RISPOSTA ANTICORPALE VERSO LEUCOTOSSINA DI MANNHEIMIA (PASTEURELLA) HAEMOLYTICA IN BOVINI AFFETTI DA MALATTIA RESPIRATORIA

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1 Large Animals Review, Anno 11, n. 1, Febbraio RISPOSTA ANTICORPALE VERSO LEUCOTOSSINA DI MANNHEIMIA (PASTEURELLA) HAEMOLYTICA IN BOVINI AFFETTI DA MALATTIA RESPIRATORIA BOVINI SANDRO CAVIRANI, SIMONE TADDEI, CLOTILDE SILVIA CABASSI, GAETANO DONOFRIO, FRANCESCA GHIDINI, CESIDIO FILIPPO FLAMMINI Dipartimento di Salute Animale - Università degli Studi di Parma - Via del Taglio Parma Riassunto Allo scopo di ottenere dati circa il coinvolgimento di Mannheimia haemolytica in focolai di malattia respiratoria del bovino (MRB), è stata condotta una indagine sierologica su doppio campione di emosiero (fase acuta e fase convalescente), prelevato da 2658 bovini da carne e 1870 bovini da latte, appartenenti a 548 focolai di MRB verificatisi in allevamenti italiani nel periodo La risposta anticorpale verso la leucotossina (LKT) di M. haemolytica è stata valutata mediante saggio immunoenzimatico (ELISA). La sieroconversione verso LKT ha interessato 665 (25%) capi da carne e 430 (23%) capi da latte. Sulla scorta dell accertamento sierologico, il coinvolgimento di M. haemolytica è stato dimostrato interessare 357 (65%) dei focolai di MRB osservati. Sieroconversione concomitante verso LKT di M. haemolytica e virus respiratori (VRSB, BVDV, CRB, BoHV-1 e PI3) è stata rilevata in 668 animali (15%) da 324 focolai (59%). La prevalenza di sieroconversione verso LKT di M. haemolytica è risultata significativamente più elevata tra animali non vaccinati verso virus respiratori rispetto a quelli soggetti a programmi vaccinali specifici. Summary In order to obtain data concerning the involvement of Mannheimia haemolytica in bovine respiratory disease (BRD) outbreaks, a serological survey was carried out on paired (acute and convalescent) serum samples from 2658 beef cattle and 1870 dairy cattle collected in 548 BRD outbreaks occurred in Italian herds during Antibody response to M. haemolytica leukotoxin (LKT) was detected by ELISA. Seroconversion to LKT involved 665 (25%) beef cattle and 430 (23%) dairy cattle. On serological basis, M. haemolytica involvement was demonstrated in 357 (65%) BRD outbreaks. Concurrent seroconversion to M. haemolytica LKT and respiratory viruses (BRSV, BVDV, BRC, BoHV-1 and PI3) was detected in 668 animals (15%) from 324 BRD outbreaks (59%). The prevalence of seroconversion to M. haemolytica LKT was significantly higher in cattle unvaccinated to respiratory viruses than in vaccinated animals. INTRODUZIONE Mannheimia haemolytica è riconosciuto quale microrganismo commensale delle alte vie respiratorie 1. Il microrganismo risulta tuttavia implicato nel determinismo di polmonite fibrinosa in giovani vitelli (polmonite enzootica), in animali da carne (shipping fever), nonché in bovini da latte 2, 3, 4. La polmonite fibrinosa rappresenta l esito di una attiva infezione da M. haemolytica e trova riscontro in casi di mortalità nell ambito di focolai di malattia respiratoria del bovino (MRB). Il sierotipo A1 è largamente riconosciuto quale predominante in corso di polmonite nel bovino 5. In seguito al verificarsi di eventi stressanti, perturbativi dell omeostasi immunitaria del bovino, M. haemolytica, che normalmente risiede nelle cripte tonsillari come componente della flora microbica dell animale sano, replica rapidamente, colonizza il rinofaringe ed è trasportata ai polmoni per mezzo di aerosol. Durante la fase di crescita logaritmica il microrganismo produce la leucotossina (LKT). A basse concentrazioni LKT può attivare i neutrofili, stimolare il rilascio di citochine, ridurre la linfoblastogenesi e stimolare il rilascio di istamina da parte dei mastociti 6. Ad alte concentrazioni LKT provoca lisi dei leucociti e rilascio di enzimi lisosomiali responsabili del danneggiamento tissutale polmonare, da cui l insorgenza di pleuropolmonite fibrinosa 7. La presenza di un si-

