Editore: Diana Carpaneto Autori: Nicolò Bastianelli, Federico Bellisario, Giulia Bellone, Gianmarco Bellucci

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1 Canali ionici Info sul corso: Il corso è articolato in due semestri ma l esame è unico. I 16 crediti saranno certificati con l esame alla fine del secondo semestre. Per gli studenti che raccolgono il 66% delle presenze nel primo semestre è possibile un esonero al termine del primo semestre come aiuto a suddividere lo studio.essendo un esame corposo e non tutti gli studenti riescono a superarlo nel secondo anno di corso la possibilità di sostenere l esonero è data anche a studenti di anni successivi ma solo qualora raggiungano le presenze previste. Bisogna affidarsi unicamente alle info ufficiali messe a disposizione sul sito elearning2 dove sarà possibile trovare anche esercizi che sono parte costitutiva del corso e argomento d esame. Grazie alla possibilità data dagli ioni potassio di diffondere attraverso la membrana cellulare, questi tenderanno a spostarsi lungo il loro gradiente elettrochimico per raggiungere una situazione di equilibrio. Poiché la pompa sodio potassio continuamente crea una situazione di squilibrio, (molti ioni potassio all interno della cellula, molti all esterno della cellula) c è una spinta per gli ioni potassio a portarsi dalla regione a maggior concentrazione (liquido intracellulare) alla zona dove sono meno concentrati (liquido extracellulare). Tuttavia questa spinta verso l esterno dovuta alla diversa concentrazione è controbilanciata continuamente dalla presenza di residui proteici carichi negativamente ovvero gli anioni proteici adesi sul versante citoplasmatico della membrana che attraggono gli ioni potassio verso l interno. Si creerà così una situazione di equilibrio per cui ci sarà una separazione di cariche (che crea una differenza di potenziale di membrana) tale che si avrà un accumulo di anioni proteici sul versante citoplasmatico della membrana e viceversa un accumulo di cariche positive sul versante extracellulare. Questa separazione di cariche a livello della membrana che corrisponde a una globale elettroneutralità del liquido intracellulare, del liquido extracellulare e della membrana stessa presa nel suo complesso. L elettroneutralità è un requisito fondamentale per permettere l esistenza di organismi pluricellulari in quanto se due cellule fossero elettricamente cariche si respingerebbero e non potrebbero trovarsi vicine. Poiché la membrana cellulare è sede di flussi ionici vede passare correnti elettriche costituite dal flusso ionico. Essendo sede di correnti elettriche può essere rappresentata come un circuito elettrico. Questo tipo di rappresentazione fu introdotta nel 1950 da due medici che per questa loro rappresentazione presero negli anni 60 il premio Nobel per la medicina. L oggetto del loro studio era la segnalazione attraverso i terminali assonici e la propagazione del potenziale d azione, concetto che loro stessi contribuirono a studiare e descrivere sebbene non furono loro ad effettuare la prima misurazione del potenziale d azione che avvenne nel Successivamente Huxley approfondì ulteriormente la propagazione del potenziale d azione fino a formulare un modello matematico dell assone nervoso che viene utilizzato ancora oggi dopo essere stato arricchito. Gran parte della ricerca (ad esempio sui potenziali d azione cardiaci) oggi viene fatta in silico ovvero con algoritmi di simulazione risolti al computer a partire da questo modello arricchito dai canali ionici scoperti successivamente. Ogni membrana cellulare può essere schematizzata come un circuito elettrico nel quale fluiscono cariche elettriche e nel quale sono presenti resistenze elettriche (resistori) che tengono conto della esistenza di canali ionici (strutture proteiche che permettono il movimento degli ioni) e dei condensatori che tengono conto della capacità del doppio strato fosfolipidico di tenere separate le cariche (cariche positive sul versante extracellulare e negative sul versante intracellulare) e quindi dare origine a un potenziale di membrana. Il potenziale di membrana in una cellula isolata e non sottoposta a segnali prende il nome di potenziale di riposo, determinato essenzialmente dagli ioni che possono diffondere attraverso la 1

