DETERMINAZIONE IMMUNOENZIMATICA DIRETTA DELLA FERRITINA NEL SIERO O PLASMA UMANO

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1 DETERMINAZIONE IMMUNOENZIMATICA DIRETTA DELLA FERRITINA NEL SIERO O PLASMA UMANO Ref. IE det. USO DEL KIT Metodo immunoenzimatico per la determinazione quantitativa della Ferritina nel siero o plasma umano. INTRODUZIONE Il ferro è contenuto nell organismo umano in composti essenziali (emoglobina, mioglobina ed enzimi), di riserva (ferritina) o di trasporto (transferrina). La molecola di ferritina consiste in un involucro proteico (apoferritina), costituito da 24 subunità polipeptidiche, con un peso molecolare di circa KDa, e da un nucleo di idrossifosfato di ferro che può essere composto da un numero variabile di atomi (fino a per molecola di apoferritina). Si possono distinguere due tipi di subunità polipeptidiche, le subunità H, più acide (pi ) e più pesanti (P.M.2.000) e le subunità L, più basiche (pi ) e più leggere (P.M ). Combinazioni diverse dei due tipi danno luogo a forme diverse di ferritina, dette isoferritine. Il tipo H predomina nel cuore e nel rene (isoferritina acida), mentre il tipo L si trova prevalentemente nel fegato e nella milza (isoferritina basica). Nel siero circola principalmente isoferritina basica, con contenuto di ferro molto basso. La concentrazione plasmatica di ferritina nell uomo è circa tripla rispetto a quella della donna in età fertile, ed è in relazione con le riserve totali dell organismo. In caso di deficit o di accumulo di ferro, la concentrazione di ferritina nel plasma è correlata con la concentrazione nei tessuti, mentre non lo è in caso di danno tessutale (epatopatie acute o croniche) o tumore (leucemia) nei quali la ferritina è prodotta e liberata nel plasma a livelli elevati. Le principali indicazioni cliniche per le quali è richiesto il dosaggio della ferritina sono: diagnosi differenziale delle anemie (a. sideropenica, a. perniciosa o da malattie croniche), malattie epatiche acute e croniche, insufficienza renale cronica (pazienti in emodialisi), monitoraggio del sovraccarico di ferro (pazienti con ß talassemia major, soggetti politrasfusi,emocromatosiidiomatica), monitoraggio della terapia sostitutiva di ferro, monitoraggio della riserva di ferro nelle donne gravide e nei donatori di sangue, marker tumorale, particolarmente in casi di leucemia acuta mieloblastica, morbo di Hodgkin e in diversi tumori solidi. PRINCIPIO DEL METODO Il presente sistema impiega due anticorpi monoclonali ad alta affinità e specificità diretti contro epitopi differenti della molecola di ferritina. Uno dei due anticorpi monoclonali è adeso alla fase solida, mentre l altro è coniugato all enzima perossidasi di rafano (HRP). I due anticorpi legano la ferritina presente nel campione, dando luogo sulla fase solida alla formazione di un complesso sandwich solubile. I componenti nonlegati vengono rimossi mediante aspirazione e lavaggio. L attività di enzima legato alla fase solida, proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, è determinata con substrato cromogenico specifico (TMB/H2O2). La reazione colorimetrica viene bloccata con una soluzione acida e l intensità del colore misurata fotometricamente a 450 nm. L allestimento di una curva standard, contemporaneamente ai campioni in esame, permette di calcolare per interpolazione la concentrazione incognita di ferritina. CONTENUTO DEL KIT Reagente A Micropiastra 2x8 strip 2 3 Reagente B Tracciante Enzimatico flacone da 3 ml Reagente C Soluzione di Lavaggio 20x flacone da 60 ml. Strip da 8 pozzetti separabili, sensibilizzati con anticorpo monoclonale anti-ferritina umana. Le strip sono montate su supporto e contenute in un sacchetto di alluminio sigillato, contenente una bustina di essiccante. Le strip devono essere condizionate a temperatura ambiente prima della loro apertura, per evitare la formazione di condensa all interno del sacchetto. Soluzione proteica tamponata pronta per l uso contenente anticorpo monoclonale anti-ferritina epatica umana marcato con Perossidasi di rafano (HRP). Contiene stabilizzanti e Gentamicina solfato 0.0% come conservante. Soluzione concentrata da diluire :20 con acqua distillata. Contiene tampone PBS ph 7.4 con tensioattivi e conservanti (Kathon 0.%).