2 26 Risposta anticorpale verso leucotossina di Mannheimia (Pasteurella) haemolytica to di legame specifico per LKT sui leucociti bovini è una tesi recentemente avanzata per spiegare l attivazione e l attività litica di M. haemolytica 8. È stato infatti dimostrato il legame tra LKT e la beta-2-integrina CD11a/CD18 (lymphocyte function-associated antigen, LFA-1). In caso di infezione virale, da BoHV-1 in particolare, si assiste ad un aumentata espressione di LFA-1, evento che favorisce il legame tra LKT e leucociti 9. Detto processo è invocato a sostegno del ruolo patogenetico di M. haemolytica in corso di MRB, in cui alla componente virale succedono complicanze batteriche responsabili del decorso grave della malattia. L infezione naturale da M. haemolytica evoca una risposta anticorpale verso la relativa citotossina (LKT) 10, analogamente a quanto si verifica in seguito al trattamento con vaccini contenenti LKT 11. La produzione di LKT è legata all attiva replicazione di M. haemolytica e pertanto la rilevazione di una risposta anticorpale specifica in corso di MRB può essere considerata una dimostrazione indiretta del coinvolgimento del microrganismo nella malattia respiratoria. Per quanto riguarda l approccio diagnostico, di laboratorio, la risposta anticorpale verso LKT è stata determinata mediante saggio di neutralizzazione della citotossina 12 e, più di recente, mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) 13. In Italia l ampio coinvolgimento di M. haemolytica in focolai di MRB è stato dimostrato con l isolamento in coltura del microrganismo 14. Stante la difficoltà di ottenere campioni (tamponi nasali da animali in fase acuta di malattia e/o polmoni da soggetti venuti a morte a seguito di sintomi respiratori) idonei all isolamento dell agente causale, il ruolo di M. haemolytica nell induzione di MRB potrebbe essere sottovalutato. Pertanto un approccio sierologico volto a rilevare sieroconversione per LKT di M. haemolytica, potrebbe consentire una miglior comprensione del ruolo patogenetico svolto dal batterio in parola in seno ai focolai di MRB. Allo scopo di ottenere dati sul coinvolgimento di M. haemolytica in focolai di MRB è stata condotta una indagine sierologica su doppio campione di emosiero (fase acuta e fase convalescente) prelevato da bovini da carne e da latte affetti da malattia respiratoria. MATERIALI E METODI Emosieri Un doppio campione di emosiero (fase acuta fase convalescente) è stato prelevato da 2658 bovini da carne e da 1870 bovini da latte, appartenenti a 548 focolai di MRB verificatisi in allevamenti italiani nel periodo Nessun programma di vaccinazione per M. haemolytica era in essere negli allevamenti esaminati. Il campionamento è stato effettuato considerando un numero di capi variabile da 5 a 12 in ragione della consistenza degli animali colpiti nell ambito dei singoli focolai. Gli emosieri sono stati congelati e mantenuti a 20 C prima dell utilizzo. Nel caso dei test di sieroneutralizzazione e di inibizione dell emagglutinazione, gli emosieri sono stati preventivamente inattivati a 56 C per 30 minuti. Sierologia Allo scopo di determinare la risposta anticorpale verso LKT di M. haemolytica è stato allestito un un saggio immunoenzimatico (ELISA). Quale antigene test è stata utilizzata LKT ottenuta dal sovranatante della coltura in fase di crescita logaritmica di un ceppo di campo di M. haemolytica, coltivato in agitazione continua in terreno RPMI-1640 a 37 C. La LKT è stata parzialmente purificata mediante precipitazione con 40-60% di solfato di ammonio. Il precipitato è stato risospeso in guanidina 3M contenente 50 mm NaHPO 4 e 100 mm NaCl 14. Il preparato antigenico è stato valutato mediante SDS-PA- GE. