Flavescenza dorata (FD)

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1 Flavescenza dorata (FD) Malattia da quarantena Patogeno: Candidatus Phytoplasma vitis: un batterio intracellulare obbligato che può essere studiato solo all interno dell ospite: pianta o insetto Trasmissione: vettore specifico Scaphoideus titanus Ball (Homoptera: Cicadellidae) Sintomi : arrossamenti e giallumi, accartocciamento delle foglie, mancata lignificazioni dei tralci, disseccamento del grappolo Recovery: remissione naturale dei sintomi dopo che è avvenuta l infezione

2 Malattia: risultato di interazione ospite-ambiente-agente causale Pianta ospite Ambiente Vettore Scaphoideus titanus Patogeno Fitoplasma Infezione Flavescenza dorata Approccio di studi integrato Genomica: Insieme delle informazioni genetiche. Le sequenze di DNA vengono annotate per l identificazione di geni e altre porzioni di sequenza significative Trascrittomica: Insieme di tutti i trascritti (RNA messaggeri). Espressione dei geni che varia in funzione delle necessità di cambiamento di un organismo e di stimoli ambientali Proteomica: Insieme delle proteine presente in un organismo, tessuto o cellula Metabolomica: l'insieme di tutti i metaboliti di un organismo biologico. Profilo metabolico può fornire un'istantanea della fisiologia di quella cellula.

3 Studio dell interazione fitoplasma-pianta ospite con approccio proteomico da: Graves and Haystead, 2002 Effetto biologico Proteoma: insieme delle proteine derivanti dall espressione del genoma altamento complesso dinamico nel tempo dinamico nello spazio

4 Studio del proteoma = proteomica kda Elettroforesi bidimensionale + pi Spettrometria di massa da Graves and Haystead, 2002 Estratti separazione delle proteine in base a pi e peso molecolare ed ottenimento di mappe di espressione proteica Analisi comparativa delle immagini La proteina di interesse viene isolata dal gel e digerita in peptidi da una specifica proteasi. La massa dei peptidi viene misurata dallo spettrometro di massa Lo spettro di massa ottenuto viene comparato con lo spettro teorico delle proteine in banca dati

5 Tesi in studio Sano Recovered vs Malato Nebbiolo vs Barbera

6 Sano vs malato Circa il 6% delle proteine risulta differenzialmente espresso in viti infette rispetto alle sane. Queste proteine rappresentano un ampia gamma di funzioni, le cui percentuali di appartenenza sono rappresentate dal grafico Categorie funzionali delle proteine Destinazione 18% Trasporto 6% Sintesi 3% Metabolism Risposta a stress 42% Energy Protein synthesis Protein fate (folding, modification, destination) Cellular transport, transport facilitation and transport routes Cell rescue, defence and virulence Energia 9% Metabolismo 21%

7 Barbera vs Nebbiolo Barbera Sintesi 6% Risposta allo stress 29% Metabolismo 39% Destinazione 9% Energia 14% Nebbiolo Trasporto 6% Sintesi 3% Risposta allo stress 43% Metabolismo 21% Destinazione 18% Energia 9%

8 Sano e infetto vs recovery Infetto/Rec Sano/Rec

9 Risultati Approccio proteomico per la prima volta utilizzato nello studio dell interazione vite/fitoplasma ha dato delle indicazioni sulle profonde modificazioni che avvengono nella pianta infetta ha individuato vie metaboliche particolarmente alterate dall infezione e che meritano approfondimenti ha individuato alcune differenze che contraddistinguono la pianta risanata da quella sana, fornendo spunti di approfondimento per lo studio del fenomeno del recovery

