COMPOSTI AZOTATI NON PROTEICI

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1 COMPOSTI AZOTATI NON PROTEICI Esistono numerosi composti azotati non proteici nel plasma (NPN): - UREA - AMMINOACIDI - AC. URICO - CREATININA - CREATINA - AMMONIACA - L UREA RAPPRESENTA CIRCA IL 45% DELL AZOTO TOTALE NON PROTEICO

2 Urea Sintesi a livello di fegato, rene e cervello, dal catabolismo proteico A livello renale viene filtrata e riassorbita per circa il 50%. La concentrazione plasmatica dipende da: Velocità di produzione (apporto proteico, catabolismo tissutale, funzione epatica) Velocità di eliminazione (velocità di filtrazione glomerulare, funzione renale) Elevati livelli: Aumentato catabolismo proteico Cause renali: Glomerulonefriti, sindromi nefrosiche ecc. Cause post renali: Ostruzione uretere, uretra, tumori

3 Urea Limitazioni: - La quantità prodotta presenta notevoli variazioni in relazione alla dieta e alla funzionalità epatica - Non può essere utilizzata per il calcolo della clearance in quanto viene riassorbita in quantità variabile in relazione allo stato di idratazione del paziente - L urea è riassorbita passivamente nel tubulo distale insieme all acqua: in condizioni di diuresi viene escreta una quantità maggiore di urea; in antidiuresi la concentrazione plasmatica aumenta. - Questo spiega la tendenza all aumento dell urea prima di quello della creatinina nei pazienti con alterazioni prerenali della funzione renale.

4 Azotemia Tasso di azoto presente in un dato volume di plasma dopo l allontanamento delle proteine. Quindi indica la concentrazione ematica dell azoto non proteico (detto anche azoto incoagulabile o azoto residuo). Azotemia Azoto ureico (10-20 mg/dl) + azoto di amminoacidi, polipeptidi, ac. urico, creatina, creatinina, guanidina ed ammoniaca (10-20 mg/ dl).

5 UREA Può essere espressa anche come BUN (azoto ureico del sangue). Urea e N ureico però non sono la stessa cosa, perché chimicamente l urea contiene il 47% di N. La velocità di produzione e escrezione dell urea non è costante; per es, dopo un pasto altamente proteico concentrazioni max di urea sono raggiunte dopo circa 8h. Per questo motivo i prelievi x UREA vanno fatti dopo digiuno di 12h

6 Enzimatico Urea Metodi di dosaggio: 1a: Metodo Enzimatico Colorimetrico (ureasi + fenolo e sodio ipoclorito) 1b: Metodo Cinetico Ultravioletto (ureasi + ossoglutarato, NADH)

7 Metodo Enzimatico Colorimetrico Sfrutta la capacità dell enzima ureasi di trasformare l urea in ammoniaca ed ac. Carbonico. Urea + H 2 O ureasi 2NH4 + +CO2 Gli ioni ammonio formati sono determinati con la reazione di Berthelot, in cui l ammoniaca, in una soluzione alcalina di fenolo ipoclorito, reagisce dando origine ad un cromogeno blu. La reazione è stata modificata con l aggiunta di un catalizzatore quale il nitroprussiato per facilitare la conversione dell ammoniaca in indofenolo.

8 Urea L uremia così misurata è il doppio dell azoto ureico, perché l azoto ureico è pari a poco meno del 50% in peso della molecola di urea; PM urea = 60, PM azoto ureico = 28) VR = mg/dl ( mmol/l). Quindi: BUN x 2.14 = Uremia Uremia x 0.46 = BUN

9 Metodo Cinetico Ultravioletto La misura dell assorbanza a 340 nm può essere eseguita in cinetica o quando la reazione è all equilibrio.

10 INTERFERENZE L emoglobina causa interferenze nel dosaggio colorimetrico, perciò si preferisce dosare l urea nel siero o nel plasma più che nel sangue intero. La reazione dell ureasi viene inibita da fluoruro di sodio. Usare eparina come anticoagulante. Dosare l urea entro poche ore dal prelievo. Nel siero e nel plasma dopo pochi giorni un eventuale contaminazione batterica è in grado di far diminuire rapidamente la quantità totale di urea.

11 VALORI DI RIFERIMENTO Viene determinata nel siero, nel plasma e nelle urine. L intervallo di riferimento per l urea plasmatica è mg/dl ( mmol/l). L intervallo di riferimento per l azoto ureico del plasma è 8-18 mg/dl ( mmol/l).

