale Viscosità Tendenza del liquido seminale liquefatto a formare gocce dalla punta della pipetta. Si valuta lasciando cadere lentamente per gravità alcune gocce di seme da una pipetta monouso di plastica con apertura di diametro 1.5 mm. L aumentata viscosità, se non opportunamente trattata, interferisce con la determinazione della motilità e della concentrazione degli spermatozoi, con la ricerca di anticorpi e la determinazione di altri parametri biochimici. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

13 Analisi macroscopica del liquido seminale ph Riflette il bilancio tra la secrezione alcalina delle vescichette seminali e la secrezione acida della prostata - V.n È misurato utilizzando cartine tornasole con range tra 6.0 e 10.0, la misurazione dovrebbe essere effettuata dopo 30 minuti dalla produzione, a liquefazione avvenuta e comunque entro un ora dall eiaculazione poiché esso è influenzato dalla perdita di CO 2 che avviene dopo la produzione. Valori normali WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

14 Analisi macroscopica del liquido seminale Volume Consente di calcolare il N totale di spermatozoi presenti nell eiaculato (N sp / ml x Volume) Il limite di riferimento Il limite di riferimento inferiore è 2 ml inferiore è 1.5 ml WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

15 Analisi Microscopica ben miscelato prima di procedere all esecuzione dell esame microscopico Esame del liquido seminale microscopio a contrasto di fase a ingrandimento 100x filamenti di muco zone di spermio agglutinazione presenza di cellule non nemaspermiche

16 Il referto Conta degli spermatozoi Motilità Vitalità Morfologia Ricerca di anticorpiantispermatozoo Prova di trattamento

17 Contare gli spermatozoi: la concentrazione Microscopio a contrasto di fase obiettivo 10x o per i campioni più ricchi l obiettivo 20x Conta degli spermatozoi Contemporaneamente si valuta la cinetica nemaspermica, valutando sia la percentuale di forme mobili che la qualità della motilità. Camera di Makler la quale ha il pregio di evitare la diluizione del campione e permettere così un esame più rapido

18 Contare gli spermatozoi: la concentrazione I termini numero totale di spermatozoi e concentrazione di spermatozoi non sono quindi sinonimi La concentrazione degli spermatozoi non è una misura diretta della produzione testicolare La produzione testicolare è invece indicata dalla concentrazione totale di spermatozoi eiaculati, cioè la concentrazione di spermatozoi per ml moltiplicato il volume del campione Limiti inferiori di riferimento: concentrazione 20 x 10 6 sp/ml numero totale spermatozoi 40 x Limiti inferiori di riferimento: concentrazione 15 x sp/ml numero totale spermatozoi 39 x 10 6 Concentrazione numero di spermatozoi per unità di volume del liquido seminale È funzione del numero di spermatozoi emessi e del volume del fluido in cui sono diluiti Numero totale di spermatozoi nell intero eiaculato Si ottiene moltiplicando la concentrazione nemaspermica per il volume del liquido seminale WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

19 Agglutinazione degli spermatozoi Agglutinazione non specifica di spermatozoi di medie o grandi dimensioni, formate da spermatozoi agglutinati intorno a cellule rotonde o a cellule di sfaldamento, a filamenti di muco. Agglutinazioni specifiche in cui gli spermatozoi aderiscono tra di loro: testa-testa, coda-coda o in forma mista. Grado 1 o isolata: <10 spermatozoi coinvolti in ogni agglutinazione e molti spermatozoi liberi Grado 2 o moderata: tra 10 e 50 spermatozoi coinvolti in ogni agglutinazione Grado 3 o ampia: agglutinazioni con >50 spermatozoi Grado 4 tutti gli spermatozoi sono agglutinati e le agglutinazioni sono interconnesse WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

20 Determinazione qualitativa e quantitativa della motilità Si effettua la conta del numero di spermatozoi presenti in una fila di 10 quadratini orizzontali per stabilirne la concentrazione per ml. Si calcola la motilità in percentuale contando gli spermatozoi per ogni categoria considerata.

21 Determinazione qualitativa e quantitativa della motilità Al microscopio ottico a contrasto di fase con ingrandimento 100x Motilità (< 60) tipo Motilità Rapidamente progressiva rettilinea Progressiva rettilinea a b PR Motilità progressiva In situ c NP Motilità non progressiva Immobili d IM Immobilità WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

22 Determinazione qualitativa e quantitativa della motilità Motilità (< 60) tipo Motilità Rapidamente progressiva rettilinea Progressiva rettilinea a b PR Motilità progressiva In situ c NP Motilità non progressiva Immobili d IM Immobilità Limiti inferiori di riferimento: a=25% o (a+b)=50% Limiti inferiori di riferimento: (PR+NP)=40% o PR=32% WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

23 Valutazione della vitalità nemaspermica spermatozoi vivi ma di tipo immobile integrità della membrana cellulare Test eosina-nigrosina Swelling test Il limite di riferimento inferiore è 75% 2001 Il limite di riferimento inferiore è 58% 2010 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

24 Valutazione della vitalità nemaspermica Test eosina-nigrosina le cellule non vitali hanno la membrana danneggiata e quindi hanno la capacità di far passare coloranti che normalmente non permeano la membrana.