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante colorazione con blu di Coomassie. A conferma della presenza di LKT nel preparato antigenico, le proteine sono state trasferite mediante elettroblotting su membrana Immobilon-P (Millipore) 15. La membrana è stata trattata con gelatina al 3% in TBS ed incubata con un anticorpo monoclonale (MAb) anti-lkt di M. haemolytica in TBS con gelatina all 1%. L anticorpo monoclonale (MM601) è stato gentilmente fornito dal Dr. S. Srikumaran (University of Nebraska, Lincoln, Nebraska, USA). Dopo il lavaggio le membrane sono state incubate con immunoglobulina G anti-topo di capra, coniugata con perossidasi (Sigma). La presenza dell immunocomplesso è stata rivelata mediante aggiunta di substrato costituito da diaminobenzidina (Sigma). L SDS-PAGE della preparazione di LKT ha rivelato alcune bande proteiche di diverso peso molecolare. L analisi mediante immunoblot ha mostrato la presenza della banda di LKT, caratterizzata da un peso molecolare di circa 104 kda (Fig. 1). Piastre ELISA a 96 pozzetti sono state sensibilizzate con 1 µg di LKT/pozzetto. I campioni di siero sono stati testati mediante saggio end-point, con diluizioni seriali da 1:20 a 1:2560. Il legame degli anticorpi sierici anti-lkt è stato evidenziato mediante aggiunta di IgG anti-bovino di coniglio coniugate con perossidasi e quindi del substrato, costituito da tetrametil-benzidina TMB (Sigma). I campioni che hanno fornito una densità ottica corretta (DOC) 0.25 sono stati considerati positivi per anticorpi verso LKT. L infezione attiva da M. haemolytica è stata dimostrata da sieroconversione (da negativo a positivo) o da un aumento significativo (almeno 4 volte) del titolo anticorpale verso la LKT nei campioni di siero appaiati (fase acuta fase convalescente). Al fine di determinare il coinvolgimento di M. haemolytica nei focolai di MRB osservati è stato considerato il rilevamento di sieroconversione verso LKT in uno o più animali oggetto di campionamento. Inoltre, al fine di dimostrare un eventuale coinvolgimento virale, tutti i campioni di emosiero sono stati testati per anticorpi verso i principali virus respiratori bovini: BoHV-1, BVDV e Coronavirus respiratorio bovino (CRB) mediante sieroneuralizzazione (SN), VRSB mediante immunofluorescenza indiretta (IFI) e PI3 mediante inibizione dell emagglutinazione (IEA). In ogni caso, al fine dell accertamento di sieroconversione sono stati rispettati i criteri precedentemente indicati. L analisi statistica dei risultati è stata effettuata mediante il test del chi-quadrato.

3 Large Animals Review, Anno 11, n. 1, Febbraio BOVINI FIGURA 1 - Analisi mediante western blot della preparazione di LKT di M. haemolytica impiegata come antigene nel test ELISA: (A) pesi molecolari standard; (B) immunoblotting della preparazione di LKT con anticorpo monoclonale anti-lkt (MM601) che evidenzia la presenza di una banda di peso molecolare approssimativo di 104 kda; (C) test ELISA indiretto per la ricerca di anticorpi anti-lkt nel siero di bovini. RISULTATI Dai dati espressi in Tabella 1 emerge come solo una limitata quota parte (5%) degli animali campionati fosse provvista di anticorpi verso LKT al primo prelievo, eseguito in fase acuta di malattia. Valutando in successione il dato relativo al campionamento in fase convalescente emerge un significativo aumento nella prevalenza di animali sieropositivi verso LKT (29%), fatto che viene portato a dimostrazione, seppur indiretta, del coinvolgimento di M. haemolytica nel determinismo della patologia osservata. L osservazione risulta confortata dalla situazione relativa ai focolai, ove l infezione attiva da M. haemolytica ha interessato ben il 65% dei casi. Un elemento degno di nota si riferisce al fatto che solo una parte (dal 10 al 50%) degli animali appartenenti ai focolai di malattia respiratoria, in cui su base sierologica è stato dimostrato l intervento di M. haemolytica, abbiano presentato sieroconversione verso LKT. La situazione è da ritenersi tipica delle infezioni batteriche ove è atteso che contagiosità e diffusibilità del patogeno risulti più contenuta rispetto a quanto si osserva usualmente nel caso delle virosi, di quelle respiratorie in particolare. Entrando nel merito delle diverse categorie di animali, non sono rilevabili differenze statisticamente significative (p>0.05) tra