2 membrana plasmatica. A riposo si tratta per lo più di ioni potassio e quindi il potenziale a riposo di ogni membrana cellulare è relativamente uguale al potenziale di equilibrio degli ioni potassio. Non è esattamente uguale in quanto le varie cellule hanno in certa misura permeabilità anche ad altri ioni (sodio, cloro, al limite anche calcio). Soltanto gli astrociti hanno un potenziale di membrana effettivamente uguale al potenziale di equilibrio del potassio. Così come Nerst aveva derivato la sua equazione che ci dava il potenziale di equilibrio del singolo ione, il modello di Goldmann-Hodgkin- Katz da la possibilità di calcolare il potenziale di una membrana permeabile a più specie ioniche e ci dice che questo potenziale dipende da quanto la membrana è permeabile. Una membrana permeabile solo al potassio avrà potenziale di membrana uguale al potenziale di equilibrio del potassio. Una membrana permeabile solo a sodio avrà potenziale uguale a quello del sodio. N.b. Legge di Nerst: il potenziale è dato da una serie di costanti termodinamiche (R costante dei gas; T temperatura assoluta; F costante di Faraday; z valenza dello ione) e dal logaritmo del rapporto fra le concentrazioni extracellulari e intracellulari dello ione. Ex = RT/zF x ln [X]ext/ [X]int Ricordando che: - a T ambiente la costante RT/F vale -60 mv - il logaritmo di 1 è 0 - il logaritmo di un numero <1 è negativo - il logaritmo di un numero >1 è positivo si prendano in considerazione i seguenti potenziali di equilibrio di alcuni ioni di interesse biologico: Potassio: extracellulare = 3 mm/l ; intracellulare =140 mm/l Essendo la concentrazione intracellulare maggiore di quella esterna il rapporto fra le due risulterà minore di 1. Ln 3/140 = negativo => Potenziale negativo -90mV Sodio: al contrario è più concentrato all esterno rispetto all interno pertanto il logaritmo risulta negativo => Potenziale positivo +50 mv. Cloro: è decisamente più concentrato all esterno che all interno poiché un anione ha il segno negativo => Potenziale negativo -50 /60 mv. A seconda di quanto la membrana cellulare è permeabile al sodio o al potassio il potenziale di membrana si sposta in una direzione o nell altra. Quando la permeabilità ai due ioni è uguale il potenziale di membrana è nullo. Esistono pompe sodio-potassio ATPasi che creano uno squilibrio di concentrazione degli ioni muovendoli contro gradiente di concentrazione (dall ambiente dove è presente in minor quantità a quello in cui è più abbondante). La forza che fa muovere gli ioni spontaneamente è il gradiente elettrochimico. Se il gradiente elettrochimico è diverso da zero gli ioni si muovono, se invece il gradiente elettrochimico è uguale a zero gli ioni non si muovono. Le pompe usano energia quindi per costruire e mantenere lo sbilanciamento a fronte dei movimenti passivi spontanei dello ione che segue il suo gradiente elettrochimico. Dunque per muoversi contro gradiente lo ione utilizza le pompe mentre per seguire il proprio gradiente elettrochimico utilizza delle strutture pertanto chiamate canali ionici, ovvero delle protiene transmembrana che permettono il passaggio degli ioni dall esterno della cellula all interno o viceversa. I canali si trovano a dover però risolvere due problemi: 1- Per il potassio abbiamo circa 140 mm all interno della cellula e 3 all esterno, per il cloro abbiamo circa 4 mm all interno e circa 140 nel liquido extracellulare. Per il calcio abbiamo differenze di volte fra interno ed esterno. È ovvio che ci sono pompe che bruciano ATP per mantenere una differenza di concentrazione di volte. I gradienti elettrochimici non devono essere 2

3 dissipati, perché costa energia mantenerli, quindi le pompe devono fare il loro lavoro. Deve esserci la possibilità di scambiare gli ioni all occorrenza, ma non vogliamo che questo scambio sia aspecifico, cioè che tutti gli ioni possano muoversi come gli pare, perché altrimenti sarebbe tutta energia sprecata. Noi vogliamo delle strutture che facciano passare gli ioni ma solo on demand al momento opportuno. 2- Un canale ionico è una proteina transmembrana, ma è una proteina transmembrana che deve risolvere un problema termodinamico notevole, e questo problema è quello di creare un ambiente idrofilo nel quale passino gli ioni all interno di un doppio strato lipidico idrofobico. Quindi deve essere una struttura che si interfacci da una parte con il lato idrofobico della membrana, ma al contempo crei un ambiente idrofilico per il passaggio degli ioni. Diciamo che l immagine che ci viene in mente è l immagine di una ciambella, con la parte esterna idrofobica che si interfaccia con i fosfolipidi e con all interno un buco nel quale passano gli ioni. Questo buco in realtà ha una porta: Hodgkin-Huxley introdussero il concetto di gate (cancello) che si apre per far passare gli ioni e poi si chiude quando non vogliamo che gli ioni passino. Intanto dobbiamo immaginare il canale come una ciambella con una porta. C è un altro problema, abbiamo detto che la maggior parte delle membrane a riposo presenta una permeabilità selettiva per il potassio. Questo significa che noi abbiamo una ciambella con una porta, e questa porta possiede anche un portiere che sta lì e guarda gli ioni che arrivano e gli dice: tu chi sei? Cloro? e non passi. Questa selezione il portiere la opera a una velocità mostruosa, perché il flusso degli ioni attraverso i canali ionici è nell ordine di 