25 Valutazione della vitalità nemaspermica Hyposmotic Swelling Test Sfrutta il rigonfiamento iposmotico della membrana per discriminare tra gli spermatozoi vitali e non vitali: gli spermatozoi con membrane cellulari intatte si rigonfiano in cinque minuti in un mezzo iposmotico. Pictures courtesy of Dr. N. Minniti

26 Valutazione della vitalità nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

27 Valutazione della Morfologia Nemaspermica testa contorno liscio e ovale Kruger Strict Criteria acrosoma ben definito occupa dal 40% al 70% della testa Non devono essere presenti difetti del collo, del pezzo intermedio o della coda

28 Valutazione della Morfologia Nemaspermica Liscia, con contorni regolari, di forma ovale; regione acrosomiale ben definita che copre dal 40 al 70% della testa. Testa & Acrosoma Kruger Strict Criteria La regione acrosomiale non doverebbe contenere grandi vacuoli e non più di due piccoli vacuoli che non dovrebbero occupare più del 20% della testa. La regione post acrosomiale non dovrebbe contenere vacuoli

29 Valutazione della Morfologia Nemaspermica Il tratto intermedio dovrebbe essere sottile, regolare e circa della stessa lunghezza della testa. Tratto Intermedio Kruger Strict Criteria L asse maggiore del tratto intermedio dovrebbe essere allineato con l asse maggiore della testa dello spermatozoo. Il residuo citiplasmatico viene considerato un atipia solo se eccede un terzo della dimensione della testa

30 Valutazione della Morfologia Nemaspermica Dovrebbe avere un calibro uniforme lungo tutta la sua lunghezza più sottile rispetto al tratto intermedio Tratto principale Kruger Strict Criteria lungo circa 10 volte la lunghezza della testa può essere avvolto su se stesso senza però formare un angolo acuto che sarebbe indicativo di una rottura flagellare

31 Valutazione della Morfologia Nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

32 Valutazione della Morfologia Nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

33 Valutazione della Morfologia Nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

34 Valutazione della Morfologia Nemaspermica WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

35 Valutazione della Morfologia Nemaspermica Kruger Strict Criteria < 4% sub fertile 5-14% sub-fertile / fertile >14% normal / fertile La classificazione della morfologia secondo i criteri del WHO è una semplice classificazione normale/atipico con il conteggio opzionale della localizzazione delle atipie degli spermatozoi, sempre espressa in percentuale

36 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Gli spermatozoi anomali generalmente hanno un più basso potenziale di fecondazione e possono contenere anche DNA alterato. I difetti della morfologia sono stati associati ad un aumento di frammentazione del DNA e a un incremento di incidenza di alterazioni strutturali dei cromosomi o cromatina immatura. Difetti della testa: grande o piccola, a punta o piriforme, rotonda, amorfa, vacuolata, teste doppie Difetti del collo e del tratto intermedio: inserzione asimmetrica del tratto intermedio nella testa, tratto intermedio ispessito o irregolare, arrotolato Difetti del tratto principale: corto, multiplo, rotto, liscio piegato a forcina, fortemente angolato di spessore irregolare Residui citoplasmatici in eccesso poiché associati ad un processo spermatogenetico alterato WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

37 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

38 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

39 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

40 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

41 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

42 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

43 Valutazione della Morfologia Nemaspermica ANOMALIE DEGLI SPERMATOZOI Atlante di Seminologia L. Gandini

44 Valutazione della Morfologia Nemaspermica Cellule rotonde Elementi della linea germinale Leucociti (< 1 x 10 6 /ml)

45 Ricerca Anticorpi Antispermatozoo Mixed Antiglobulin Reaction Test Viene effettuato miscelando liquido seminale in toto con particelle di latex (beads), alle sospensioni è addizionato un siero monospecifico anti IgG o IgA. La formazione di agglutinazioni miste fra beads e spermatozoi mobili indica la presenza di anticorpi sullo spermatozoo.

46 La prova di trattamento La prova di trattamento è un test funzionale che valuta le capacità cinetiche degli spermatozoi. Lo scopo di questi trattamenti è quello di selezionare le sottopopolazioni nemaspermiche dotate di migliore motilità, morfologia e probabilmente capacità fecondante. Conta e motilità Prova di trattamento PMA Swim-up Gradiente Lavaggio e separazione

47 La prova di trattamento: Tecnica dello SWIM-UP Normospermia Prevede la centrifugazione del seme (750 rpm) per separare la parte liquida da quella cellulare con la formazione di un pellet e la migrazione - swim up - degli spermatozoi in un piccolo volume di terreno di coltura. Due lavaggi Stratifica µl Incubazione 30 minuti sp sp

48 La prova di trattamento: Gradienti di densità Oligospermia Il Percoll è una sostanza costituita da particelle di silice colloidale rivestite da PVP, polivinilpirrolidone, con cui si realizzano delle soluzioni a diversa concentrazione (90%, 70%, 40%). Percoll I (90%): concentrazione spermatozoi <1x10 6 /ml Percoll II (90% - 40%): concentrazione spermatozoi compresa tra 1 e 5x10 6 /ml Percoll III (90% - 70% - 40%): concentrazione spermatozoi >5x10 6 /ml o con eccessivi detriti Centrifugare a 3160 rpm sp sp sp

49 La prova di trattamento: lavaggio e separazione Oligospermia grave 0.5 x Azoospermia Alcuni campioni presentano una concentrazione talmente bassa di spermatozoi che si preferisce procedere con un unica centrifugazione ad elevata gravità (2500 g). Una volta centrifugato dal campione viene allontanato il sopranatante ed il campione viene risospeso in un piccolo volume (300µl) di terreno di coltura. Quindi da esso si prelevano 10 microlitri per effettuare l analisi. sp

50 CRA Centro Riproduzione Assistita Dir.Clinico Prof.G.Giuffrida Ginecologi Prof.G.Giuffrida Prof. M. Palumbo Dott. A. Mangiacasale Dott.ssa T. Pasqualetto Dott. A. Giuffrida Dott. L. Di Leo Dott.ssa A. Aglianò Biologhe Dott.ssa R. Cavallaro Dott.ssa A. Bruno Grazie per l attenzione!