4. Trasformazione della vitamina D3 nel suo metabolita biologicamente attivo (1,25- diidrossicolecalciferolo o calcitriolo)
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- Raimondo Verde
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1 Funzionalità renale
2 Le funzioni principali del rene sono: 1. Regolazione dell acqua, degli elettroliti e del bilancio osmolale. 2. Regolazione dell equilibrio acido-base 3. Eliminazione di prodotti del catabolismo e detossificazione 4. Trasformazione della vitamina D3 nel suo metabolita biologicamente attivo (1,25- diidrossicolecalciferolo o calcitriolo) 5. Produzione di sostanze endocrine come renina ed eritropoietina Unità funzionale: nefrone, dove avviene la trasformazione del filtrato glomerulare in urina. I nefroni occupano la parte corticale e la parte midollare del rene, e ogni rene ne contiene circa un milione.
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6 Attraverso i reni transitano circa ml di plasma in un minuto, di cui 125 vengono filtrati per un totale quotidiano di 180 litri di preurina. Di questo impressionante volume meno dell 1% viene escreto (circa 1,5 litri al giorno), mentre il rimanente viene rapidamente riassorbito. Il nostro organismo compie tutto questo lavoro, apparentemente inutile, per poter eliminare in fretta eventuali eccessi o sostanze nocive.
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8 Il rene produce urina mediante tre processi: filtrazione glomerulare riassorbimento delle sostanze dal liquido tubulare secrezione di soluti In tal modo, il rene è determinante nel mantenimento del volume e della composizione chimico-fisica dei liquidi corporei, eliminando prodotti di rifiuto e mantenendo acqua ed importanti elettroliti e metaboliti :
9 FILTRAZIONE: avviene tra capillari glomerulari e capsula di Bowman. Per assolvere questa funzione, durante la giornata i reni filtrano una quantità enorme di plasma (circa 180 litri), per poi operare un riassorbimento selettivo delle sostanze che non devono essere eliminate. Per le loro eccessive dimensioni, nel filtrato non passano le cellule, quindi non sono presenti i globuli rossi, i globuli bianchi e le piastrine; viene inoltre impedito il passaggio delle proteine più grandi. Il filtrato assume così la stessa composizione del plasma (parte liquida del sangue) privato delle proteine a molecola maggiore, dal momento che solo le più piccole e modeste quantità di albumina riescono a passare nel filtrato. Quando la preurina abbandona la capsula di Bowman va incontro a modificazioni tramite processi di riassorbimento e secrezione. RIASSORBIMENTO: consiste nel recupero di acqua e soluti filtrati, che passano dai tubuli ai capillari sanguigni. La quantità riassorbita è quindi data dall'acqua più le sostanze che lasciano la preurina e tornano nel circolo sanguigno. Tra queste rientrano tutti i prodotti utili per l'organismo, come il glucosio, le proteine più piccole che sono riuscite a passare nel filtrato, gli aminoacidi, le vitamine, una grandissima quantità di acqua e vari sali. SECREZIONE: processo, inverso al riassorbimento, per cui alcune sostanze passano dal sangue contenuto nei capillari ai tubuli renali, aggiungendosi a quelle filtrate. Tra le sostanze secrete rientrano tutte quelle che necessitano di una rapida eliminazione, come i farmaci, gli ioni H+ e le molecole presenti in eccesso. ESCREZIONE: consiste nell'eliminazione dell'urina nella pelvi renale. Il volume escreto equivale al volume filtrato meno quello riassorbito più quello secreto. Nel caso del glucosio, essendo il riassorbimento pari al 100% e la secrezione nulla, l'escreto è pari a zero. L'acqua e i sali minerali sono in parte riassorbiti ed in parte escreti, grazie ad un fine meccanismo regolatorio.
