DETERMINAZIONE IMMUNOENZIMATICA DIRETTA DELL FSH NEL SIERO UMANO

Transcript

1 DETERMINAZIONE IMMUNOENZIMATICA DIRETTA DELL FSH NEL SIERO UMANO Ref. IE DET. USO DEL KIT Metodo immunoenzimatico per la determinazione quantitativa dell FSH nel siero umano. INTRODUZIONE L FSH è una glicoproteina secreta dalle cellule basofile dell adenoipofisi. L ormone che stimola il rilascio della Gonadotropina (GnRH), prodotto dall ipotalamo, controlla il rilascio dell FSH da parte dell adenoipofisi.come le altre glicoproteine - LH, TSH, e HCG - l FSH consiste di due subunità denominate alfa e beta. La sub-unità alfa di questi ormoni è strutturalmente molto simile perciò le proprietà biologiche e immunologiche dipendono unicamente dalla subunità beta. Nella donna, l FSH stimola la crescita e la maturazione del follicolo ovarico agendo direttamente sui recettori situati sulle cellule della granulosa; promuove la produzione di steroidi da parte del follicolo e stimola la produzione di LH. L LH prodotto si lega poi alle cellule tecali e stimola la steroidogenesi. Mentre prosegue la maturazione del follicolo,aumenta la produzione intra-ovarica dell estradiolo incrementando così l attività dei recettori dell FSH ed il suo legame follicolare. FSH, LH, ed estradiolo risultano perciò intimamente correlati nel favorire l impianto e la maturazione dell ovulo nella donna. I livelli di FSH risultano elevati nella menopausa, nella castrazione e nell insufficienza ovarica.. I livelli di FSH possono venire normalizzati con la somministrazione di estrogeni, a causa di un meccanismo di feedback negativo. Rapporti alterati tra FSH e LH,e FSH ed estrogeni sono stati associati ad anoressia nervosa e ovaio policistico.il tumore dei testicoli generalmente riduce i livelli di FSH ma i livelli di LH rimangono elevati,come è stato dimostrato con esami radioimmunologici. E stato ipotizzato che l apparente aumento di LH possa essere causato da una cross-reazione con sostanze simil-hcg umano prodotte dal tumore. Alti livelli di FSH nell uomo possono verificarsi nell insufficienza testicolare primitiva e nella sindrome di Klinefelter. Concentrazioni elevate si hanno anche in caso di digiuno prolungato,insufficienza renale,ipertiroidismo e cirrosi. PRINCIPIO DEL METODO Il GONADOTROPINA-FSH EIA è un dosaggio immunoenzimatico one-step,basato sul principio del metodo sandwich. Il sistema utilizza anticorpi monoclonali ad alta affinità e specificità (uno coniugato ed uno immobilizzato) diretti contro uno specifico determinante antigenico della molecola di FSH. Il campione reagisce contemporaneamente con i due anticorpi in modo che la molecola di FSH viene legata tra l anticorpo della fase solida ed il coniugato. Dopo l incubazione i pozzetti vengono lavati per rimuovere gli anticorpi marcati che non si sono legati. Viene poi aggiunto il TMB-Substrato con conseguente sviluppo del colore blu che viene bloccato aggiungendo la soluzione di Stop che cambia il colore in giallo. La concentrazione di LH del campione è direttamente proporzionale all intensità del colore. L assorbanza viene misurata con lo spettrofotometro a 450 nm. CONTENUTO DEL KIT Tabella 1 NOME Micropiastra DESCRIZIONE 96 pozzetti separabili trattati con anticorpi monoclonali anti-fsh. Dopo l apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC. PRESENTAZIONE 1 piastra Calibratori Controllo Sei flaconcini contenenti FSH in tampone a base proteica con concentrazioni di circa *: 0 (0), 5 (1), 10 (2), 25 (3), 50 (4), 100 (5) miu/ml. * I valori esatti sono riportati sulle etichette e sui certificati di analisi dei lotti specifici. I calibratori sono calibrati sullo standard WHO 3nd IRP 94/632 Liquido trasparente o leggermente opalescente di colore giallo chiaro. Conservanti: 0.1% Proclin 300, 0.004% gentamicina solfato, 0.1% fenolo. Dopo l apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC. nei flaconi ben chiusi Controllo, a base di siero umano. L etichetta riporta il range di accettabilità. Liquido trasparente o opalescente,di colore giallo chiaro. Conservanti: 0.1% Proclin 300, 0.004% gentamicina solfato, 0.1% fenolo. Dopo l apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC. nel flacone ben chiuso. 6 flaconcini da 0.5 ml (Calibratore 0 miu/ml 2.0 ml) 0.5 ml 1