12 Creatinina: catabolita della creatina La creatina è sintetizzata nel rene e nel fegato (da arginina, glicina e metionina), attraverso il circolo diffonde ai tessuti, soprattutto quello muscolare, dove viene fosforilata ed utilizzata come riserva energetica Parametri analitici e biologici Campione biologico: siero, plasma, urine Emivita = 2,5 ore Liberamente filtrata (PM 113,12 Da) % secreta dai tubuli Sostanza endogena variabilità intra-individuale: 4.3% variabilità inter-individuale: 12.9% (sesso, età, BMI, alimentazione) La concentrazione della creatinina ematica dipende molto dalla massa muscolare, poco dalla dieta

13 variabilità interindividuale più elevata della variabilità intraindividuale E congruo utilizzare i valori di riferimento? i valori di riferimento potrebbero essere di utilità limitata Bisogna considerare l individualità del parametro in esame

14 L individualità di un analita si stabilisce calcolando l indice di individualità (II) II = variabilità intra-individuale (CV 1 )/ variabilità inter-individuale CV G Un indice di individualità basso indica che l analita ha una marcata individualità e viceversa

15 La creatinina possiede una marcata individualità La variabilità intra-individuale (CV 1 ) della creatinina (4.3%) è inferiore a quella inter-individuale (CV G ) 12.9 : 4.3<<12.9 L II 0.3 della creatinina è basso soggetti Limite inferiore di riferimento Limite superiore di riferimento Un individuo potrebbe avere risultati insoliti per lui ma che potrebbero rientrare ancora nei limiti del convenzionale intervallo di riferimento

16 q II basso (<0.6) : L Intervallo di Riferimento è di poca utilità, maggiori vantaggi con il confronto del risultato con valori precedenti ottenuti dallo stesso paziente q II elevato (>0.6): il confronto del risultato con l Intervallo di Riferimento possiede un peso elevato in numerose situazioni cliniche

17 Creatinina indicatore poco precoce (comincia ad aumentare quando 50% del rene è compromesso) egfr (Estimated Glomerular Filtration Rate- Velocità di Filtrazione Glomerulare Stimata) GFR(ml/min/1.73 m2)= 175x{[creatinina sierica (mg/dl o µmol/l/88.4)] x { età (anni) } x se femmina e x 1.21 se afro-americano il coefficiente 175 si riferisce a metodi ricalibrati contro standard internazionali

18 egfr Velocità di Filtrazione Glomerulare Stimata Limiti: Non è applicabile a donne in gravidanza, soggetti defedati e/o affetti da patologie multiple soggetti con età <18anni e >75 anni Determinare clearance della creatinina

19 CLEARANCE DELLA CREATININA: E una misura del grado di filtrazione glomerulare o meglio della velocita di depurarazione del plasma da un determinato soluto in un periodo di tempo. Il calcolo richiede la conoscenza della concentrazione plasmatica del soluto, il flusso urinario (volume di urina prodotto nell intervallo di tempo considerato) e la concentrazione urinaria del soluto. Clearance = Concentrazione U x Flusso urinario x 1,73 Concentrazione S sup. corporea Quando la clearance di una sostanza diminuisce, la sua concentrazione plasmatica aumenta.

20 Metodi di dosaggio della creatinina 1. colorimetrico (Jaffè = riduzione del picrato in ambiente alcalino con formazione di colore rosso). Interferenti = bilirubina

21 INTERFERENZE E sensibile alle variazioni di ph e temperatura. I valori di creatinina sono sovrastimati di circa il 20% nel sangue e di circa il 5% nelle urine a causa della presenza di cromogeni non creatininici, endogeni o esogeni Cromogeni non creatininici endogeni : glucosio, acetoacetato (attenzione nei diabetici), proteine, piruvato, ac. urico. La bilirubina presente nel siero di pazienti itterici interferisce negativamente con la reazione di Jaffè (i neonati sono «fisiologicamente» itterici). Cromogeni non creatininici esogeni : farmaci di uso comune (p.e. cefalosporine) interferiscono con la reazione di Jaffè (aumentano la creatininemia) Sono stati sviluppati metodi per separare la creatinina dagli altri cromogeni prima della reazione di Jaffè.

22 Altri saggi si basano sulla cinetica e rappresentano modificazioni della reazione di Jaffe. Il loro principio si basa sulla diversa velocità di formazione dei composti colorati da parte della creatinina e degli altri cromogeni, che permette una separazione tempo-dipendente della creatinina dalle sostanze interferenti (p.e. l acetoacetato reagisce rapidamente con il picrato, le proteine reagiscono lentamente). Poiché negli eritrociti è presente una grande quantità di cromogeni non creatininici, si preferisce misurare la creatinina nel siero e nel plasma piuttosto che nel sangue intero.