le percentuali di sieroconversione osservate tra i bovini da latte e quelli da carne. I dati tabulati necessitano di un ulteriore approfondimento sulla scorta delle informazioni di carattere anamnestico in nostro possesso. Nel caso dei bovini da latte la sieroconversione per la LKT ha interessato 430 animali. Nell ambito di questi animali, quelli al di sotto dell anno di vita hanno mostrato una evidente maggiore prevalenza di sieroconversione rispetto agli animali adulti. La giovane età sembra pertanto rappresentare un fattore di rischio circa l insorgenza di MRB, al cui determinismo concorre M. haemolytica. Nel caso dei bovini da carne, il dato globale va analizzato alla luce della dinamica temporale dei focolai, da cui risulta come su 161 casi di MRB con il coinvolgimento di M. haemolytica, ben 121 (75%) si siano verificati entro le due settimane dall arrivo nell unità da ingrasso. Pertanto detto periodo si conferma come quello a maggior rischio di insorgenza di MRB, di espressione patogena da parte di M. haemolytica in particolare. Al contrario, gli episodi di MRB osservati tra i bovini da latte non possono essere ricondotti ad eventi o fasi specifiche del ciclo di produzione, fatto salvo l aspetto anagrafico già sottolineato. Come indicato, l indagine sierologica è stata estesa alla componente virale che usualmente insiste nel determinismo di MRB. Al riguardo indichiamo come la sieroconversione concomitante verso LKT di M. haemolytica e virus respiratori abbia interessato 668 animali (15%), coinvolgendo 324 focolai (59%). La disamina dei singoli agenti virali che hanno interessato i singoli animali in associazione a M. haemolytica ha individuato l intervento di VRSB (384/668), BVDV (224/668), PI3 (123/668), CRB (81/668) e BoHV-1 (41/668). Non è infrequente il reperto (98/668) di reazione anticorpale verso LKT di M. haemolytica e due o più virus respiratori nello stesso soggetto. I tassi di mortalità segnalati sono stati del 13% nei focolai che hanno evidenziato su base sierologica l intervento concomitante di virus e M. haemolytica e dell 11% nei fo-

4 28 Risposta anticorpale verso leucotossina di Mannheimia (Pasteurella) haemolytica Tabella 1 Risposta anticorpale verso LKT di M. haemolytica in campioni di siero prelevati da bovini con malattia respiratoria in fase acuta (campionamento I) ed in fase convalescente (campionamento II) Sieropositività Animali e Focolai Esaminati campionamento I campionamento II Sieroconversione Bovini da carne Animali (6%) 824 (31%) 665 (25%) Focolai (16%) 243 (82%) 196 (66%) Bovini da latte Animali (4%) 505 (27%) 430 (23%) Focolai (12%) 191 (76%) 161 (64%) Totale Animali (5%) 1329 (29%) 1095 (24%) Focolai (14%) 434 (79%) 357 (65%) Tabella 2 Ripartizione della sieroconversione verso LKT di M. haemolytica in rapporto a presenza/assenza di vaccinazione verso virus respiratori (BoHV-1, BVDV, VRSB, PI3 e CRB) Animali Vaccinazione Esaminati Sieroconversione SI (22.7%)* NO (27%)* Totale *differenza di sieroconversione tra animali non vaccinati e vaccinati statisticamente significativa (p<0.01) colai ove è stata dimostrata sieroconversione solo verso LKT di M. haemolytica. La differenza non appare significativa (p>0.05). Sempre sulla scorta dei dati anamnestici in nostro possesso risulta che, per quanto concerne i programmi sanitari in essere negli allevamenti considerati, 425 su 1095 animali che hanno mostrato sieroconversione verso LKT di M. haemolytica non erano stati vaccinati verso i seguenti virus: BoHV-1, VRSB, BVDV, PI3 e CRB. In questo caso l analisi statistica ha evidenziato una differenza significativa (p<0.01) tra la percentuale di sieroconversione per LKT osservata nella popolazione non vaccinata (27%) rispetto a quella riscontrata tra gli animali soggetti a profilassi vaccinale verso virus riconosciuti causa di MRB (22.7%) (Tab. 2). DISCUSSIONE E CONCLUSIONI FIGURA 2 - Lesioni polmonari da M. haemolytica. Lo studio di campo effettuato mette in evidenza l ampio coinvolgimento di M. haemolytica in corso di focolai