ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE SPERMIOGRAMMA

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1 . Lo spermiogramma

2 ESAME DEL LIQUIDO SEMINALE SPERMIOGRAMMA Frazione cellulare: componente nemaspermica componente non nemaspermica Frazione liquida: plasma seminale Secreto prostata : 15% - 30% dell eiaculato, biancastro, ph acido. Ac. Citrico, fosfatasi acida, Mg, Zn, poliammine. Secreto vescicole seminali: 50% - 80% dell eiaculato, giallastro, ph basico, vischioso. Fruttosio, acido ascorbico. Secreto epididimo: Funzione di trasporto. Carnitina, glicerofosforil colina, alfa glucosidasi.

3 Il laboratorio di seminologia Lo Spermiogramma indagine di laboratorio di primo livello nell infertilità maschile. valuta il potere fecondante del partner maschile nella diagnosi di infertilità di coppia. Ausilio nell inquadramento clinico di patologie andrologiche o prima di terapie che possono alterarne il numero e la funzionalità ( patologie neoplastiche del testicolo e neoplasie in generale) Necessario prima della crioconservazione del liquido seminale come preservazione della fertilità. Importante prima di ricorrere a tecniche fecondazione assistita(pma) per decidere la tecnica più opportuna da seguire (rapporti mirati, IUI o FIVET/ICSI) Importante prima di metodiche di preparazione del liquido seminale (tecniche di capacitazione) I parametri : non indicano la reale capacità fecondante dello spermatozoo Manuale WHO 2010 Indagine più accurata e precisa Valori di riferimento : cambiati Controllo di qualità intra e inter laboratorio. Descrizione approfondita metodi di studio Criteri di normalità : basati su dati statistici ottenuti da uomini con storia recente di fertilità (WHO 2010), con time-to-pregnancy (TTP) < 12 mesi Prevede una fase preanalitica fase analitica fase post-analitica.

4 FASE PRE-ANALITICA Norme raccolta del campione seminale : giorni di astinenza, modalità di raccolta, contenitore, modalità consegna campione. Numero giorni astinenza da eiaculazioni : 3 5 giorni Raccolta campione seminale : masturbazione (solo in casi particolari raccolta in condom non spermiotossici). Contenitore raccolta: sterile non spermiotossico. Luogo raccolta : laboratorio per motivi di processazione metodologica e per motivi medico-legali (tecniche di PMA, crioconservazione liquido seminale, cause di disconoscimento di paternità) ; raccolta in ambiente domestico se esistono motivi psicologici. Consegna campione: subito dopo la raccolta o entro minuti dalla eiaculazione se raccolto in ambiente domestico (trasporto protetto da eccessive escursioni termiche). Norme di raccolta possono variare se: l indagine deve essere eseguita con urgenza per interventi chirurgici o per l inizio di chemioterapia o radioterapia, nel caso di difficoltà od impossibilità del paziente ad eiaculare. Processazione del campione: Iniziale osservazione coagulo alla raccolta. Trasferimento del contenitore in termostato a T 35-36,5 C per : Osservare processo fluidificazione, poi trasferimento del campione dal contenitore sterile in provetta conica graduata.

5 FASE ANALITICA VALUTAZIONE MACROSCOPICA dell eiaculato (Coagulo iniziale alla raccolta, fluidificazione, ph, volume, viscosità, colore, odore, coaguli dopo fluidificazione ) Coagulo iniziale: osservazione alla raccolta Coagulazione: fisiologica (enzimi vescicole seminali ). Liquefazione/fluidificazione: in minuti dalla raccolta regolare: completa in (enzimi prostatici) irregolare: se zone di mancata fluidificazione. Viscosità: si valuta con una Pasteur facendo cadere il liquido seminale goccia a goccia, nel contenitore di raccolta (viscosità aumentata se filo tra pipetta e contenitore) normale: il liquido cade goccia a goccia. aumentata: continuità tra gocce diminuita: il liquido appare diluito (correla con aspetto acquoso) Aspetto : Opalescente: normale Traslucido- acquoso: trasparente Lattescente (correla con colore biancastro) pioide( correla con colore giallastro) Colore biancastro, grigio /giallino; ematico Biancastro bianco grigiastro (correla con aspetto lattescente) Giallastro (correla con aspetto pioide) ph: normale 7.2-7,8 < 7 = si associa a patologia ostruttiva o a ipotrofie congenite o acquisite vescicole seminali. > 8 = si associa a flogosi. Volume : v.n 1,5-5 ml < volume : oligoposia Volume < 1,5 (raccolta incompleta, agenesia vescichette seminali, ostruzione dotti eiaculatori, eiaculazione retrograda) > volume : iperpsia Volume > 6ml ( astinenza prolungata, varicocele, difetti vescicole seminali, fattori infiammatori) si valuta con una pipetta graduata o con il peso