10 FILTRATO = plasma senza proteine RIASSORBITO = sostanze utili come glucosio, aminoacidi, acqua, vitamine e minerali SECRETO = sostanze in eccesso (H+), prodotti finali del catabolismo (urea) o farmaci ESCRETO = FILTRATO + SECRETO - RIASSORBITO
11 Sostanze prodotte: EPO, promuove sintesi di emoglobina 1-25-diidrossicolecalciferolo, regola l assorb. di ioni calcio Renina, formazione di angiotensina, e, quindi, di aldosterone Sostanze regolatrici: PTH Il paratormone (o ormone paratiroideo o PTH) è un polipeptide (84 aa) sintetizzato dalle ghiandole paratiroidi: esercita il controllo del metabolismo del calcio, regolandone l assorbimento nell intestino tenue ed il riassorbimento a livello renale (assieme allo ione magnesio). Arginina vasopressina (AVP), regola bilancio acqua. Aldosterone, regola riassorbimento sodio
12 La funzionalità renale è riferita alla funzionalità glomerulare e tubulare Il filtrato glomerulare ha la stessa composizione del plasma, senza la maggior parte delle proteine Velocità di filtrazione: circa ml/min Velocità di filtrazione normale dipende da pressione e flusso sanguigno normale Età e dimensioni corporee influenzano velocità di filtrazione glomerulare (GFR) La diminuzione di velocità di filtrazione glomerulare porta a un aumento di ritenzione di prodotti di rifiuto del metabolismo nel sangue Sostanze che aumentano nel siero nella malattia cronica renale sono creatinina e urea La valutazione dei livelli sierici di creatinina e urea rappresentano l indagine clinica di primo livello ed è essenziale per una diagnosi di insufficienza renale
13 Il problema è: come misurare la GFR???? Calcolo della CLEARANCE RENALE Considerando un qualunque costituente del plasma presente nelle urine: Dosaggio quantità escreta U (concentrazione, mmol/l) x V (Volume, L) di urine nel tempo quantità escreta (mmol) : U x V Il volume di sangue (plasma), che dovrebbe contenere quella quantità, può essere ottenuto dividendo la quantità escreta per la concentrazione plasmatica, P, della sostanza in esame (in mmol/l): Volume di plasma (ml/min) = Clearance = (dal quale il rene elimina una certa sostanza in un dato tempo) 2 U x V x 1,73m P x t x S 1,73 m 2 : superficie corporea media S: superficie corporea del paziente (m 2 )
14 La massima velocità alla quale il plasma può essere ripulito da qualunque sostanza è uguale alla GFR CLEARANCE: vero e proprio coefficiente di DEPURAZIONE plasmatica Questa può essere calcolata dalla clearance di alcuni costituenti plasmatici, che vengono filtrati a livello glomerulare e non sono né assorbiti né secreti a livello del tubulo. Una di queste sostanze è l inulina (gold standard di GFR) Inulina: sostanza esogena (carboidrato vegetale, mw 5000 Da), che dopo essere stata filtrata dal glomerulo, non viene né secreta né assorbita dal tubulo, per cui ci dà esattamente l entità della filtrazione glomerulare (~120 ml/min). Tuttavia ha 2 SVANTAGGI: DEVE ESSERE INIETTATA E IL SUO DOSAGGIO È COMPLESSO In pratica, nel laboratorio clinico, l inulina viene sostituita dalla CREATININA o dall UREA
15 CREATININA Si tratta dell anidride della creatina (che è presente nel muscolo, sia in forma libera che in forma fosforilata: riserva di fosfati ad alta energia per la sintesi di ATP, necessario per la contrazione muscolare); Si forma, nel muscolo, per deidratazione irreversibile della creatina fosfato (trasformazione indispensabile per l escrezione della creatinina) Creatina Creatinina
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17 Il livello di creatinina nel siero (CREATININEMIA) rappresenta un'indicazione importante per la funzionalità dei reni. In casi di insufficienza renale, la creatinina, così come altre sostanze come l'urea, non viene del tutto filtrata dai reni; in questo caso la creatinina non passa dal sangue alle urine e rimane nel flusso sanguigno. L'insufficienza renale deve essere comprovata anche da acidosi, alti livelli di potassio e bassi livelli di sodio. L'aumento dei livelli di creatinina può derivare anche ad un danno muscolare grave o a deperimento organico o a seguito di certe terapie. La quantità di creatinina prodotta da un individuo è proporzionale alla sua massa muscolare scheletrica.