300 milioni-1 miliardo di ioni al secondo, il che vuol dire che c è una struttura che è in grado di porre la domanda: che ione sei? Passi, non passi; circa 1 miliardo di volte al secondo, quindi deve essere una struttura estremamente efficiente, perché fa passare gli ioni potassio, ma non gli ioni sodio, quindi discrimina fra ioni estremamente simili. Sodio e potassio sono entrambi metalli alcalini nella prima colonna della tavola degli elementi e sono uno sotto l altro, quindi sono estremamente simili come natura chimica. Tuttavia noi abbiamo strutture proteiche in grado di far passare con grade efficienza il potassio e non il sodio. Tenete presente che questo problema è abbastanza complicato perché gli ioni potassio sono più grandi degli ioni sodio. Non ci basta il concetto di scolapasta. Teniamo la pasta e togliamo l acqua, ma noi vogliamo tenere l acqua e togliere la pasta (togliere gli ioni sodio e tenere gli ioni potassio). Il canale del potassio è il canale ionico minimale, che dal punto di vista evolutivo è stato uno dei primi a svilupparsi nei batteri ed è rimasto praticamente identico dai batteri all uomo. L altro canale che si è evoluto molto presto è quello del cloro perché è l anione corrispondente del potassio. Ricordate il principio di elettro neutralità: se esce potassio, il cloro deve entrare, o deve potersi muovere; se esce potassio deve poter uscire anche il cloro, si deve mantenere l elettro neutralità. I canali ionici più antichi filogeneticamente, sono quelli per il potassio e per il cloro. Quello più studiato di tutti è sicuramente quello per il potassio e per la risoluzione della struttura è stato dato nel 2003 il premio Nobel per la chimica (struttura acquaporine e canali per il potassio). [Nobel per la medicina conferito, pochi giorni fa, a una direttrice dell istituto di medicina tradizionale che studiando i principi attivi delle piante della medicina tradizionale cinese, ha riscontrato questo principio attivo che è l'artemisinina, che è attivo contro il parassita della malaria e che quindi è un farmaco che riesce a curare almeno il 23 % di casi di malaria, addirittura il 33% nei bambini. Metà l ha vinto lei e l atra metà è stata divisa tra un giapponese e un irlandese che vive in America, che hanno identificato un farmaco per trattare un parassita che causa l elefantiasi e un altro che causa cecità, quindi dei parassiti che il professore di microbiologia saprà spiegarvi meglio.] Tornando ai canali del potassio, noi abbiamo una ciambella con una porta che si apre e si chiude ed è in grado di interrogare gli ioni che si presentano alla velocità di 100 milioni di volte al secondo. Tenete presente che normalmente con un alto flusso non si fa una grande selettività: se tanta gente entra tutta insieme allo stadio qualcuno si imbuca, perché non si riesce a controllare tutti. Nei canali ionici si riesce a garantire un alto flusso senza fare imbucare nessuno. Come è fatta questa struttura e soprattutto come esclude gli ioni piccoli e come fa passare quelli grandi? Rifacciamo un passo indietro, al corso di chimica voi 3

4 sicuramente avete studiato che tutti gli ioni esistono solo alla forma idrata in soluzione. Quindi c è lo ione potassio che sta lì bello tranquillo e attrae l acqua, perché l acqua è una molecola polare, per cui c è un grosso atomo di ossigeno che fondamentalmente è lievemente elettronegativo e 2 atomi di idrogeno che sono fondamentalmente dei protoni. Quindi avremo il nostro ione potassio che attirerà delle molecole di acqua che si deformeranno mettendo l ossigeno, come dire appiccicato al potassio e 2 protoni il più lontani possibile. Naturalmente i 2 protoni andranno ad attrarre altre molecole d acqua quindi si creerà un guscio di idratazione. Lo ione potassio in soluzione, in un liquido intracellulare è circondato da molecole di acqua e essenzialmente è attaccato, con legami elettrostatici, con atomi di ossigeno. Gli ioni potassio hanno una grande affinità per l ossigeno, però a loro tutto sommato interessa anche poco se gli ioni ossigeno con i quali vogliono interagire glieli provvede l acqua o un'altra struttura. Come possiamo immaginare come sia fatto il filtro di selettività del canale ionico selezione a potassio? Il filtro di selettività è una struttura che fa da portiere. Come è fatto? Se lo ione potassio vuole interagire con gli atomi di ossigeno, possiamo immaginare che il filtro di selettività esponga nel passaggio obbligato degli ioni potassio, degli ioni ossigeno. Quindi noi immaginiamo il canale come una clessidra, con una struttura ristretta, che è un passaggio obbligato e tutti i canali ionici che considereremo hanno questo restringimento obbligato. Nel punto in cui il canale è più stretto, quindi nel collo della clessidra sono presenti delle strutture che operano nel modo più efficiente possibile la selezione. Nel