2 Coniugato Anticorpi Monoclonali anti-fsh coniugati a Perossidasi da rafano. Liquido trasparente o lievemente opalescente di color rosa. Conservanti: 0.1% Proclin 300, 0.004% gentamicina solfato, 0.1% fenolo. Dopo l apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC. nel flacone ben chiuso ml Soluzione di Lavaggio (concentrata x 25 ) TMB- Substrato Liquido trasparente o lievemente opalescente, incolore o giallo chiaro. Conservare a 2-8 ºC fino alla data di scadenza nel flacone ben chiuso Tetrametilbenzidina in tampone contenente acido citrico. Contiene H2O2. Liquido trasparente incolore. Dopo l apertura,usare entro 1 mese. Conservare a 2-8 ºC. nel flacone ben chiuso ml 12.0 ml Soluzione di Stop Acido solforico 0.2 M. Liquido trasparente incolore. Conservare a 2-8 ºC fino alla data di scadenza nel flacone ben chiuso 15.0 ml PRECAUZIONI PER L USO L'affidabilità dei risultati dipende dall'esecuzione corretta delle seguenti buone pratiche di laboratorio: Non usare reagenti scaduti. Non mescolare i reagenti di lotti differenti. Prima dell'uso, aspettare 30 minuti, tutti i reagenti devono stabilizzarsi a temperatura ambiente (18-24 º C). Non effettuare il test in presenza di vapori reattivi (vapori alcalini, acidi e di aldeidi) o di polvere che potrebbe alterare l'attività enzimatica dei coniugati. Usare cristalleria lavata e risciacquata completamente con acqua deionizzata o preferibilmente, materiale usa e getta. Non lasciare che la micropiastra si asciughi fra la conclusione delle operazioni di lavaggio e la distribuzione del reagente. La reazione enzimatica è molto sensibile agli ioni metallici. Di conseguenza, non lasciare che alcun elemento metallico entri in contatto con le varie soluzioni del substrato o del coniugato. Utilizzare un puntale nuovo per ogni campione. La procedura di lavaggio è una tappa critica in questa procedura: rispettare il numero suggerito di cicli di lavaggio e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti e poi siano completamente svuotati. Un lavaggio errato può condurre a risultati inesatti. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo di colore. Controllare le pipette e le altre attrezzature per verificare il corretto funzionamento. Non cambiare la procedura di analisi. Usare acqua di alta qualità. Durante la conservazione evitare l'esposizione dei reagenti all'eccessivo calore o alla luce solare ISTRUZIONI DI SICUREZZA Tutti i reagenti inclusi nel kit sono intesi per uso diagnostico in vitro. Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione del siero di controllo è stato testato e trovato negativo per l HBsAg, anticorpi del virus dell epatite C e gli anticorpi del virus dell immunodeficenza umana (HIV-1 e HIV-2) e l'antigene p24 HIV-1. Comunque,nessun metodo può completamente assicurare l assenza di questi agenti infettivi. Pertanto,come tutti i prodotti provenienti da sangue umano,inclusi i sieri dei campioni, devono esser considerati come potenzialmente infettivi. Manipolare,perciò, i reagenti secondo i normali comportamenti previsti dalle normative vigenti che disciplinano tale materia,se esistenti. Non mangiare, non bere, non fumare, o non utilizzare cosmetici negli ambienti dove avvengono i dosaggi. Non pipettare per via orale. Tutta l'apparecchiatura direttamente in contatto con i campioni e i reagenti dovrebbero essere considerati come prodotti contaminati ed essere trattati come tale. Portare camici da laboratorio e guanti usa e getta durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti e lavarsi le mani dopo il loro utilizzo.. Evitare di rovesciare i campioni o le soluzioni che contengono i campioni. Evitare il contatto di