18 Valori di Creatininemia (creatinina nel siero) VALORI DI RIFERIMENTO UOMO : I valori normali sono compresi tra 0,7 e 1,9 mg/dl (61,9-114,9 μmol/l) VALORI DI RIFERIMENTO DONNA : I valori normali sono compresi tra 0,6 e 1,2 mg/dl (53,1-106,1 μmol/l) VALORI DI RIFERIMENTO BAMBINO: I valori normali, nei bambini di età inferiore a 2 anni, sono compresi tra 0,3 e 0,6 mg/dl
19 L escrezione giornaliera di creatinina con le urine(creatininuria) è una costante dell organismo e, rapportata alla taglia corporea, è costante in individui diversi della stessa età e sesso. I valori di creatinina nel plasma (creatininemia) possono essere invariati durante le prime fasi dell insufficienza renale, per cui la loro determinazione può non consentire una diagnosi precoce; è per tale motivo che è usata maggiormente la determinazione della CLEARANCE della CREATININA Quindi, una stima della GFR può essere ottenuta calcolando il contenuto di creatinina nelle urine delle 24h e la sua concentrazione plasmatica nello stesso periodo: Volume plasmatico in ml/min GFR U x V P U = conc urinaria creatinina (mmoli/l) P = conc plasmatica creatinina (mmoli/l) V= flusso urinario in ml/min
20 Per esempio, se la concentrazione urinaria di creatinina è 196 mg/dl, la concentrazione plasmatica di creatinina è 1,4 mg/dl e il volume urinario è 1500 ml nelle 24h (1440min), il volume di plasma che viene depurato dalla creatinina in 1 minuto (ovvero la Clearance, C, espressa in ml/min) è: C 196mg/dl x 1500ml/1440min 1,4 mg/dl 146ml/min
21 La clearance di creatinina plasmatica è riferita direttamente a GFR a condizione che: volume urine accurato non ci siano chetoni o elevata proteinuria L identificazione del volume di filtrato glomerulare con la clearance della creatinina non è del tutto corretta poiché la creatinina è in parte (10%) secreta dai tubuli, e la quota tubulare aumenta se aumenta quella plasmatica. Tuttavia, in condizioni normali o lievemente patologiche, tale differenza non viene presa in considerazione (sostanze interferenti presenti al dosaggio nel plasma compensano la quota secreta nella urine). Se, invece, si ha insufficienza renale avanzata, le sostanze interferenti sono sempre le stesse, mentre la quantità di creatinina secreta è molto più alta, per cui i valori di clearance tendono ad essere più alti di quelli del filtrato glomerulare: il dato sopravvaluta lievemente la funzionalità renale.
22 Valori di Clearance della Creatinina VALORI DI RIFERIMENTO UOMO : I valori normali sono compresi tra ml /min VALORI DI RIFERIMENTO DONNA : I valori normali sono compresi tra ml /min EFFETTO DELL ETA (in condizioni normali) Da 50 a 75 anni, sottrarre 5 ml/min per ogni 5 anni Oltre i 75 anni, sottrarre 8 ml/min per ogni 5 anni
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24 UREA È il prodotto della fissazione dell ammoniaca che deriva dalla transaminazione e dalla deaminazione ossidativa degli aminoacidi, unità costitutive delle proteine (ciclo dell urea, nel fegato). Viene eliminata dai reni, attraverso l'urina.