caso del potassio sono presenti degli atomi dell ossigeno. Abbiamo detto che il potassio è più grande del sodio e allora se noi mettiamo 4 atomi di ossigeno a una distanza tale per cui il grosso ione potassio interagisce con tutti, ma il piccolo ione sodio non ce la fa perché se interagisce con uno non arriva a interagire con l altro. Abbiamo inventato una struttura grazie alla quale lo ione potassio può staccarsi dall ossigeno del guscio di idratazione e interagire con l ossigeno del canale ionico e quindi abbiamo inventato una struttura grazie alla quale per lo ione potassio è energeticamente favorevole o comunque energeticamente non dispendioso abbandonare l acqua e legarsi al canale. A quel punto abbiamo uno ione potassio libero dall acqua di idratazione, ma attaccato a 4 atomi di ossigeno. Si sposta da lì per 2 motivi: ci sono nel filtro di selettività, quindi nel collo della clessidra 4 anelli formati ciascuno da 4 atomi di ossigeno, quindi lo ione potassio sta attaccato a un anello, ma in realtà ne ha anche uno un po più in là a cui attaccarsi. Siccome lo ione potassio che si trova in un dato momento nel canale e non è l unico, prima o poi ne arriva un altro e opera una induzione elettrostatica su quello che occupa il canale e lo spinge un po più in là. Quindi il primo ione potassio si muoverà andandosi ad attaccare ad un altro anello di ioni ossigeno e un secondo ione potassio potrà entrare nel canale. Il continuo muoversi di ioni potassio garantisce il flusso e l esistenza di ioni e di atomi di ossigeno garantisce la possibilità per gli ioni potassio di staccarsi dall acqua di idratazione, impegnarsi nel canale e arrivare dall altro lato dove troveranno altra acqua alla quale legarsi. Semplicemente la distanza fra gli atomi di ossigeno è tale che solo il potassio si attacca mentre il sodio che è più piccolo si attacca male. Quindi abbiamo canali selettivi per il potassio. Abbiamo anche detto che esistono: -Canali selettivi per il sodio. Questi che trucco usano? Adesso non va più bene il trucco usato per il potassio, quindi in realtà i canali selettivi per il sodio hanno un filtro di selettività un po diverso. Il sodio perde solo una parte delle molecole di acqua del guscio di idratazione e passa come ione semi idratato attraverso il canale. -Canali selettivi per il calcio -Canali selettivi per l acqua ovvero le acquaporine che fanno passare l acqua, ma come sapete l acqua in realtà seppure in piccola quantità si idrolizza in soluzione, quindi accanto ad H2O mettiamo OH- e H+, talora abbiamo anche un altra forma che è lo ione idronio OH3+. I canali selettivi per l acqua, le acquaporine, fanno passare solo H2O. Non fanno passare alcuna molecola carica. Questo è fondamentale per la vita, per il mantenimento del Ph. Abbiamo detto ieri che il Ph dei liquidi intracellulari è 7.1, mentre quello dei liquidi extracellulari è 7.4 e quello deve essere. Se noi permettessimo ai protoni di passare dentro e fuori con la stessa facilità con cui passa l acqua non 4

5 potremmo controllare l acqua dei liquidi extracellulari. Per controllare separatamente volume e quindi osmolarità e Ph è stato necessario inventare delle strutture proteiche, dei canali specifici per l acqua che contemporaneamente escludono tutte le molecole cariche, incluse lo ione idronio o OH-. Teniamo presente che tuttavia alcune acquaporine oltre che all acqua sono permeabili alla piccole molecole apolari, per esempio il glicerolo e questo però non è un argomento irrilevante perché impone di fare attenzione alle soluzioni che vengono impiegate per reidratare il paziente con terapie infusionali, perché naturalmente una sostanza che abbia un canale per entrare attraverso la membrana cellulare è una sostanza che può richiamare acqua all interno delle cellule, per cui somministrando sostanze come il glicerolo, si può creare edema cellulare. I canali ionici sono proteine transmembrana, sono proteine che hanno un cancello per cui possono passare dallo stato aperto allo stato chiuso, hanno un filtro di selettività che è costituito essenzialmente da una struttura organizzata in modo intelligente nella porzione più stretta del canale. Sono spesso in grado di essere localizzati in regioni particolari della membrana cellulare. Nella placca motrice sono presenti recettori per l acetilcolina e sono concentrati in una densità per micrometro quadrato, o addirittura per micrometro quadrato. Qual e il trucco per tenere un canale in un punto preciso della membrana? Legarlo al citoscheletro. Quindi la maggior parte dei canali ionici viene mantenuta in una regione particolare della membrana attraverso interazione con le proteine del citoscheletro. A questo punto dobbiamo considerare brevemente il concetto di meccanismo che controlla il cancello. Come fanno i canali ad aprirsi e chiudersi? Ogni canale risponde a un segnale