elettroforesi bidimensionale

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1 RELAZIONE SHORT TERM MOBILITY Dr. Biancaelena Maserti, CNR-IBF, Pisa Stage presso INRA- Station de Recherche Agronomique, San Giuliano, Corsica ( 1-22 settembre 2011) Obiettivo dello stage: Mettere a punto un protocollo di estrazione e separazione mediante elettroforesi bidimensionale (2-DE) di proteine da frutti di agrumi a vari stadi di maturazione. Mappe proteiche in 2-DE dei frutti Il periodo di ricerca finanziato dalla short term mobility, richiesta al Consiglio Nazionale delle Ricerche, si è svolto da al , come attestato dalla dichiarazione del Dr. Olivier Pailly, direttore della Station de Recherche Agronomique (SRA) dell Institute National de la Recherche Agronomique (INRA) di San Giuliano ( Corsica), presso il quale il suddetto periodo è stato svolto. La SRA possiede la più importante collezione di specie e varietà di agrumi in Europa e si occupa di ricerche per la selezione di di agrumi tolleranti alle variazioni climatiche, nell ambito di progetti di agricoltura sostenibile e ricerche per il miglioramento delle qualità nutrizionali del prodotto, nell ambito di ricerche che mirano a fornire indicazioni alle PMA corse per lo sviluppo delle loro attività di marketing. La collaborazione fra il Gruppo di Proteomica Vegetale, che io coordino e la SRA data dal 2004, quando preparammo un progetto nell ambito del bando transfrontaliero France-Marittimo. Progetto che fu poi selezionato per il finanziamento. Insieme con i colleghi della SRA abbiamo sottomesso e pubblicato due lavori su riviste ISI e partecipato a tre congressi internazionali. Altri due manoscritti sono in corso di elaborazione. Il periodo di ricerca è stato richiesto per mettere a punto un protocollo di estrazione e separazione mediante elettroforesi bidimensionale delle proteine estratte da frutti di agrumi allo scopo di identificare i livelli di enzimi coinvolti nella formazione degli zuccheri durante la maturazione. L elettroforesi bidimensionale (2-DE) è costituita da separazioni elettroforetiche ortogonali. La prima (IEF) si basa sulla tecnica di isofocalizzazione e prevede la

2 separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico, la seconda (SDS-PAGE) separa le proteine in base alla massa molecolare. Lo sviluppo dei frutti è diviso in tre fasi, la divisione cellulare, la fase di espansione e la fase di maturazione. Durante la fase di maturazione avviene un forte accumulo di zuccheri, la diminuzione della concentrazione di acidi e transizione del colore da verde a giallo o arancio ed aumento della concentrazione di composti volatili. Gli zuccheri e gli acidi organici sono importanti indicatori del sapore e della qualità dei frutti. In molti frutti, quali l arancio dolce, il rapporto fra gli zuccheri totali (TSS) e l acidità è uno dei criteri per determinare la maturità del frutto. Le variazioni delle condizioni ambientali, quali la carenza idrica, salinità del suolo, aumento delle temperature possono modificare sia le quantità degli zuccheri prodotte, sia il periodo della loro formazione. In questo contesto uno studio dei meccanismi molecolari coinvolti nelle vie metaboliche degli zuccheri nel frutto è di fondamentale importanza. Numerosi studi a livello di espressione genica sono stati condotti presso i laboratori di ricerca della Station de Recherche Agronomique, ma i colleghi non possiedono competenze e strumentazione per la valutazione del prodotto genico, cioè della proteina. Pertanto l applicazione dell approccio proteomico, fornito dal del Gruppo Proteomico dell Istituto di Biofisica di Pisa, può fornire informazioni utili e complementari per definire l influenza dell ambiente sulla maturazione del frutto. In una precedente visita presso la SRA effettuata da una studentessa di dottorato si era tentato di estrarre le proteine dai frutti, seguendo il protocollo suggerito dai colleghi corsi. In particolare, per ovviare agli alti livelli di acidi contenuti nei frutti allo stadio I e II di sviluppo, una notevole quantità di idrossido di sodio era stata aggiunta agli estratti. Successivamente i campioni erano stati preparati per elettroforesi bidimensionale, ma le mappe proteiche ottenute non erano riproducibili, e presentavano striature orizzontali, dovute a scarsa separazione delle proteine e verticali, causate da precipitazione delle proteine durante le corse di separazione. Tuttavia, dato che gli estratti erano stati trasportati dalla Corsica alla Italia e le separazioni elettroforetiche erano state eseguite presso IBF, si è anche ipotizzato che i campioni proteici potessero essersi degradati durante il viaggio, anche se trasportati in contenitori refrigerati.

