Per poter misurare una ddp ai capi di una membrana cellulare occorrono due elettrodi conduttori (uno di misura e uno di riferimento) che permettono

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2 Per poter misurare una ddp ai capi di una membrana cellulare occorrono due elettrodi conduttori (uno di misura e uno di riferimento) che permettono di misurare separatamente il potenziale intracellulare e quello extracellulare e di farne la differenza. Inizialmente, se i due elettrodi sono immersi nella soluzione esterna, non si misurerà nessuna ddp in quanto gli ioni sono distribuiti uniformemente in tutta la soluzione. Quando però il microelettrodo misuratore penetra leggermente attraverso la membrana cellulare venendo in contatto con la soluzione intracellulare, l oscilloscopio segna bruscamente una variazione negativa verso il basso del potenziale di membrana indicando che il potenziale a riposo della cellula è negativo. Ripetendo la misura su cellule diverse si nota che i valori di Vm variano tra -40 e -90 mv a seconda del tipo cellulare. Inserendo questo elettrodo in profondità nel citoplasma, non si osservano significative variazioni ad indicare che il mezzo intracellulare è sostanzialmente isopotenziale e che tutta la caduta è a cavallo della membrana plasmatica. 2

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8 Per poter capire l origine del potenziale di membrana cominciamo ad analizzare una situazione molto semplice. Consideriamo per es. una cellula ideale in cui le soluzioni, interna ed esterna siano composte solo da due ioni il K e il Cl in uguale concentrazione (10 mm) e che la cellula sia permeabile solo al K+, cioè la cellula ha dei canali specifici solo al K. In queste condizioni i soli ioni che possono equilibrarsi sono gli ioni K che possono spostarsi attraverso la cellula, ma essendo le due concentrazioni uguali non c è movimento netto di cariche e quindi il potenziale di membrana che era inizialmente 0 rimane tale. 8

9 Due costituenti strutturali della membrana danno origine a due corrispondenti proprietà elettriche: 1) il doppio strato lipidico, impermeabile agli ioni, mantiene separate le cariche elettriche; esso conferisce alla membrana la proprietà della capacità; 2) i canali ionici provvedono ad un passaggio attraverso cui gli ioni inorganici trasportano cariche attraverso la membrana, conferendole la proprietà della conduttanza; Capacità della membrana Le membrane cellulari sono molto sottili (5 nm) e virtualmente impermeabili agli ioni, di conseguenza possono violare, a livello microscopico, il principio dell elettroneutralità delle soluzioni e separare cariche elettriche negative da un lato e positive dall altro lato della membrana che verranno ad interagire tra loro a causa del ridotto spessore della membrana La capacità della membrana, circa 1-3 Farad/cm 2 nelle membrane biologiche 1) aumenta in proporzione alla costante dielettrica (circa 3 nelle membrane biologiche); la costante dielettrica è la proprietà di un isolante come il doppio strato lipidico di separare cariche elettriche 2) diminuisce in relazione allo spessore della membrana. 9

10 Capacità elettrica della membrana Comunque, sebbene gli ioni non possano attraversare il doppio strato lipidico se non tramite i canali ionici, essi possono interagire tra un lato e l'altro della membrana, che funziona come una sottile pellicola isolante, per produrre una corrente capacitativa (o spostamento di carica) anche quando le cariche non attraversano fisicamente la membrana. Quando viene applicata una differenza di potenziale attraverso una membrana, gli ioni positivi tendono a migrare dal lato positivo (anodo) verso il lato negativo (catodo) in conseguenza della forza del campo elettrico applicato. Poiché gli ioni non possono attraversare il doppio strato lipidico, essi tendono ad ammassarsi sulle due superfici della membrana, i cationi sul lato anodico e gli anioni su quello catodico, producendo in tal modo un eccesso netto di ioni di carica opposta ai due lati della membrana. La membrana può quindi accumulare cariche analogamente ad un condensatore inserito in un circuito elettrico. Come abbiamo già detto in precedenza, l'abilità della membrana nel separare e accumulare cariche elettriche in questo modo costituisce la sua capacità elettrica, misurata in coulomb/volt, o farad (F). La quantità di carica che può essere separata da uno strato di materiale isolante dipende dallo spessore di quest'ultimo e dalla sua costante dielettrica, una proprietà che riflette l'abilità di un isolante di accumulare carica. Quindi, se si conoscono lo spessore della membrana e la costante dielettrica dei lipidi di membrana è possibile calcolare la capacità 10