particolare. Vi sono: -Canali passivi:sono quasi sempre aperti e danno la conduttanza al potassio che tutte le membrane cellulari hanno. Però questi sono un numero relativamente piccolo di canali. Ogni tanto si chiamavano, in passato si sono chiamati canali passivi, in realtà questa è una definizione che non si usa più, forse la trovare su qualche libro vecchio, però sono comunque canali che sono aperti nella maggior parte delle condizioni, ma anche questi canali possono chiudersi. Chiudere un canale vuol dire chiudere la porta e gli ioni non possono passare. Nella maggior parte delle condizioni fisiologiche questi canali sono aperti. -Esiste una serie di canali comandati dal potenziale di membrana, detti voltaggio-dipendenti, che effettuano la transizione chiuso-aperto nel momento in cui cambia il potenziale di membrana. La maggior parte dei canali voltaggio-dipendenti risponde a depolarizzazione: il canale è chiuso a riposo e si apre quando il potenziale di membrana si depolarizza ovvero quando il potenziale di membrana cambia per la minore separazione di cariche passando ad esempio da -70 mv a -40 o 0 mv. Esistono, tuttavia, dei canali che viceversa si aprono in risposta alla iperpolarizzazione della membrana, cioè rispondono quando il potenziale di membrana da -60mV diventa -70/-80/-90 mv. Anche questi canali sono estremamente importanti; un tipo di canale che risponde ad iperpolarizzazione si trova nelle cellule pacemaker del nodo senoatriale e garantisce il battito cardiaco. -Poi abbiamo i canali ligando-dipendenti, che si aprono quando legano uno specifico ligando, tipicamente un neurotrasmettitore (per esempio, i recettori dell acetilcolina che si trovano nella giunzione neuromuscolare). -Esistono inoltre canali che rispondono a stimoli diversi, che possono essere chimici: per esempio, canali che rispondono alla presenza di capsaicina (la sostanza che rende piccante il peperoncino) o alla presenza di vaniglia (detti recettori vanilloidi). Ma questi stessi recettori rispondono anche a variazioni di temperatura o a stimoli meccanici. Sono canali ionici con meccanismi di apertura più complessi; quelli che reagiscono a stimoli meccanici spesso sono legati al citoscheletro (li vedremo nel dettaglio quando parleremo dell orecchio interno) e reagiscono a deformazioni della membrana con l apertura del canale, lasciando quindi passare ioni. 5

6 I canali ionici sono proteine, che vengono codificate da geni specifici. Possono esserci però delle mutazioni nel gene; questo fa sì che il canale che si produce sia errato. Molte mutazioni a carico dei geni che codificano per canali ionici sono letali, non compatibili con la vita. Altre, tuttavia, non sono così distruttive e permettono la nascita di individui che però risultano malati. La più frequente mutazione di un canale ionico è quella che causa la fibrosi cistica, la più comune malattia genetica nella popolazione caucasica; infatti, le mutazioni del canale CFTR colpiscono circa 1/5000, ma danno luogo a fenotipo malato solo in casi più rari. Inoltre, moltissimi altri canali sono soggetti a mutazioni, le quali portano a malattie che negli ultimi venti anni sono state raggruppate sotto il nome di canalopatie, che possono colpire qualunque canale, da quello della fibrosi cistica ai canali voltaggio-dipendenti del sodio (dando luogo a difetti nella trasmissione dell impulso elettrico) che possono colpire il tessuto nervoso (epilessie), il tessuto cardiaco (cardiopatie), il tessuto muscolare (miopatie). Esistono poi patologie a carico dei canali del cloro, che sono multisistemici perché tutte le cellule presentano questi canali. Ci sono, inoltre, patologie dei canali del cloro o dei canali del potassio specificatamente renali. Ora dobbiamo chiarire qual è la funzione del canale ionico. Cosa cambia in una cellula se il canale ionico si apre? Il potenziale di membrana. Quindi, se si aprono improvvisamente dei canali ionici permeabili al sodio, il potenziale di membrana assumerà dei valori depolarizzati. E poiché le nostre cellule vivono di segnali elettrici (tant è che la morte cerebrale viene diagnosticata come assenza di segnali elettrici dal tessuto nervoso), i potenziali di membrana sono alla base della vita. I canali in condizioni di riposo, quindi quando la cellula non è stimolata, devono essere chiusi; si tratta di una condizione nella quale gli ioni non possono passare. Poi abbiamo la condizione di canale aperto, nella quale gli ioni possono passare secondo il loro gradiente elettrochimico. Infine, esiste una serie di altre configurazioni che non sono né aperte né chiuse; sono configurazioni in cui il canale è inattivato. Un canale inattivato non fa passare ioni ma non è chiuso. La differenza tra i due sta nel fatto che: -un canale chiuso, quando arriva il segnale, si apre -un canale inattivato, quando arriva il segnale, rimane