3 Pertanto ho richiesto lo stage oggetto di questa relazione per estrarre, ma anche separare in loco le proteine estratte, trasferendo la strumentazione per l elettroforesi bidimensionale presso la SRA. Al mio arrivo abbiamo definito con i colleghi i campioni da analizzare e gli obiettivi da perseguire in futuro, dopo la messa a punto del protocollo. Le prove iniziali sono state effettuate su un unico tipo di agrume, il Citrus limon, cv. Villafranca, agrume modello nei laboratori SRA, per poter comparare i diversi protocolli. I campioni di frutti, dopo la raccolta, sono stati polverizzati con azoto liquido, seguendo tre protocolli: 1) Aggiunta di NaOH, prima dell estrazione con il tampone di lysis e precipitazione in acetone 2 h, per concentrare le proteine e rimuovere sostanze interferenti. 2) Estrazione diretta con tampone di lysis e precipitazione in acetone 2 h. 3) Precipitazione in acetone per 2 h, estrazione con tampone di lysis e seconda precipitazione in acetone per 2 h. Dopo la precipitazione tutti i campioni sono stati centrifugati ed il pellet ottenuto è stato solubilizzato in un tampone idoneo alla 2-DE. Dopo dosaggio mediante Bradford, gli estratti proteici sono stati separati mediante SDS-PAGE per verificare la qualità dell estrazione e dei profili proteici. Si è quindi osservato che il protocollo 1), come già visto dalle prove preliminari forniva poche bande proteiche non ben definite. Quindi è stato dedotto che l aggiunta di idrossido di sodio al campione influisce sulla separazione delle proteine. I profili proteici ottenuti con i protocolli 2 e 3 erano molto simili in SDS-PAGE, sia qualitativamente che quantitativamente e si è quindi proceduto all effettuazione delle separazioni in 2-DE. Le mappe proteiche ottenute con i due protocolli erano di discreta qualità, ma presentavano ancora striature orizzontali, probabilmente dovute a zuccheri co-estratti con le proteine. La qualità delle mappe era comunque migliore per le proteine estratte con il protocollo 2.

4 Dopo una valutazione dei risultati, insieme ai colleghi è stato deciso di sottoporre gli estratti proteici ottenuti con il protocollo 2, ad un ulteriore precipitazione con metanolo/cloroformio, un metodo utilizzato dai colleghi della SRA per estrarre gli zuccheri dal succo dei frutti. Successivamente i pellet proteici ottenuti sono stati di nuovo solubilizzati e separati in 2-DE. Sono state quindi ottenute mappe di buona qualità per tutte le varietà oggetto di studio, con proteine ben separate e riproducibili. Si è quindi proceduto a raccogliere un numero opportuno di campioni delle sei varietà per ottenere le mappe proteiche necessarie all analisi proteomica. Dato che la sintesi degli zuccheri durante la maturazione è proporzionale alla concentrazione di acidi organici presenti durante la fase di sviluppo II, i colleghi hanno proposto di studiare tre diverse specie di agrumi Citrus limon, Citrus sinensis e Lime (Citrus aurantifolia) e per ciascuna specie, una varietà ad alto contenuto di acidi organici ed un mutante privo di acidità, per un totale di sei diverse varietà. Inoltre insieme ai colleghi abbiamo deciso di focalizzare le analisi, in prima istanza sullo studio della fosfofructokinase (PFK), enzima chiave nella sintesi degli zuccheri. L espressione dei trascritti di questo enzima è stata approfonditamente studiata presso la SRA e quindi la comparazione dei dati proteomici e trascrittomici è importante per la comprensione del ruolo di questo enzima nella maturazione dei frutti. Pertanto le corse elettroforetiche sono state adeguate al peso molecolare della PFK, allo scopo di visualizzarla con chiarezza. Sono state quindi effettuate le mappe proteiche delle sei varietà e le immagini sono state analizzate mediante un software dedicato ( REDFIN, Sono state evidenziate mappe proteiche sovra regolate nella zona compresa fra il punto isoelettrico (pi) e peso molecolare kda. In questo range di massa molecolare e punto isoelettrico è generalmente localizzata la PFK, tenendo conto di mappe proteiche già annotate. Le macchie che potrebbero contenere peptidi corrispondenti alla PFK sono state excise dai gel e preparate per essere inviate presso la Platform Proteomique dell INRA a Montpellier ( Francia), per essere analizzate mediante spettrometria di massa. Inoltre sono stati trasferiti presso CNR-IBF un congruo numero di frutti sui quali saranno continuate le indagini per identificare altri enzimi appartenenti alle vie metaboliche degli zuccheri. E inoltre in corso la messa a punto di un protocollo

5 (ricerca non prevista dal programma di stage) per la visualizzazione dell attività della PFK direttamente su gel di poliacrilamide. Durante il periodo di stage ho anche avuto occasione di partecipare alla discussione di una tesi di dottorato e a numerose riunioni, nelle quali sono state discusse le linee programmatiche per future ricerche in collaborazione CNR-IBF /INRA-SRA. Inoltre, sempre durante il periodo di stage, sono stata invitata a partecipare ad un progetto di ricerca nell ambito del programma europeo ARIMNET. A questo progetto partecipano unità di ricerca, di numerosi paesi fra i quali Italia Francia, Spagna, Pakistan, Brasile e quindi essere inserita nel Consorzio di questo progetto mi ha dato la possibilità di aprire nuove collaborazioni, in particolare con il gruppo brasiliano. Sommario dei risultati ottenuti presso la SRA: Messa a punto del protocollo di estrazione e separazione in 2-DE delle proteine di frutti acidi e relativi mutanti non acidi. Mappe proteiche delle varietà di agrumi oggetto di studio. Individuazione di macchie proteiche sovra espresse nelle varietà ad alto contenuto di acidi organici. Tali macchie hanno un punto isoelettrico ed una massa molecolare corrispondente alla fosfofructokinase, enzima chiave nella sintesi degli zuccheri. Pisa Dr. Biancaelena Maserti