6 Valutazione microscopica dell eiaculato : concentrazione nemaspermica, motilità, cellule rotonde(leucociti, cellule linea spermiogenica, cellule epiteliali, emazie) di zone di agglutinazione. Morfologia Valutazione preliminare a ½ h: su vetrino portaoggetti 10 µ l di l.seminale. Si ricopre con vetrino e si osserva al microscopio ottico con ingrandimento 20x. Concentrazione nemaspermica: valutazione mediante conta numero di spermatozoi in Camera di Neuebauer modificata previa diluizione del liquido seminale ad 1h dalla raccolta (diluizione secondo il numero spermatozoi osservato sul vetrino a 1/2h) Conta in camera di Makler: non necessita di diluizioni valori normali sec. WHO 2010 : Concentrazione nemaspermica in ml : > 15 x10 6 sperm./ml Numero totale spermatozoi/eiaculato : > 39 x10 6 sperm./eiaculato Il numero di spermatozoi deve essere valutato sia in ml che su eiaculato totale (attività spermatogenetica testicolare, correlata con il quadro ormonale e la pervietà delle vie seminali) Criptozoospermia: n spermatozoi < /ml Azoospermia : assenza di spermatozoi conta a ½ h e con camera di Makler o Neubauer. Centrifugato (3000g x 15 ): spz nel pellet di un campione seminale centrifugato; esaminare intera raccolta seminale. Azoospermia: assenza di spermatozoi nell intero sedimento (pellet) Azoospermia : ripetizione dell analisi per due/tre volte.

7 Conteggio spermatozoi Conteggio preliminare su vetrino a ½ h Omogeneizzare il campione seminale Porre 10 µl su un vetrino portaoggetto : usare un coprioggetto 22x22mm, oppure 6,5 µl con vetrino coprioggetto 18x18mm Osservazione microscopio per stabilire il fattore di diluizione per conta in camera di Neubauer modificata Spz/c.m. obiettivo 40x diluizione l. sem µl diluente µl <15 1: : : >200 1:

8 Conteggio nemaspermi in camera di Neubauer Microscopio a contrasto di fase : Ingrandimento 200x o 400x Il campione deve essere mescolato bene prima della conta Eseguire due osservazioni : 2 replicati A B Sui riquadri centrali A e B : griglia griglia : lati 1x 1 mm profondità : 0,1mm Area : 0,1 mmq Volume : 0,01 mmc C = n spz contati / n quadrati contati X 1/ Vol X f. diluizione

9 Camera conta elementi di MAKLER Dimensioni intera griglia : 1x 1 mm Area: 0,01 mmq Profondità Makler : 0,01 mm Volume quadratino : 0,1x0,1 = 0,001µl Se se ne contano 10 quadratini : 0,001 x 10 = 0,01 µl C/ml = n spz (10 quadratini) x 10^6 C/ml= n spz (100 quadratini) x 10^5 Per contare gli spermatozoi : Inattivare una quota di liquido seminale a 60 C x 15 Caricare la camera con circa 10 µl

10 MOTILITA : movimento spermatozoo: di tipo flagellare. Movimenti normali: % spermatozoi Mobili Progressivi (MP) (25-100m/sec) con moto rettilineo o formando grossi cerchi, indipendentemente dalla velocità Movimenti anormali: % motilità non progressiva (NP) inclusi gli spermatozoi con movimenti in situ. Nessun movimento: % spermatozoi immobili (IM) Limiti inferiori di riferimento : Mobilità totale (PR+NPR) : 40% ( 5 percentile, 95% CI 38-42) Mobilità progressiva (PR) : 32% ( 5 percentile, 95% CI 31-34). TMC (Total motily count) = numero totale di spermatozoi Mobili Progressivi (PR) nell eiaculato. Motilita nemaspermica valutazione: con microscopio (ingrandimenti 20 o 25x) prima osservazione a 30 su vetrino poi: a 1, 2 h, 4 h dal momento dell eiaculazione: motilità e qualità della motilità o mobilità Test Vitalità nemaspermica: se motilità PR < 40% a 1 h dalla raccolta (preferibilmente 30 ) Test vitalità : Limite inferiore di riferimento 58% spz (5 percentile; 95% CI 55-63) (gli spermatozoi vivi non si colorano)- metodo Eosina Nigrosina Spermatozoi immobili ma vitali : deficienza della struttura del flagello Spermatozoi immobili non vitali (necrozoospermia) : patologie dell epididimo Test Funzionalità o Hypo osmotic Swelling test : v.n > 58% spermatozoi (gli spermatozoi funzionali rigonfiano la coda)