inattivato. Per esempio, i canali voltaggio-dipendenti sono attivati dalla depolarizzazione; ciò significa che questi canali sono chiusi a potenziale di riposo, si aprono quando il potenziale di membrana si depolarizza. Ma quando la depolarizzazione perdura, il canale diventa inattivato: questo vuol dire che si tratta di canali che, se stimolati troppo, rimangono inattivati e non funzionali. Perciò, lo stato inattivato è un stato non funzionale, che non fa passare ioni e che non risponde nemmeno ai segnali. È un segnale molto importante per il buon funzionamento delle cellule. Molte delle patologie che affliggono i canali ionici a livello cardiaco colpiscono proprio la capacità dei canali ionici di inattivarsi; la perdita della capacità di questi canali di inattivare dà luogo ad aritmie cardiache anche letali. Come già detto, l apertura dei canali ionici porta alla variazione della conduttanza di membrana per quegli ioni e, quindi, a un cambiamento del potenziale di membrana, che si avvicina al potenziale di equilibrio di quel determinato ione. I canali ionici voltaggio-dipendenti sono una grande famiglia di canali, probabilmente costituiscono la più grande famiglia di proteine transmembrana. Per famiglia di proteine si intende un insieme di proteine che hanno una struttura simile, o anche solo vagamente simile, ma che comunque derivano da un unico antenato comune, che nel caso dei canali ionici voltaggio-dipendenti a selettività cationica (cioè permeabili a cationi) è proprio il canale del potassio dei batteri, di cui 6

7 parlavamo prima. Questi canali hanno tutti una struttura comune a quella del canale primordiale: è una struttura relativamente semplice, formata da quattro subunità tutte uguali, ciascuna delle quali contiene due alfa eliche che attraversano la membrana ed un segmento che unisce le due alfa eliche sul versante extracellulare e che si ripiega all interno della membrana con una struttura a foglietto beta prendendo il nome di ansa p (p come poro, poiché è proprio la struttura che forma il poro ionico). Quindi, quattro ripetizioni di questa struttura molto semplice creano il canale primordiale in cui gli ioni potassio possono passare legandosi agli atomi di ossigeno esposti dai residui presenti nel dominio p. La struttura primordiale che ha formato il canale è quindi questa struttura con due alfa eliche e un segmento p e contiene gli elementi fondamentali del canale, ovvero il poro ionico, il filtro di selettività e i meccanismi per controllare l apertura del canale. In questa famiglia di canali la struttura con due alfa eliche e un dominio p ricorre in tutti i canali, ma si è arricchita con altri elementi: esistono, per esempio, canali con quattro ripetizioni della struttura a due alfa eliche e un dominio p, oppure canali con quattro ripetizioni con sei alfa eliche e un dominio p (i due tipi più frequenti). Ci sono, inoltre, casi in cui tutte e quattro le ripetizioni sono codificate da un unico gene; in altri casi invece ciascuna ripetizione è codificata da uno specifico gene, formando un eterotetramero, cioè una proteina in cui si osservano quattro subunità diverse per fare un unico canale. Un caso molto interessante è quello intermedio in cui un gene codifica per una doppia sequenza (cioè due alfa eliche e un dominio p più due alfa eliche e un altro dominio p): quindi il gene produce una proteina con quattro alfa eliche e due domini p e due di questi monomeri si assemblano a formare il canale con quattro alfa eliche e quattro domini p. Sono proprio questi i canali passivi presenti in tutte le cellule e che danno la conduttanza al potassio. A partire dal canale per il potassio primordiale e aggiungendo alfa eliche a scelta continuando a mantenere un unico dominio p, si è evoluto un numero estremamente elevato di canali: canali permeabili al potassio (codificati nell uomo da circa una trentina di geni e assemblati in modo adeguatamente complesso); canali voltaggio dipendenti per il sodio; canali voltaggio dipendenti per il calcio; tutti i canali attivati per iperpolarizzazione; tutti i canali attivati dalle cellule sensoriali, per esempio coni e bastoncelli (CNG) nella retina, recettori gustativi, meccanocettori della cute, recettori dolorifici; i canali pacemaker del cuore (HCN) i canali recettoriali sensibili alla capsaicina e vanilloidi, detti canali TRP (Transient Receptor Potential) che sono presenti in moltissime cellule e necessari in numerosi processi, dalla percezione del peperoncino piccante al corretto funzionamento delle cellule renali. Mutazioni dei canali TRP causano la malattia policistica renale, che è la malattia genetica renale più diffusa nella popolazione caucasica. A questa grande famiglia di canali ionici voltaggio-dipendenti appartengono anche alcuni canali attivati da ligando che sono i recettori del glutammato, che presentano