pelle e mucose con il substrato cromogeno, il tampone di lavaggio e la soluzione d'arresto Fornire una sufficiente ventilazione. MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO DAL KIT Acqua distillata o deionizzata ; micropipetta multicanale automatica o semi-automatica, µl; micropipette calibrabile per volume variabili, µl; Termostato a secco per 37 С ± 0.1 C; Fotometro per micropiastre con una lunghezza d onda di 450 nm e un intervallo di misurazione di OD. Conservazione e stabilità del Kit Conservare da 2 a 8 C fino alla data di scadenza. Per minimizzare gli effetti dell umidità,dopo l apertura conservare la micropiastra nel sacchetto chiuso ermeticamente. 2

3 RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI La raccolta dei campioni di sangue va fatta secondo le norme in uso. Può essere usato solo siero. Separare il siero al più presto possibile per evitare emolisi. Un emolisi massiva può alterare il risultato. Campioni che presentano materiale corpuscolato vanno chiarificati per centrifugazione prima della prova. Fibrina in sospensione o in aggregati può dare risultati falsamente positivi. Non riscaldare i campioni. Per risultati accurati confrontabili con i range di normalità utilizzare campioni prelevati al mattino a digiuno. Il sangue va raccolto con provette per prelievo venoso senza additivi e separatore in gel. I campioni possono essere conservati a 2-8 ºC per non più di 72 ore; possono essere congelati a -20 ºC. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Non usare campioni che siano stati congelati e scongelati per più di una volta. Non utilizzare campioni con franca emolisi,iperlipidemia o conservati con sodio azide. PREPARAZIONE DEI REAGENTI tutti i reagenti (compresa la micropiastra) devono essere portati a temperatura ambiente (+18 a +25 C) prima dell'uso. Tutti i reattivi, prima dell uso, devono essere miscelati tramite inversione o tramite utilizzo di vortex. Evitare la formazione di schiume. Nota procedurale: Si raccomanda di completare il pipettamento di tutti i calibratori e i campioni entro 3 minuti. Soluzione di Lavaggio. Agitare bene la Soluzione di Lavaggio concentrata. Per preparare la soluzione di Lavaggio pronta all uso prendere la quantità necessaria di concentrato e miscelarla con acqua purificata (in rapporto di 1:25)in un flacone separato. Miscelare bene. La soluzione di Lavaggio 1x così preparata è stabile per almeno 14 giorni a ºC se utilizzata secondo la Buona Prassi di Laboratorio. PRINCIPIO DEL METODO Procedura di dosaggio 1 Fissare il numero necessario di microstrisce; Riporre tutti i pozzetti inutilizzati nuovamente dentro il sacchetto. 2 Pipettare 25 µl dei calibratori CAL 0 5 e campioni nei pozzetti. 3 Dispensare 100 µl di coniugato in ogni pozzetto. Coprire la piastra con la pellicola adesiva. 4 Incubare per 60 minuti a 37 C. 5 Scartare il contenuto dei micro pozzetti e lavare ogni pozzetto con 300 µl di acqua distillata. Effettuare 4-5 lavaggi. 6 Dispensare 100 µl di substrato in ogni pozzetto. 7 Incubare per minuti a a temperatura ambiente al buio. 8 Dispensare 150 µl di soluzione stoppante in ogni pozzetto. 9 Misurare le OD (densità ottiche) a 450 nm. Il colore sviluppato è stabile per almeno 30 minuti. CALCOLO DEI RISULTATI 1. Calcolare la Densità Ottica media per ciascun Calibratore. 2. Calcolare la Densità Ottica media per ciascun Campione. 3. Sottrarre l assorbanza media del bianco da ciascuna assorbanza media calcolata. 4. Tracciare il grafico della curva dei calibratori mettendo la DO sull asse delle Y e la concentrazione dei Calibratori su quella delle X. 5. Leggere i valori dei campioni direttamente sulla curva dei Calibratori. 6. Se un campione ha più di 100 miu/ml diluirlo con il calibratore 0. Moltiplicare il risultato ottenuto per il fattore di diluizione. Esempio Calibratore DO1 DO2 DO Media - bianco Valore (miu/ml ) Campione Questa tabella è solo a scopo esemplificativo, e non va usata per il calcolo dei campioni. Ciascun utilizzatore deve ottenere i propri risultare e tracciare la propria curva standard. 3