25 L urea prodotta dal fegato entra in circolazione ed è in gran parte escreta dal rene: nelle 24h, normalmente, un individuo adulto elimina con le urine g di azoto sotto forma di urea (1-2 g con le feci). La concentrazione plasmatica dell urea dipende dalla sintesi epatica e dall eliminazione renale. E filtrata a livello glomerulare (56g/die): una quota è riassorbita, insieme all acqua, nel prossimale, un altra lascia il lume a livello del dotto collettore e si accumula nell interstizio della midollare; la quota escreta è di circa 28 g/die, ovvero il 50% di quella filtrata La produzione di urea non è costante, potendo aumentare, se la dieta è iperproteica o c è ipercatabolismo delle proteine endogene, o diminuire, in caso di denutrizione o per ridotta attività del ciclo enzimatico. Per questo motivo la molecola dell urea non ha i requisiti ideali per la determinazione del filtrato glomerulare
26 Il laboratorio nelle studio delle malattie renali La velocità di filtrazione glomerulare (GFR), dal punto di vista clinico, è la funzione più importante del rene; la misura della clearance della creatinina è lo strumento pratico per la determinazione della funzionalità renale; per lo studio delle sindromi tubulari l impiego dei test biochimici è di fondamentale importanza:
27 L esame delle urine si suddivide in tre momenti principali:
28 L urina è un liquido di composizione estremamente variabile:
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30 RACCOLTA DELLE URINE Fase preanalitica: raccolta e conservazione del campione Come regola generale, ogni campione dovrebbe essere esaminato entro 30 e comunque entro un massimo di due ore dalla minzione RECIPIENTE DI RACCOLTA BEN PULITO E, IN CASO DI URINOCOLTURA, ANCHE STERILE CAMPIONE PRIMA MINZIONE MATTUTINA URINE 24 ORE ALCUNI PARAMETRI BIOCHIMICI SUBISCONO VARIAZIONI CRONOBIOLOGICHE SCARTARE PRIMA MINZIONE E RACCOGLIERE IN UN UNICO RECIPIENTE (conservato a freddo) TUTTE LE URINE EMESSE NELLE 24 ORE
31 Tipi di informazioni: a) condizioni anatomiche e/o funzionali del rene b) presenza di alterazioni (infezioni, tumori, ecc) delle vie urinarie c) eliminazione anomala di sostanze esogene (farmaci, sostanze tossiche e metaboliti) Tipi di indagine: esame urine (qualitative/semiquantitative); analisi semiquantitative di accertamento preliminare particolare (test di gravidanza); analisi quantitative di sostanze endogene (in condizioni normali/patologiche)(glicosuria, ormoni, ecc); determinazione di farmaci e dei loro metaboliti per indagini farmacologiche, tossicologiche o di funzione analisi batteriologiche analisi citologiche
32 Tipi di campione: Estemporaneo (urina del mattino, per l esame delle urine, per il test di gravidanza ecc; urina 3h dopo il pasto, per il diabete) Temporaneo (12-24h) (ev. aggiunta di conservanti) Esame urine: a) Esame fisico: colore trasparenza (torbidità, lattescenza, indici di infezioni batteriche, presenza di grassi) odore (sui generis, ammoniacale (degradaz. da ureasi batterica), di urina di topo, di sciroppo d acero) volume ( ml/die, altrimenti poliuria, oliguria o anuria) peso specifico (o densità) ( g/l) b) Esame chimico (effettuato con strisce reattive, esame qualitativo) c) Esame microscopico del sedimento
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34 b) Esame chimico: Peso specifico (o densità) ph glucosio corpi chetonici proteine emoglobina bilirubina urobilinogeno leucociti nitriti
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36 Peso specifico La densità urinaria è dovuta alla presenza di sostanze solide (urea e NaCl); costituisce indice di normale funzionalità renale; infatti, in condizioni normali, l urina sarà ipertonica rispetto al plasma. ph Di norma acido, compreso tra 5.5 e 6.5, esprime la capacità del rene di mantenere l equilibrio acido-base nell organismo. Influenza la forma di cristallizzazione delle diverse sostanze escrete nelle urine Glucosio Valutazione semiquantitativa fatta con cartine (metodo enzimatico colorimetrico). Aumenti della quantità di glucosio (iperglicemia) riflettono l incapacità dei tubuli renali di riassorbirlo completamente (per diagnosi di diabete procedere con esami più approfonditi).