comunque il motivo con due alfa eliche e un ansa p. Gli unici assolutamente estranei a questa famiglia sono i recettori dell acetilcolina della giunzione neuromuscolare. Abbiamo detto che i canali voltaggio dipendenti derivano tutti da questa struttura primordiale e possono avere stati diversi (aperto, chiuso, inattivato). Ma rispetto ad una proteina dal peso molecolare di 50kDa, cosa vuol dire che un canale è aperto oppure no? La porta del canale non è una struttura fisica particolarmente ben identificata; infatti, l apertura del canale corrisponde ad una modificazione della conformazione delle alfa eliche che lo compongono, che sono intrecciate in un certo modo quando il canale è chiuso, mentre quando esso si apre si dispongono in un modo 7

8 diverso, esponendo così i residui che permettono la selezione degli ioni. Quindi, l apertura corrisponde a piccoli spostamenti o rotazioni di alfa eliche, che così passano da una conformazione con un certo angolo ad una conformazione con un altra angolatura, permettendo il passaggio dello ione. È un po come il meccanismo con cui funziona una macchina fotografica reflex: quando viene scattata la foto, si apre l otturatore grazie al movimento delle lamelle, ciò permette il passaggio della luce. Negli ultimi trenta anni, è stata utilizzata una tecnica per misurare il flusso di corrente attraverso il singolo canale ionico: è la tecnica del Patch clamp messa a punto sul finire degli anni 70 e perfezionata nei primi anni 80, che ci permette di misurare la piccola corrente che passa quando un canale si apre. Per comprendere gli ordini di grandezza, si pensi che la batteria di un orologio da polso in genere è da 5V; il potenziale di membrana di una tipica cellula muscolare delle nostre gambe è di circa 0.1V, che è un valore abbastanza importante. Invece, le correnti delle cellule viventi sono molto piccole. La corrente del caricabatterie del cellulare è circa 2 Ampere; mentre la corrente che passa attraverso un singolo canale è di un millesimo di miliardesimo di Ampere, cioè Ampere: si tratta quindi di ordini di grandezza decisamente più piccoli. Sul sito Elearning potete trovare un esercizio che vi dimostra che per cambiare il potenziale di membrana di 100mV, quindi da -50mV a +50mV, sono sufficienti circa un milione di ioni, che sono pochi; è ovvio che si tratti quindi di una corrente molto piccola ma con importante significato biologico. Perciò le correnti che attraversano un singolo canale sono correnti molto piccole, quelle totali che attraversano la membrana possono essere un po più grandi. Perciò in cellule grandi, con molti canali, si può arrivare all ordine di microampere, cioè 10-6 Ampere in una fibra muscolare. Attraverso i canali ionici, dunque, misuriamo una corrente di qualche ma che dura qualche millisecondo. Occupandoci di canali voltaggio-dipendenti, definiamo le loro caratteristiche: Appartengono alla famiglia derivata dal canale batterico primordiale del potassio Effettuano la transizione chiuso-aperto in risposta a variazioni del potenziale di membrana In generale, quelli aperti da depolarizzazione, hanno un elevatissima selettività. Si parla dunque di canali selettivi per il K+, o per il Na+, o per il Ca++. (Vi sono anche canali selettivi per il Cloro che sono in parte voltaggio dipendenti, però appartengono ad un altra famiglia ed hanno meccanismi di voltaggio-dipendenza completamente diversi) Essendo la fisiologia una scienza quantitativa, si parla di fenomeni misurabili. Possiamo misurare i fenomeni elettrici di membrana utilizzando strumenti elettrici più o meno sofisticati, mettendo elettrodi nelle cellule e misurando le correnti che passano ed i potenziali. CANALI VOLTAGGIO DIPENDENTI ATTIVATI DALLA DEPOLARIZZAZIONE. Ne considereremo tre tipi: permeabili al K, al Na, al Ca. Hanno tutti la stessa struttura di 4 ripetizioni di 6 alfa eliche ed un ansa P. Una delle alfa-eliche presenta dei residui carichi positivamente che la rendono sensibile al potenziale di membrana. La presenza di cariche elettriche positive fa sì che quando cambia il potenziale elettrico di membrana cambia la struttura del canale e questo passa dallo stato chiuso allo stato aperto. Al cambiare del potenziale di membrana questa struttura carica elettricamente ovvero il canale si apre, chiude o inattiva. 8