2 4 Reagente D Cromogeno flacone da 2 ml. Soluzione pronta per uso,contenente Tetrametilbenzidina (TMB) con attivatori e stabilizzanti. Conservare al riparo dalla luce. 5 Reagente E Substrato flacone da 2 ml. Soluzione pronta per l uso, contenente Perossido d idrogeno e attivatori. 6 Reagente F Soluzione Bloccante flacone da 6 ml. Soluzione pronta per l uso contenente una miscela di Acido cloridrico e fosforico M. Il prodotto è irritante: Xi R36/37/38 S(/2) Maneggiare con cautela. 7 8 Standard 0 Diluente Standard Ferritina: 5 flaconi da ml ciascuno. flacone da 3.5 ml. Soluzione proteica ferritina-free con Gentamicina 0.0% come conservante. Da utilizzare come Standard 0 ng/ml (S0) e per la diluizione dei campioni a titolo elevato di ferritina. Tampone proteico con conservate (Gentamicina 0.0%) contenente ferritina epatica umana alle seguenti concentrazioni: S: 5 ng/ml, S2: 20 ng/ml, S3: 00 ng/ml,s4: 300 ng/ml, S5: 600 ng/ml. (Calibrati contro lo standard WHO st IS Ferritin, human liver, 80/602) 5 PRECAUZIONI PER L USO L'affidabilità dei risultati dipende dall'esecuzione corretta delle seguenti buone pratiche di laboratorio: Non usare reagenti scaduti. Non mescolare i reagenti di lotti differenti. Prima dell'uso, aspettare 30 minuti, tutti i reagenti devono stabilizzarsi a temperatura ambiente (8-24 º C). Ricostituire con attenzione i reagenti evitando eventuali contaminazioni. Non effettuare il test in presenza di vapori reattivi (vapori alcalini, acidi e di aldeidi) o di polvere che potrebbe alterare l'attività enzimatica dei coniugati. Usare cristalleria lavata e risciacquata completamente con acqua deionizzata o preferibilmente, materiale usa e getta. Non lasciare che la micropiastra si asciughi fra la conclusione delle operazioni di lavaggio e la distribuzione del reagente. La reazione enzimatica è molto sensibile agli ioni metallici. Di conseguenza, non lasciare che alcun elemento metallico entri in contatto con le varie soluzioni del substrato o del coniugato. Utilizzare un puntale nuovo per ogni campione. La procedura di lavaggio è una tappa critica in questa procedura: rispettare il numero suggerito di cicli di lavaggio e assicurarsi che tutti i pozzetti siano completamente riempiti e poi siano completamente svuotati. Un lavaggio errato può condurre a risultati inesatti. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di sviluppo di colore. Controllare le pipette e le altre attrezzature per verificare il corretto funzionamento. Non cambiare la procedura di analisi. Usare acqua di alta qualità. Durante la conservazione evitare l'esposizione dei reagenti all'eccessivo calore o alla luce solare ISTRUZIONI DI SICUREZZA Tutti i reagenti inclusi nel kit sono intesi per uso diagnostico in vitro. Il materiale di origine umano utilizzato nella preparazione del siero di controllo è stato testato e trovato negativo per l HBsAg, anticorpi del virus dell epatite C e gli anticorpi del virus dell immunodeficenza umana (HIV- e HIV-2) e l'antigene p24 HIV-. Comunque,nessun metodo può completamente assicurare l assenza di questi agenti infettivi. Pertanto,come tutti i prodotti provenienti da sangue umano,inclusi i sieri dei campioni, devono esser considerati come potenzialmente infettivi. Manipolare,perciò, i reagenti secondo i normali comportamenti previsti dalle normative vigenti che disciplinano tale materia,se esistenti. Non mangiare, non bere, non fumare, o non utilizzare cosmetici negli ambienti dove avvengono i dosaggi. Non pipettare per via orale. Tutta l'apparecchiatura direttamente in contatto con i campioni e i reagenti così come le soluzioni di lavaggio, dovrebbero essere considerati come prodotti contaminati ed essere trattati come tale. Portare camici da laboratorio e guanti usa e getta durante la manipolazione dei campioni e dei reagenti e lavarsi le mani dopo il loro utilizzo.. Evitare di rovesciare i campioni o le soluzioni che contengono i campioni. Evitare il contatto di pelle e mucose con il substrato cromogeno, il tampone di lavaggio e la soluzione d'arresto Fornire una sufficiente ventilazione. 2