37 Corpi chetonici Aumentano nell alterazione del metabolismo glucidico e, di riflesso, di quello lipidico (acetone, acido acetacetico, acido beta-idrossibutirrico). Nei bambini aumentano per vomito (come nelle gravide), digiuno prolungato, febbre. La loro presenza indica che l organismo usa acidi grassi per produrre energia, piuttosto che immagazzinarli per un uso successivo (chetoacidosi diabetica, chetoacidosi alcolica) Proteine Normalmente, l eliminazione urinaria di proteine è, nelle 24h, inferiore a 150 mg. La loro presenza in quantità maggiori indica perdita di capacità dei glomeruli di essere impermeabili alle proteine, o l incapacità dei tubuli di riassorbirle, o ancora la presenza di cellule o sangue nelle urine.
38 Emoglobina La presenza di sangue nelle urine (ematuria) può avere diverse spiegazioni, che comprendono condizioni maligne, infezioni del tratto urinario e contaminazioni da mestruazioni. Usate striscioline reattive per il sangue (reazione pseudoperossidasica, ovvero liberazione di ossigeno da un perossido e ossidazione di un cromogeno da parte dell ossigeno), in grado di rivelare emo- e mioglobina; anche l analisi del sedimento urinario, con ritrovamento di globuli rossi, consente la diagnosi di ematuria. Bilirubina La presenza di bilirubina coniugata nelle urine è sempre patologica (interruzione della circolazione entero-epatica), poiché viene normalmente escreta, attraverso le vie biliari, nell intestino, dove viene catabolizzata; una piccola parte, normalmente, è riassorbita nella circolazione portale, ritorna al fegato e viene riescreta nella bile
39 Urobilinogeno Nell intestino, la bilirubina coniugata è frammentata, dai batteri, in prodotti noti come urobilinogeno fecale (stercobilinogeno), che entra nella circolazione enteropatica. A differenza della bilirubina, può essere normalmente rilevato nelle urine, per cui il suo significato diagnostico è meno rilevante della bilirubina. I suoi livelli sono elevati nei casi di turnover alterato della bilirubina (emolisi, circolazione enteropatica bloccata per danno epatico). Leucociti La presenza di leucociti indica presenza di infiammazione acuta del tratto urinario. Nitriti Conversione del nitrato (dalla dieta) a nitriti per azione di batteri urinari: quindi, indicano probabile infezione.
40 c) Esame microscopico del sedimento Viene osservata a fresco una goccia di sedimento ottenuto centrifugando una parte del campione di urine. Si evidenziano eritrociti, leucociti, cellule epiteliali, cilindri, filamenti di muco, cristalli, microorganismi patogeni.
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46 Metodi di misura - Esame chimico delle urine Glucosio Valutazione semiquantitativa con strisce reattive. Proteine Valutazione semiquantitativa con strisce reattive; metodi torbidimetrici (precipitazione con acido tricloroacetico) o colorimetrici (precipitazione con acido tricloroacetico seguito da reazione del biureto); le singole frazione proteiche possono venir misurate con tecniche immunochimiche (immunodiffusione radiale, RIA). Albumina ed altre proteine Misurate con tecniche immunochimiche (immunodiffusione radiale, nefelometria, turbidimetria, ecc) Emoglobina e mioglobina Rilevate su strisce sfruttando la reazione pseudoperossidasica dell emoglobina (trasferimento di O 2 su un substrato cromogeno).
47 Urobilinogeno Reagisce con p-dimetilaminobenzaldeide in ambiente acido (reattivo aldeidico di Ehrlich), dando colore rosso. Per la misura della urobilina, tutto l urobilinogeno viene ossidato a urobilina con soluzione iodoiodurata; per reazione con zinco acetato si ha formazione di fluorescenza verde Bilirubina nelle urine (pigmenti biliari) Valutazione mediante ossidazione con iodio e formazione di composti colorati (verde, blu) o, meglio, con reazione di diazotazione. Corpi chetonici In ambiente alcalino reagiscono con il nitroprussiato di sodio dando un colore rosso violaceo. Osmolalità Misurata in funzione dell abbassamento crioscopico del materiale biologico. Enzimi urinari Misurata con tecniche simili a quelle impiegate sul siero.
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