di MRB osservati negli ultimi sette anni in allevamenti da latte e carne ubicati in diverse regioni italiane. Il dato è confirmatorio di quanto precedentemente rilevato mediante procedure di isolamento eseguite su focolai di MRB verificatisi nella popolazione bovina allevata nella stessa area geografica 14. Si ritiene che, stanti le limitazioni di ordine procedurale nei riguardi dell isolamento di microrganismi patogeni da materiale patologico prelevato da animali in fase clinica (tamponi nasali, lavaggi tracheobronchiali), dovute al breve periodo di colonizzazione attiva del microrganismo e a difficoltà di conservazione del campione,

5 Large Animals Review, Anno 11, n. 1, Febbraio l indagine sierologica si configuri come prassi atta a fornire utili indicazioni di carattere diagnostico. Nel caso specifico di M. haemolytica, alla attiva replicazione batterica, che connota l infezione respiratoria profonda, consegue produzione di LKT. Alla luce di ciò, il rilievo di sieroconversione verso LKT assume valore diagnostico nel senso della dimostrazione del coinvolgimento di M. haemolytica nel determinismo delle manifestazioni respiratorie osservate. Seppur nei limiti connaturati nella diagnosi sierologica, i dati ottenuti indicano che M. haemolytica è in grado di sostenere infezione-malattia respiratoria sia quale agente causale primario che complicante forme virali primarie. I tassi di mortalità osservati non sembrano subire una influenza significativa in ragione del ruolo di patogeno primario o secondario rivestito, a seconda dei casi, da M. haemolytica. In merito alla componente virale coinvolta nei focolai osservati si conferma il primato di VRSB quale agente di MRB. Non trascurabile è la prevalenza di sieroconversione verso BVDV e Coronavirus, tradizionalmente accreditati di attività patogena in sede enterica. Entrambi i virus sono stati implicati in focolai respiratori recentemente verificatisi in Italia 16, 17. In particolare, è ampiamente riconosciuto che BVDV è causa di sindromi respiratorie: il virus replica nelle cellule della mucosa del tratto respiratorio, provocando il danneggiamento dei tessuti polmonari 18. Inoltre, l immunodepressione conseguente all azione di BVDV sui linfociti favorisce la colonizzazione dei tessuti respiratori da parte di altri virus o batteri, M. haemolytica in particolare 19. Nel caso del Coronavirus è documentata la presenza di ceppi dotati di tropismo respiratorio e in grado di evocare patologia respiratoria franca nel bovino 20. Il fatto è stato documentato anche in allevamenti italiani 17. Sulla scorta dei dati ottenuti, il sinergismo patogenetico derivante dall azione combinata di M. haemolytica e virus respiratori trova una ulteriore dimostrazione nella maggiore prevalenza di sieroconversione per la LKT nei bovini non vaccinati nei confronti delle virosi respiratorie rispetto agli animali vaccinati. La vaccinazione verso i virus respiratori bovini, BVDV incluso, potrebbe essere utile a controllare, seppur parzialmente, l infezione da M. hemolytica, contribuendo a modulare l azione patogena del germe. Ne consegue che la mancanza di un programma di vaccinazione per i suddetti virus possa essere considerata un fattore di rischio per lo sviluppo di polmonite fibrinosa conseguente ad attiva infezione da M. haemolytica. Per quanto attiene al meccanismo patogenetico relativo a M. haemolytica, è stato sottolineato che la rilevazione di una risposta anticorpale verso LKT è utile a dimostrare uno stato di infezione attiva da M. haemolytica. Il fatto travalica il mero aspetto diagnostico e la presenza di anticorpi verso LKT è riconosciuta assumere valenza immunitaria, sia in termini di prevenzione dell insorgenza di polmonite fibrinosa che di riduzione dell entità del danno polmonare 10. Studi volti alla valutazione dei fattori di virulenza di M. haemolytica, hanno dimostrato come sussista una correlazione positiva tra livello degli anticorpi verso LKT ed attività protettiva nei confronti dell infezione sperimentale del