9 CANALI VOLTAGGIO-DIPENDENTI SELETTIVI PER IL POTASSIO (K+) sono presenti in tutti i tipi cellulari, ve ne sono di molti tipi. Essendo il canale per il potassio il canale primordiale, vi sono una trentina di geni che codificano per sue subunità che poi si possono combinare a dare funzioni diverse. Ovviamente la funzione dell apertura dei canali del potassio è aumentarne la permeabilità di membrana, e quindi portare il potenziale di membrana a valori vicini al potenziale di equilibrio del potassio, che è -70/-80/-90 mv in base al tipo di tessuto considerato.. Quindi la funzione dei canali per il potassio è di stabilizzare il potenziale di membrana a valori negativi, tenere quieta la cellula al suo potenziale di riposo, o riportarcela se il potenziale è cambiato per effetto di altri canali. Fondamentalmente ripolarizza la membrana, che si è depolarizzata: si attivano canali voltaggiodipendenti per il potassio e la membrana si ripolarizza, ripristinando la separazione delle cariche. Abbiamo diverse strutture: le subunità possono essere tutte uguali o tutte diverse, con il risultato di ottenere funzione diverse (come la capacità di inattivazione). Osservando il grafico (slide 2, pag 2 canali voltaggio-dipendenti vedi elearning2) che rappresenta la corrente che attraversa un canale per il potassio (nelle fasi di depolarizzazione e ripristino del potenziale) si vede che istantaneamente una corrente si sviluppa, poi rapidamente diminuisce e ne rimane una coda. Infatti verosimilmente nella membrana della cellula oggetto di studio noi avevamo due tipi di canali per il potassio, di cui uno presenta il fenomeno di inattivazione: se lo stimolo perdura, il canale smette di funzionare, ed un altro tipo che non si inattiva e perdurando lo stimolo il canale continua a funzionare. Ciò è utile per dire che canali diversi con funzioni diverse possono causare segnali diversi, ed ai fini del funzionamento della cellula sono necessari entrambi i tipi. Ad esempio, nei cardiomiociti ventricolari abbiamo una iniziale depolarizzazione rapida seguita da una ripolarizzazione molto più lenta. Quindi le cellule hanno molti canali per il potassio, tutti mantengono il potenziale di membrana vicino a quello di equilibrio del potassio, ma i vari canali hanno anche funzioni diverse che entrano in azione in momenti diversi, a potenziali diversi, per garantire alle cellule il loro vasto repertorio funzionale. CANALI SELETTIVI PER IL SODIO (Na+) sono presenti solo in alcuni tipi cellulari. Essenzialmente si trovano in cellule del muscolo scheletrico, del muscolo cardiaco, negli assoni neuronali, alcune cellule del muscolo liscio e pochi altri tipi cellulari. Collettivamente questi tipi cellulari rappresentano le cellule eccitabili : la presenza di canali voltaggio-dipendenti per il sodio permette a queste cellule funzioni particolari. L apertura di un canale voltaggio-dipendente per il sodio corrisponde ad un aumento della permeabilità al sodio quindi ad uno spostamento del potenziale di membrana verso il potenziale di equilibrio del sodio, quindi una depolarizzazione di membrana, poiché il potenziale di equilibrio del sodio è di +55 mv. La membrana sta al potenziale di riposo (-70 mv), arriva uno stimolo che fa aprire i canali voltaggiodipendenti del sodio, il potenziale di membrana schizza verso +55 mv. I canali voltaggio dipendenti per il sodio hanno una cinetica di attivazione molto rapida, poiché rispondono molto rapidamente a variazioni del potenziale di membrana. Impiegano poche decine di microsecondi (10-6 ). Nel giro di 2 millisecondi tali canali si sono aperti ed inattivati. In 4 millisecondi la corrente che li attraversa è iniziata e finita. I canali del sodio presentano marcatamente il fenomeno della inattivazione: se la membrana si depolarizza il canale si apre, ma se la depolarizzazione permane il canale si inattiva, perché è presente una struttura che viene trascinata a chiudere fisicamente il canale dall interno in seguito alla depolarizzazione stessa. Il modello si basa su evidenze sperimentali: se la cellula viene trattata con enzimi proteolitici che tagliano la catena di chiusura intracellulare si perde la capacità di 9

10 inattivazione. Se l inattivazione viene a mancare in cellule muscolari cardiache possono insorgere malattie letali. I canali del sodio sono bloccati dal veleno del pesce palla, che ha come principio attivo la Tetrodotossina (TTX). Infatti il pesce palla colpisce con un aculeo la preda, iniettando il veleno e paralizzandola. Nell uomo esistono 9-10 geni che codificano per diverse isoforme delle subunità dei canali voltaggiodipendenti per il sodio: le varie isoforme predominano in diversi tipi cellulari, una nel tessuto muscolare cardiaco, una nel tessuto muscolare scheletrico, due o tre nei neuroni del SNC, una nei neuroni sensoriali etc. Isoforme diverse hanno momenti di inattivazione diversa. Quindi il punto di inattivazione dipende non dalla cellula in sé ma dall isoforma del canale espressa in quel tipo cellulare. Confrontandoli con i canali del potassio, I canali voltaggio-dipendenti del sodio rispondono prontamente mentre quelli per K+ più lentamente. CANALI VOLTAGGIO-DIPENDENDI SELETTIVI PER IL CALCIO hanno due funzioni: Depolarizzare la membrana, poiché il potenziale di equilibrio del potassio è intorno a 100 mv Caricare il citoplasma di ioni Ca++, che hanno funzione di secondo messaggero. 10