10 Alterazione della rete biologica della vite nel interazione col fitoplasma Biosynthesis of alkaloids and plant hormones (auxin, SA) Metabolism of phenyl-propanoids Isoflavone reductase Chalcone isomerase Anthocyanidine synthase Proteome interaction networks Biosynthesis of alkaloids Pentose phosphate cycle 6-Phosphoglucolactonase Enolase Glycolysis Jasmonic acid biosynthesis Biosynthesis alkaloids Glioxylate cycle Oxalyl-coA carboxilase Aconitase Isocitrate dehydrogenase Biosynthesis of aromatic amino-acids Fatty acids biosynthesis Terpenoids biosynthesis Malate dehydrogenase Pyruvate decarboxylase Acetaldehyde Acetate Alcohol dehydrogenase Aceto-acetyl coa Aconitase Ethanol Sulphur metabolism Cysteyne metabolism Cysteine synthase Cysteyne peptidase Cysteyne synthase Biosynthesis of plant hormones (ethylene) Tricarboxylic acid cycle Aconitase Isocitrate-dehydrogenase Nitrogen assimilation Glutamine synthetase Biosynthesis of alkaloids Aminoacyl-peptidase

11 Metabolismo dei flavonoidi Antiossidanti Hanno un ruolo critico nella qualità del vino Hanno un ruolo di protezione nelle piante in condizioni di stress: tolleranza ai cambiamenti climatici, resistenza alla siccità, difesa dagli erbivori, attività antimicrobica Antociani Flavonoli Tannini Analisi biochimiche Spettofotometro HPLC Analisi dei trascritti qrt-pcr

12 Flavonoid pathway Myb1F Myb1A 15 giugno 20 Luglio 12 Agosto 10 settembre S R I S R I S R I S R I S: Sano R: Recovered I: Infetto 3 repliche biologiche (almeno 4 piante) per ogni tesi sanitaria, nei 4 punti della stagione 40 campioni/cultivar

13 Risultati Ottima correlazione tra dati biochimici e di espressione genica In seguito all infezione da FD, si ha un alterazione della via metabolica dei flavonoidi totali in entrambe le cultivar la risposta in Barbera, sia da un punto di vista biochimico che trascrittomico, è molto intensa e marcata, raggiungendo il suo picco ad agosto. Il Nebbiolo invece ha una risposta più limitata e graduale, raggiungendo il picco a luglio In Barbera si assiste ad un drastico aumento delle antocianine, la cui presenza prevale in assoluto su tutti gli altri componenti del pathway. Questo non avviene invece in Nebbiolo, dove l arrossamento generalmente limitato e settoriale osservato nelle foglie infette, è rispecchiato dal limitato accumulo di queste molecole. Le foglie di Nebbiolo sane, presentano una concentrazione tannica maggiore di quelle del Barbera soprattutto ad inizio stagione. Abbiamo inoltre osservato che le foglie di Nebbiolo recovered presentano una concentrazione elevata di questi composti durante tutte le fasi di raccolta. Dato che i tannini possono esercitare sugli insetti un effetto tossico e/o deterrente per la loro nutrizione, si apre un interessante ipotesi di studio e di applicazione pratica: l utilizzo di nuovi formulati a base di acido tannico e suoi derivati da impiegare nella lotta integrata e biologica per il controllo di insetti nocivi alla coltura vitivinicola.

14 Conclusioni e sviluppi futuri Approcci di ricerca integrati per ottenere un panel di informazioni il piu possibile completo per ottimizzazione dei protocolli di intervento per il contenimento dell infezione Studiare le reazioni della pianta all infezione per comprenderne i meccanismi di difesa Studiare il fenomeno del risanamento spontaneo - capire la biologia di base delle piante risanate - individuare marcatori di risanamento Identificare differenze legate alla sensibilità varietale - diversa suscettibilità alle infezioni di FD - attitudine al risanamento delle diverse cv Capire la biologia dei fitoplasmi, il loro meccanismo di infezione ed il loro effetto sul metabolismo dell ospite

15 Ringraziamenti Servizio fitosanitario, Regione Piemonte Dr. Paolo Margaria Grazie dell attenzione