bovino con un ceppo pienamente virulento di M. haemolytica 21. In virtù di queste evidenze, appare pienamente giustificata l inclusione di LKT, in forma di tossoide, nei presidi vaccinali dedicati al controllo di M. haemolytica, peraltro ampiamente disponibili nel nostro Paese 22, 23. Riprendendo la disamina dei fattori di rischio che insistono sull infezione da M. haemolytica, i dati ottenuti indicano come, nel caso dei bovini da latte, gli animali maggiormente esposti siano quelli giovani, sotto l anno di vita. Diversamente, nei bovini da carne, la componente di stress che caratterizza il periodo del trasporto e del ristallo si conferma essere un fattore favorente l insorgere di malattia respiratoria di origine batterica e/o virale. Ancora una volta il dato travalica il mero aspetto epidemiologico ma deve trovare espressione in ambito di tempistica vaccinale. Nel caso dei bovini da carne appare difficile perseguire un efficiente protezione nei confronti di infezioni precoci, a ridosso dell ingresso degli animali in allevamento. Le risultanze di prove di campo effettuate in distretti geografici diversi e su diverse tipologie di allevamenti da carne, suggeriscono che la vaccinazione effettuata all arrivo dell animale in allevamento è in grado di ridurre sensibilmente la mortalità dovuta a malattia respiratoria 24. La situazione vaccinale risulta meglio gestibile nell allevamento da latte in cui la popolazione è autoctona e stanziale. In tal senso appare evidente come, al fine di prevenire l insorgenza di malattia respiratoria nei giovani animali si possa far ricorso ad interventi precoci, anche prima del primo trimestre di vita 22, 23. Al fine di conferire una immunità protettiva al vitello nei primi mesi di vita attraverso il colostro è altresì ipotizzabile la vaccinazione della bovina gravida, in fase di asciutta 25. Detta soluzione non è di fatto estensibile all allevamento del vitello a carne bianca, ove M. haemolytica è comunque riconosciuta quale causa di rilevanti problematiche di ordine respiratorio 26. La brevità del ciclo zootecnico, le caratteristiche immunitarie degli animali allevati e l evidenza di come solo una ridotta quota di animali risulti provvista di anticorpi verso M. haemolytica rappresentano elementi che, in linea generale, depongono per una esecuzione precoce del primo intervento vaccinale, prevedendo il relativo intervento di richiamo. Sul versante propriamente vaccinale, la dimostrazione di una elevata prevalenza di infezioni concomitanti M. haemolytica e virus respiratori suggerisce, qualora applicabile in termini di disponibilità commerciale, un trattamento routinario con vaccini combinati, ovvero contenenti valenze batteriche e virali. L utilizzo di detta tipologia vaccinale risulta particolarmente gradito sul versante della gestione dell allevamento bovino, così come è oggi strutturato, e appare nel contempo rispondente alle esigenze di carattere sanitario inerenti il controllo delle malattie oggetto di profilassi vaccinale 27. Parole chiave Bovino, malattia respiratoria, Mannheimia haemolytica, sierologia. Key words Cattle, respiratory disease, Mannheimia haemolytica, serology. BOVINI

6 30 Risposta anticorpale verso leucotossina di Mannheimia (Pasteurella) haemolytica Bibliografia 1. Frank G.H., Briggs R.E., Gillette K.G., Pasteurella haemolytica serotype 1 colonization of the nasal passages of virus-infected calves. Am. J. Vet. Res., 48: , Houghton S.B., Gourlay R.N., Bacteria associated with calf pneumonia and their effect on gnotobiotic calves. Res. Vet. Sci., 37: , Whiteley L.O., Maheswaran S.K., Weiss D.J., Ames T.R., Kannan M.S., Pasteurella haemolytica A1 and bovine respiratory disease: pathogenesis. J. Vet. Intern. Med., 6: 11-22, Yates W.D.G., A review of infectious bovine rhinotracheitis, shipping fever pneumonia and viral-bacteria synergism in respiratory disease of cattle. Can. J. Comp. Med., 46: , Frank G.H., Pasteurellosis of cattle. In: Adlam C F and Rutter J M (ed) Pasteurella and pasteurellosis Academic