11 delle membrane neuronali. Se si considera, infatti, uno spessore di 5 nm e una costante dielettrica di 3 la capacità di membrana si aggira introno ad 1 microfarad per centimetro quadrato. Questa capacità di membrana influenza decisamente la velocità alla quale il voltaggio transmembrana può cambiare in determinate condizioni. Infatti, se prendiamo come esempio un circuito equivalente della membrana neuronale e applichiamo una corrente costante Im, di 1 ampere, questa provoca una diminuzione del voltaggio. Questa variazione passiva del potenziale, detta potenziale elettrotonico, è dovuta alla corrente che passa attraverso la membrana. Quando viene fatta passare corrente attraverso la membrana, all'inizio, le cariche si muovono con relativa facilità andando a caricare il condensatore, mentre poca corrente fluisce attraverso la resistenza della membrana. L'accumulo di carica sulle armature del condensatore è una forma di corrente elettrica anche se nessuna carica si sposta fisicamente attraverso il condensatore stesso. Infatti, la corrente capacitativa, Ic, è dovuto allo spostamento di cariche che si depositano, o si allontanano, ai lati opposti del doppio strato lipidico. Man mano che il tempo passa ed il condensatore si carica, tra le sue armature si crea una differenza di potenziale che rallenta la velocità di un ulteriore caricamento, mentre una sempre maggiore frazione di corrente fluisce attraverso la resistenza. Dunque, la corrente capacitativa, Ic, decade esponenzialmente nel tempo, mentre il potenziale di membrana, Vm, cresce con lo stesso andamento temporale. Allo stesso tempo, la corrente resistiva, II, che fluisce attraverso la conduttanza della membrana (cioè, attraverso i canali ionici) aumenta esponenzialmente, dato che la somma Ic e II deve essere necessariamente uguale alla corrente totale applicata. La relazione tra potenziale e il tempo durante il caricamento del condensatore è data dalla seguente equazione: Vt = V (1 e-t/rc) dove V è il potenziale attraverso il condensatore al tempo t = prodotto da una corrente costante applicata al circuito, t è il tempo in secondi trascorso dall'inizio dell'impulso di corrente, R è la resistenza del circuito in ohm, C è la capacità del circuito in farad, e Vt è il potenziale attraverso il condensatore ad ogni istante di tempo t. Quando t è uguale al prodotto RC, il valore di t è noto come costante di tempo (τ) del processo). Essa rappresenta il tempo richiesto perché il voltaggio attraverso un condensatore in carica raggiunga il 63% del suo valore asintotico. 10

12 Se immaginiamo che la cellula contiene una concentrazione 10 volte più elevata di K, in queste condizioni gli ioni K intracellulari diffondono 11

13 Se immaginiamo che la cellula contiene una concentrazione 10 volte più elevata di K in queste condizioni gli ioni K intracellulari diffondono verso l esterno attraverso i canali aperti con una probabilità 10 volte maggiore a quella degli ioni K extracellulari che diffondono verso l interno della cellula. Quindi si muoveranno spinti da un gradiente di potenziale chimico 12

14 La diffusione crea un accumulo di ioni K all esterno che aumenta la carica positiva extracellulare. In parallelo diminuisce proporzionalmente la carica positiva intracellulare che rende l interno della cellula più negativo rispetto all esterno. Questo processo determina la perdita della perfetta elettroneutralità delle soluzioni che si trovano ad avere nel compartimento INTERNO un deficit di cariche + e nel compartimento ESTERNO un eccesso. Di conseguenza si genera una ddp elettrico tra i due compartimenti, inizialmente equipotenziali, con polarità positiva nel compartimento (extracellulare) e negativa nel compartimento (intracellulare). 13

15 Da questo momento in poi anche le forze elettriche cominciano ad avere un azione importante sugli ioni. Infatti la differenza di potenziale che si crea a cavallo della membrana contrasta il movimento di ioni K verso l esterno 14

16 È facilmente intuibile che il processo potrà raggiungere un equilibrio, in cui i flussi unidirezionali degli ioni da sx a dx e da dx a sx saranno uguali, quando il gradiente di concentrazione e quello elettrico saranno uguali e contrapposti. In queste condizioni si dice che lo ione K ha raggiunto il suo equilibrio elettrochimico e la differenza di potenziale che si genera è chiamata potenziale di equilibrio del K 15

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18 È possibile calcolare in maniera rigorosa il potenziale elettrochimico dello ione permeabile K+ all equilibrio attraverso l equazione di Nernst. L equazione di Nernst si può ulteriormente semplificare se si calcola il rapporto RT/xF per un catione monovalente alla temperatura di 20 C e si trasformano i logaritmi naturali in logaritmi decimali 17