11 Valutazione motilità e mobilità WHO 1999 a: rapida progressiva b: lenta progressiva c: in situ d: immobile WHO 2010 Progressivi rapidi e lenti (MP) rapida a >= 25µm/sec lenta b : 5-24 µm/sec Non progressivi (NP) C < 5µm/sec Immobili (I) d Standardizzazione: difficile la definizione precisa della motilità e mobilità Tabelle di accettabilità : valutazione replicati Verifica delle conte : calcolare la somma e la differenza delle 2 conte in riferimento alle tabelle somma Differenza accettabile somma Differenza accettabile

12 Morfologia nemaspermica: valutatazione con conta in % a) preparato a fresco osservazione microscopio ottico con obiettivo 40x b) striscio fissato e colorato (May-Grünwald-Giemsa,Diff Quick, Papanicolau) con obiettivo immersione olio a 100x. Atipie : testa, collo, coda (singole e multiple) alterazione della morfologia spermatica (come per la motilità) non è correlata a patologie andrologiche. valutazione della componente non gametica : Cellule rotonde; leucociti, emazie, elementi linea germinativa, cellule epiteliali, zone di spermioagglutinazione, corpuscoli prostatici. Agglutinazioni specifiche : spermatozoi mobili agglutinati ad altri spermatozoi ( presenza di Ab anti spz : MAR test e IBT) Allestimento preparati : colorazione e valutazione secondo criteri stretti (spz normali e anormali o formula nemaspermica) Striscio : 10 µl di l.seminale su vetrino portaoggetti. Spz potenzialmente fecondanti (Spz normali o morfologicamente normali) : osservazione spz recuperati da muco cervicale dopo rapporto e dalla ZP dell ovocita VALUTAZIONE MORFOLOGIA - Colorazione striscio: Papanicolau, Shorr, Diff-quick Testa spz: blu chiaro, nucleo blu scuro Residuo citoplasmatico: rosa (Pap o diff quick); rosso arancio (Shorr) Colorazione di Papanicolau: Consente il montaggio e la conservazione del vetrino (controllo qualità interno) Colorazione Shorr simile a colorazione di Papanicolau

13 VALUTAZIONE MORFOLOGIA Colorazione striscio: Papanicolau, Shorr, Diff-quick Testa spz: blu chiaro, nucleo blu scuro Residuo citoplasmatico: rosa (Pap o diff quick); rosso arancio (Shorr) Colorazione di Papanicolau: Consente il montaggio e la conservazione del vetrino (controllo qualità interno) Colorazione Shorr simile a colorazione di Papanicolau LEUCOCITI: granulociti (polimorfonuckeati: neutrofili, eosinofili, basofili) e agranulociti (monomorfonucleati: linfociti e monociti) Valutazione colorazione tipo MayGrumwald Giemsa Persossidasi test citometria a flusso Leucospermia :Batteriospermia ( infezione). Valori normali < leucociti /ml Alterazioni morfo-strutturali degli spermatozooi. sindrome di Kartagener, o sindrome delle ciglia immobili, presenza di spermatozooi immobili (assenza dei filamenti di dineina) Globozoospermia: spermatozoi a testa tonda, privi dell acrosoma, impedisce la fecondazione. Alterazioni molecole presenti superficie dello spermatozoo, importanti per l adesione all ovocita (sp56, pro-acrosina) : possono contribuire all infertilità.

14 Analisi biochimica plasma seminale Markers biochimici valori normali Epididimo α-glucosidasi > 20 mu / eiaculato Carnitina = μmoli / eiaculato Prostata Zinco > 2.4 μmoli / eiaculato Ac citrico > 52 μmoli / eiaculato Fosfatasi acida > 200 U /eiaculato Vescichette seminali Frutosio > 13 μmoli / eiaculato Test seminali II livello Test vitalità (Eosin test): gli spz vivi non si colorano Hypo osmotic swelling test : Integrità e funzionalità membrana spz. Post coital test:passaggio spz nelle vie genitali femminili e attraverso il muco cervicale Interazione muco-sperma: sopravvivenza e motilità spz nel muco cervicale Slide test : sopravvivenza e motilità spz nel muco cervicale Test Capacitazione: Capacitazione spz in vitro Reazione acrosomiale: valutazione capacitazione spz Zona-binding assay : fecondazione ovocita HOPT (Hamster penetration ovum test) Hamster test: fecondazione ovocita Test al blu di anilina Test pro- acrosina Microscopia elettronica