23 Metodi di dosaggio della creatinina 1. colorimetrico (Jaffè = riduzione del picrato in ambiente alcalino con formazione di colore rosso). Interferenti = bilirubina - enzimatico (creatininase). Interferenti = bilirubina, ma meno significativi METODO DI RIFERIMENTO

24 DOSAGGIO ENZIMATICO CREATININA + H 2 O CREATINA + H 2 O creatininasi creatinasi CREATINA SARCOSINA + UREA SOD SARCOSINA + O 2 + H 2 O GLICINA + HCOH + H 2 O 2 H 2 O aminofenazone + HTIB POD Colorante chinoneiminico + H 2 O + HI L intensità di colore del colorante chinoneiminico è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina presente nella miscela di reazione ( lettura a 552/659 nm)

25 Valori di riferimento La concentrazione sierica di creatinina è generalmente costante e di solito più alta negli uomini che nelle donne. SIERO: UOMINI: mg/dl ( mmol/l) DONNE: mg/dl (44-88 mmol/l) URINE: UOMINI: mmol/die/kg DONNE: mmol/die/kg L analisi della creatina non è in genere eseguita. Un aumento della creatina sierica si può osservare in seguito a traumi o malattie muscolari.

26 Confronto del risultato con i valori di riferimento Variazioni significative si possono verificare anche nell ambito di valori di riferimento considerati normali ES: Variazioni della creatinina in 10 gg da 54 a 108 (Val. Rif: 45/110 µmol/l)

27 ACIDO URICO La maggior parte dell ac. Urico si forma nel fegato, organo che assieme alla mucosa intestinale ha un alta attività della xantino-ossidasi. L ac. Urico viene secreto con la bile ed i succhi intestinali ed a livello dell apparato digerente va incontro ad uricolisi ad opera di enzimi batterici. In condizioni di normalità ogni giorno circa 1/3 dell ac. Urico escreto viene catabolizzato attraverso questa via. I 2/3 rimanenti vengono escreti immodificati con le urine In definitiva circa il 50% dell ac. Urico totale è eliminato e sostituito nelle 24 ore.

28 URICEMIA La misura può venire effettuata su plasma o siero. Metodo colorimetrico L acido urico in ambiente alcalino, fornito dal carbonato di sodio, riduce l acido fosfotungstico a blu tungsteno, determinato fotometricamente a 710 nm. L intensità del colore è proporzionale alla concentrazione dell acido urico del campione Può essere usato qualunque tipo di anticoagulante ad eccezione dell ossalato di potassio perché darebbe origine ad un composto idrosolubile, il fosfotungstato di potassio, che precipitando causa torbidità.

29 Questo metodo ha però dei limiti: - co-precipitazione dell ac. Urico con le proteine plasmatiche. - formazione di torbidità durante lo sviluppo del colore - presenza di sostanze endogene interferenti sulla riduzione del fosfotungstato quali ac. Ascorbico, glucosio ad alte concentrazioni, glutatione, purine metilate ecc.

30 Metodo enzimatico uricasi Ac. Urico + 2H 2 O + O 2 Allantoina + CO 2 + H 2 O 2 L acido urico possiede il massimo di assorbimento a nm mentre l allantoina non assorbe la luce a questa lunghezza d onda L ossidazione dell ac. Urico ad allantonina catalizzata dall enzima uricasi è il metodo più specifico a disposizione.

31 METODO ENZIMATICO I vantaggi di questo metodo sono dovuti alla possibilità: - di evitare la precipitazione delle proteine - una maggiore sensibilità e specificità - possibilità di applicazione ad analizzatori automatici

32 VALORI DI RIFERIMENTO SIERO O PLASMA: UOMINI: mg/dl ( mmol/l) DONNE: mg/dl ( mmol/l) URINE DEL MATTINO: mg/dl ( mmol/l)

33 Ammoniemia anticoagulante litio-eparina Si dosa contemporaneamente NH3 e NH4+ metodo enzimatico diretto: l ammonio si combina con α- chetoglutarato e NADPH che, in presenza di glutammato deidrogenasi (GLDH), produce glutammato e NADP+. NH3 +α-chetoglutarato+nadph Glutammato +NADP+ La diminuzione dell assorbanza a 340 nm è proporzionale alla concentrazione di ammonio

34 Problematiche del dosaggio dell NH4+ Le concentrazioni di NH4+ aumentano in vitro, dopo il prelievo Tale aumento è determinato in via predominante dalle cellule del sangue, anche se c è un modico aumento anche nel plasma. Gli epatopatici presentano velocità di incremento maggiori, perchè hanno spesso alti livelli di γgt, con aumento dell idrolisi enzimatica della glutammina e aumento di ammonio nei campioni conservati a T ambiente Dopo la raccolta la provetta deve essere trasportata immediatamente al laboratorio in ghiaccio, successivamente la centrifugazione deve essere avviata a 5-10 C immediatamente. Le raccomandazioni sono in genere molto stringenti, con un intervallo massimo di minuti a 4 C per la conservazione di campioni da soggetti sani, e di soli 15 minuti nei pazienti epatopatici, a causa della probabile iperattività della γgt

35 VALORI DI RIFERIMENTO Femmine e Maschi: < 80 micromoli/l Più alto nei neonati Aumenti possono verificarsi nell iperalimentazione, mentre diete ipoproteiche ne abbassano la concentrazione.