4 Validazione della prova Perché la prova sia valida i risultati devono soddisfare i seguenti criteri. In caso contrario la prova non è valida e deve essere ripetuta. 1. DO del bianco: deve essere < di 0.1 a 450 nm. 2. L assorbanza (DO) del Calibratore 5 (100mIU/ml) deve essere > di Il valore del Controllo deve rientrare nel range stabilito. CARATTERISTICHE DEL KIT GONADOTROPINA-FSH EIA 1. Intervallo dinamico del test L intervallo della prova è compreso tra 0 e 100 miu/ml. 2. Sensibilità Analitica Il limite di determinazione è stato calcolato sulla curva standard determinando la concentrazione media del Calibratore 0 (basata su 10 replicati ) più 2 DS. La sensibilità del kit GONADOTROPINA-FSH EIA è 0.3 miu/ml. 3. Specificità (reattività crociata) Sono state testate le seguenti sostanze per studiare la reattività crociata del kit: Sostanza cross reazione, % FSH 100 hcg TSH LH Precisione Precisione nella prova La tavola seguente mostra i risultati: Campione n Media, miu/ml DS CV,% Precisione tra prove La tavola seguente mostra i risultati: Campione Media, miu/ml DS CV,% Recovery E stato valutato aggiungendo quantità note di FSH ai campioni dei pazienti. I risultati sono riportati nella tabella sottostante: Conc.aggiunta, Conc. misurata miu/ml Conc.attesa Recovery, % µiu/ml µiu/ml

5 6. Linearità Un campione è stato diluito con il calibratore 0. I risultati sono riportati nella tabella sottostante: Campione t.q. Conc. Misurata miu/ml 100 Conc.attesa µiu/ml Recovery, % 1 : : : Intervallo di Normalità E raccomandabile che ogni Laboratorio stabilisca il proprio intervallo di normalità. gruppo Valore, miu/ml Donne Fase follicolare < 10 Metà ciclo 5-16 Fase luteinica < 10 Post-menopausa Uomini Accuratezza Il kit GONADOTROPINA-FSH EIA è stato confrontato con un test di riferimento in Chemiluminescenza su micro particelle. Il numero totale di campioni è stato di 942.I valori erano compresi tra 0.1 e 150 miu/ml. L equazione di regressione dei minimi quadrati ed il coefficiente di correlazione sono stati calcolati per il kit GONADOTROPINA-FSH EIA in confronto con il kit di riferimento. L equazione è y= (x) con un coefficiente di correlazione di LIMITI DEL TEST 1. Tutti i reagenti contenuti nel kit sono indicati per la determinazione diretta dell FSH nel siero umano. Il kit non è indicato per la determinazione del FSH nella saliva, nel plasma o altri campioni di provenienza umana o animale. 2. Un utilizzo improprio dei campioni o cambiamenti della procedura del test possono alterare i risultati. 3. La dispensazione dei campioni non deve richiedere più di dieci (10) minuti per evitare fenomeni di drift. 4. Solo il Calibratore 0 può essere usato per diluire campioni ad alta concentrazione. L uso di qualunque altro reagente può dare falsi risultati. 5. I risultati ottenuti con il kit non vanno mai usati come unica base per la diagnosi clinica. Qualunque risultato è solo una parte del quadro clinico complessivo del paziente. 6. Alcuni individui possono avere anticorpi eterofili verso proteine di topo o altri animali che possono interferire con il test. Perciò i risultati di pazienti che abbiano ricevuto anticorpi di topo per diagnosi o terapia vanno interpretati con cautela. 7. In questo test non è stato evidenziato alcun effetto gancio. 8. Il test non è inteso per lo screening neonatale BIBLIOGRAFIA 1. Harris, G.W. and Naftolinf., The Hypothalamus and Control of Ovulation, Brit. Med. Bullet., 26, 1-9 (1970). 2. Knobil, E., The Neuroendocrine Control of the Menstrual Cycle, Rec. Prog. Horm Res., 36, (1980). 3. Jeffcoate, S.L., Clinics in Endocrinol. Metab., 4, (1975). 4. Pierce, J.G. and Parsons, T.F., Glycoprotein hormones: Structure and Function, Annual Rev. Biochem., 50, (1981). Delta Chemie Biotechnology SaS Via Nuova Poggioreale, NA TEL/FAX: info@deltachemie.it Prodotto conforme alla direttiva 98/79 CE Rev