15 Nomenclatura ( WHO 2010 ) : Oligozoospermia (concentrazione <15 Milioni/ml o n totale di spermatozoi /eiaculato < 39 x10 6 Astenozoospermia (motilità progressiva M P <32%) o < 40 spermatozoi MP+NP Teratozoospermia (forme tipiche < 4%) Normozoospermia (tutti i parametri nella norma) OAT - Oligo-asteno-teratozoospermia : alterazione numero, motilità e morfologia spermatozoi. Oligo-teratozoospermia : alterazione numero e morfologia spz. Oligo-astenozoospermia : alterazione numero e motilità spz. Asteno-teratozoospermia: alterazione motilità e morfologia spz Criptozoospermia: assenza di spermatozoi nell eiaculato; presenza di spermatozoi dopo centrifugazione Necrozoospermia : < 58% di vitalità spermatica Aspermia : assenza di eiaculato Polizoospermia : concentrazione spz >200 milioni/ml Ipospermia o ipoposia : volume eiaculato < 1.5 ml Iperspermia iperposia: volume eiaculato > 6.0 ml Piospermia (leucocitospermia): presenza leucociti eiaculato >1 milione /ml Emospermia : visibile presenza di eritrociti nell eiaculato Microemospermia: presenza microscopica eritrociti Dispermia : alterata produzione spermatozoi con riduzione del numero, o della motilità o della morfologia. Azoospermia: assenza di spermatozoi nell eiaculato anche dopo centrifugazione azoospermia : distinta in Secretiva: mancata produzione di spermatozoi. Ostruttiva: gli spermatozoi prodotti non riescono ad attraversare le vie seminali che sono ostruite. La presenza di agglutinazioni può essere indicativa di anticorpi antispermatozoo, (Mar test o immunobead test)

16 Valori significativi : in percentili Distribuzione dei valori dei parametri del liquido seminale di uomini che hanno ottenuto la gravidanza della partner in 1 anno. Valore minimo significativo : Soggetti nel 5 percentile hanno ottenuto la gravidanza. centili parametri N 2, volume ,2 1,5 2,0 2,7 3,7 4,8 6,0 6,8 7,6 N totale spz /eiaculato N spz/ml Motilità totale(pr+np %) Motilità progressiva MP % Motilità non progressiva NP % Immobili Vitalità % Morfologia normale , ,

17 PARAMETRO volume CRITERIO VALUTAZIONE 0 ml <1,5 ml >5 ml concentrazione 0 < 15milioni/ml >15 milioni/ml >200 milioni/ml NOMENCLATURA Aspermia Ipospermia iperspermia Azoospermia Oligozoospermia Normale il numero Polizoospermia motilità < 40 % 1 h astenozoospermia vitalità morfologia Spz tutti morti (test eosina) < 4% forme normali necrozoospermia teratozoospermia

18 Analisi computerizzata del liquido seminale CASA: (computer assisted sperm analizer): precisione e accuratezza : Numero velocità, morfologia e morfometria degli spermatozoi. non valuta caratteri fisico chimici Vantaggi Misure riproducibili e oggettive valutazione motilità e mobilità Svantaggi: campioni oligospermici, criptozoospermici: imprecisione cammpioni <2x10 6 /ml >50x10 6 /ml, ( detriti cellulari/spz immobili). Diluizione :>40 x 10 6 /ml ( buffer isotonico per evitare collisioni spz ) Parametri non standarizzabili inter-laboratorio Altri parameteri : velocità curvilinea(vcl), velocità rettilinea (VSL), frequenza del battito flagellare e del movimento laterale testa (ALH) FASE POSTANALITICA: refertazione e controllo di qualità. CONTROLLO DI QUALITA il Laboratorio di Seminologia deve essere dotato di controllo di qualità Interno: prevede un controllo intra-operatore e/o un controllo inter-operatori. Intra-operatore : una volta la settimana deve essere eseguita la valutazione in cieco dello stesso campione da parte dello stesso seminologo. Inter-operatori : per più operatori il controllo deve prevedere la lettura in cieco dello stesso campione da parte dei diversi seminologi. Esterno : il laboratorio deve aderire ad un programma di qualità esterno che preveda la valutazione, in cieco, di campioni seminali congelati o liofilizzati per quanto riguarda la concentrazione e la morfologia nemaspermica, e la valutazione di videocassette per quanto riguarda la cinetica nemaspermica.