19 L equazione di Nernst permette di calcolare il potenziale di equilibrio di una sola specie ionica se si conosce esattamente la sua concentrazione nei due compartimenti cellulari. Inoltre il potenziale di equilibrio sarà positivo se il catione è più concentrato nel lato extracellulare, perché il rapporto [X]e/[X]i>1, il segno è invertito se lo ione è più concentrato nel lato intracellulare perché il rapporto [X]e/[X]i<1. Se lo ione è un anione succederà l opposto perché z è negativo e il fattore di moltiplicazione è -58 mv per z= -1. Per gli ioni divalenti come il calcio e il Mg che hanno z=+2 il fattore di moltiplicazione è 29 mv Possiamo calcolare i potenziali di equilibrio degli ioni più importanti. È interessante osservare come il potenziale di equilibrio del K è molto negativo mentre quello del Na è di segno opposto con una differenza netta tra i due di circa 153 mv. I potenziali di equilibrio del Na e del Ca sono entrambi molto positivi e originano dalla maggiore concentrazione dei due ioni sul lato extracellulare della membrana. Sia il Na che il Ca per raggiungere l equilibrio entrano nella cellula attraverso i rispettivi canali e rendono l interno più positivo rispetto all esterno. Si può notare che il potenziale di equilibrio degli ioni Cl è negativo in quanto questi ioni sono maggiormente concentrati nel liquido extracellulare. La loro diffusione verso l interno della cellula per raggiungere l equilibrio rende questo lato della cellula più negativo rispetto all esterno. 18

20 L equazione di Nernst è in grado di predirre il potenziale di riposo di una cellula solo se quest ultima è permeabile ad una sola specie ionica. Questa chiaramente non è una condizione fisiologica accettabile. Nel caso dei neuroni e di altre cellule eccitabili l equazione di Nernst predice a riposo un potenziale di circa -90 mv se le cellule sono permeabili solo al K. In realtà i potenziali di riposo effettivamente misurati sono in media tra -60 e -70 mv, quindi più positivi. Questo significa che altri ioni, oltre al K, sono coinvolti nel mantenere il potenziale di riposo della cellula. Per es. le cellule a riposo sono debolmente permeabili al Na che è maggiormente concentrato all esterno e può entrare nella cellula e rendere il potenziale di membrana più positivo. Risulta quindi evidente che il valore del potenziale di riposo di una cellula non dipende solo esclusivamente dai gradienti ionici dei vari ioni ai lati della membrana ma dipende anche dalle proprietà di permeabilità di quest ultima ai vari ioni. E c è una equazione che permette di calcolare il potenziale di membrana di una cellula permeabile a più ioni quando si conoscono le loro permeabilità attraverso la membrana e questa è l equazione di Goldman o equazione di Goldman-Hodgkin-Katz. Nelle cellule di mammifero Na, K e Cl sono i tre ioni che maggiormente influenzano il potenziale di membrana a riposo, per cui nella sua forma generale questa equazione può essere scritta: 19

21 Dove Vm è il potenziale di membrana a riposo a 20 C. PK, PNa, PCl indicano la permeabilità della membrana a K, Na, Cl. Da una prima osservazione della formula risulta evidente che Vm approssima maggiormente il potenziale di equilibrio dello ione che ha la permeabilità relativa maggiore rispetto agli altri. Se la membrana non è permeabile a un determinato ione (P=0) il contributo di quello ione è nullo e i suoi termini sono omessi nell equazione. Gli ioni potassio hanno la permeabilità di gran lunga maggiore rispetto agli altri ioni. Se poniamo la permeabilità del potassio uguale a 1 i coefficienti di permeabilità relative di sodio e cloro saranno rispettivamente di 0,04 e 0,45. Di conseguenza, il potenziale di membrana a riposo cellulare è più vicino all Ek di -90 mv che all ENa=+60 mv. 19

22 Una piccola quantità di ioni Na fluiscono nella cellula rendendo l interno della cellula meno negativo di quanto sarebbe se il Na venisse totalmente escluso. Ulteriore Na che entra nella cellula viene pompato fuori dalla Na/K-ATPasi. Contemporaneamente gli ioni K che sono usciti dalla cellula vengono pompati dentro sempre dalla stessa pompa. La pompa contribuisce al potenziale di membrana portando fuori 3 Na per ogni 2K che porta dentro la cellula. Poiché la Na/K-ATPasi favorisce il mantenimento del gradiente elettrico, è definita pompa elettrogenica. 20

23 Con il passare del tempo, la concentrazione intracellulare di ioni sodio e potassio non cambia perché la pompa Na+/K+-ATPasi mantiene la concentrazione di Na+ e di K+ a livelli stabili. Na che entra nella cellula viene pompato fuori dalla Na/K-ATPasi. Contemporaneamente gli ioni K che sono usciti dalla cellula vengono pompati dentro sempre dalla stessa pompa. La pompa contribuisce al potenziale di membrana portando fuori 3 Na per ogni 2K che porta dentro la cellula. Poiché la Na/K-ATPasi favorisce il mantenimento del gradiente elettrico, è definita pompa elettrogenica. Finchè i gradienti di concentrazione rimangono stabili e le permeabilità ioniche della membrana plasmatica non cambiano, anche il potenziale elettrico transmembrana a riposo rimarrà costante. 21

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