Press, London, United Kingdom, , Czuprynski C.J., Ortiz-Carranza O., Pasteurella haemolytica leukotoxin inhibits mitogen-induced bovine peripheral blood mononuclear cell proliferation in vitro. Microb. Pathog., 12: , Clinkenbeard K.D., Clarke C.R., Morton R.J., Role of Pasteurella haemolytica leukotoxin in virulence and immunity in shipping fever. Compendium, 14: , Brown J.F., Leite F., Czuprynski C.J., Binding of Pasteurella haemolytica leukotoxin to bovine leukocytes. Infect. Immun., 65: , Leite F., Kuckleburg C., Atapattu D., Schultz R., Czuprynski C.J. BHV-1 infection and inflammatory cytokines amplify the interaction of Mannheimia haemolytica leukotoxin with bovine peripheral blood mononuclear cells in vitro. Vet. Immunol. Immunopathol., 99: , McBride J.W., Corstvet R.E., Paulsen D.B., McClure J.R., Enright F.M., Systemic and pulmonary antibody response of calves to Pasteurella haemolytica after intrapulmonary inoculation. Am. J. Vet. Res., 53: , Srinand S., Hsuan S.L., Yoo H.S., Comparative evaluation of antibodies induced by commercial Pasteurella haemolytica vaccines using solid phase immunoassays. Vet. Microbiol., 49: , Gentry M.J., Confer A.W., Panciera R.J., Serum neutralization to cytotoxin from Pasteurella haemolytica and resistance to experimental pneumonic pasteurellosis. Vet. Immunol. Immunopathol., 9: , Mosier D.A., Confer A.W., Hall S.M., Enzyme-linked Immunosorbent Assay for detection of serum antibodies to Pasteurella haemolytica cytotoxin (leukotoxin) in cattle. J. Clin. Microbiol., 24: , Cavirani S., Candotti P., Guadagnini P.F., Pozzi P., Allegri G., Pasteurella haemolytica as cause of bovine respiratory disease (BRD) in dairy and beef cattle in Italy. Proc. XX World Buiatrics Congress, Towbin H., Staehelin T., Gordon J., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: , Cavirani S., Allegri G., Donofrio G., Cabassi C.S., Ceccato C., Ballotin M., Anticorpi verso Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) in bovini da carne allevati in nord Italia. Atti Soc. Ital. Buiatria, 31: , Cavirani S., Galvani G., Taddei S., Donofrio G., Foni E., Lavazza A., Bertoli M., Involvement of Coronavirus in acute bovine respiratory disease (BRD) of cattle. Proc. X International Symposium of Veterinary Diagnosticians and OIE Seminar on Biotecnology, , Stott E., Thomas L., Collins A., A survey of virus infections of the respiratory tract of cattle and their association with disease. J. Hyg., 85: , Brownlie J., The pathogenesis of bovine viral diarrhea virus. Res. Sci. Tech. Off. Int. Epiz., 9: 45-59, Hasoksuz M., Lathrop S., Al-dubaid M.A., Lewis P., Saif L.J., Antigenic variation among enteric (BECV) and bovine respiratory coronaviruses (BRCV) detected using monoclonal antibodies. Arch. Virol., 144: , Gentry M.J., Confer A.W., Kreps J.A., A simple visual assay for determination of Pasteurella haemolytica cytotoxin neutralizing antibody titers in cattle sera. J. Clin. Microbiol., 22: , Cabassi C.S., Toni F., Taddei S., Galvani G., Wax G., Cavirani S., Impiego della vaccinazione verso Mannheimia (Pasteurella) haemolytica in vitelli da allevamenti da latte. Atti Soc. Ital. Buiatria, 43: , Soriolo A., Cabassi C.S., Taddei S., Mazzi A., Mencarelli A., Cavirani S., Valutazione della risposta clinica e immunitaria verso Mannheimia haemolytica in vitelli trattati con un vaccino one shot, monovalente e inattivato. Atti Soc. Ital. Buiatria, 36: , Pollreisz J.H., Pooled analysis of pasteurella vaccination trial. Proc. XIX World Buiatrics Congress, 13-15, Hodgins D.C., Shewen P.E., Preparturient vaccination to enhance passive immunity to capsular polysaccaride of Pasteurella haemolytica A 1. Vet. Immunol. Immunopathol., 50: 67-77, Cavirani S., Taddei S., Cabassi C.S., Ghidini F., Rodighiero M., Studio sulla conversione verso agenti di malattia respiratoria in vitelli a carne bianca. Atti Soc. Ital. Buiatria, 35: , Mosier D.A., Confer A.W., Panciera R.J., The evolution of vaccines for bovine pneumonic pasteurellosis. Res. Vet. Sci., 47: 1-10, 1989.