3 MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO DAL KIT Acqua distillata o deionizzata ; micropipetta multicanale automatica o semi-automatica, µl; micropipette calibrabile per volume variabili, µl; Termostato a secco per 37 С ± 0. C; Fotometro per micropiastre con una lunghezza d onda di 450 nm e un intervallo di misurazione di OD. Conservazione e stabilità del Kit. Il kit deve essere conservato a 2-8 C e deve essere utilizzato prima della data di scadenza riportata sull etichetta. 2. Le strip non utilizzate nell analisi precedente devono essere riposte nella busta apposita, in presenza dell essiccante, e questa sigillata ermeticamente prima di rimettere a 2-8 C. Dopo l apertura, le strip sono stabili fino alla data di scadenza riportata sull etichetta. 3. La soluzione di lavaggio diluita può essere conservata a temperatura ambiente per settimana oppure 3 settimane a 2-8 C. 4. Per la preparazione della miscela cromogeno/substrato si consiglia l utilizzo di contenitori monouso in plastica. Tale miscela è stabile per 4 ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. 5. Tutti gli altri reattivi liquidi possono essere utilizzati ripetutamente fino ad esaurimento se conservati a 2-8 C e manipolati in modo da ridurre contaminazioni ambientali. In tali condizioni, sono stabili fino alla data di scadenza riportata in etichetta. CAMPIONI Il dosaggio può essere effettuato indifferentemente su siero o su plasma (in ACD o Eparina). I campioni se non utilizzati immediatamente possono essere conservati a 2-8 C per 48 ore; in caso di conservazione prolungata congelare a-20 C.Evitare ripetuti scongelamenti/congelamenti. Evitare di utilizzare sieri torbidi, lipemici, bemolizzati o con contaminazione microbica. PREPARAZIONE DEI REATTIVI SOLUZIONE DI LAVAGGIO: diluire :20 con acqua distillata o grado ELISA (es. 60 ml di Reagente C ml di acqua distillata) e miscelare con cura prima dell uso. Si consiglia di lasciare a temperatura ambiente la soluzione diluita, per un suo immediato impiego. CROMOGENO/SUBSTRATO: preparare in un contenitore di plastica, secondo la necessità, la soluzione substrato/cromogeno miscelando in volumi uguali il Reagente D con il Reagente E. ISTRUZIONI PER IL LAVAGGIO Una buona procedura di lavaggio è fondamentale per l ottenimento di risultati analitici corretti e precisi. Pertanto si consiglia di usare un lavatore di micropiastre ELISA di buona qualità, mantenuto ad un ottimo livello di prestazioni meccaniche di lavaggio. In genere 3-5 cicli di lavaggio automatico da 0.3 ml/pozzetto ciascuno sono sufficienti per rimuovere false positività e fondo elevato. Si consiglia comunque di tarare il sistema di lavaggio sul kit in oggetto in modo da raggiungere le caratteristiche analitiche dichiarate. Nel caso di lavaggio manuale, si consiglia di effettuare 5 cicli di lavaggio, dispensando ed aspirando 0.3 ml/pozzetto per ciclo. In ogni caso gli eluati provenienti dalla piastra devono essere inattivati con una soluzione di ipoclorito di sodio al 2.5% finale, prima del loro smaltimento, trattandosi di campioni potenzialmente infettivi. PROCEDIMENTO DEL DOSAGGIO. Almeno un ora prima dell uso, portare a temperatura ambiente (8-30 C) reagenti, standard e campioni, agitandoli accuratamente su vortex. 2. Reagenti provenienti da lotti differenti non devono essere mescolati fra loro. 3. Si consiglia di distribuire standard e campioni in duplicato. 4. I tempi di distribuzione e di incubazione devono essere identici per tutti i pozzetti di una stessa serie di analisi. 5. Evitare interruzioni prolungate tra i diversi passaggi del procedimento analitico. 6. Quando si esegue il lavaggio manuale della micropiastra, la soluzione di lavaggio può essere rimossa anche per semplice decantazione, asciugando accuratamente la micropiastra rovesciandola su carta assorbente e scuotendola delicatamente per rimuovere ogni eccesso di liquido dai pozzetti. 7. Il colore della soluzione finale di lettura è stabile per ora al massimo. Tuttavia, in caso di lettura differita di 0-5 min. dopo l aggiunta della soluzione bloccante, porre immediatamente la micropiastra al riparo dalla luce. 8. Si consiglia di effettuare la lettura della micropiastra con un lettore ELISA automatico in grado di eliminare il rumore di fondo a nm e leggere l assorbanza dei campioni e standard a 450 nm. Il blanking dello strumento viene effettuato contro un pozzetto in cui si dispensa solo la miscela cromogeno/substrato e poi la soluzione bloccante. 3

4 PRINCIPIO DEL METODO Se la concentrazione attesa del campione fosse al di sopra dello Standard 600 ng/ml (S 5), diluire tale campione usando lo Standard 0. Seguire il seguente schema: Reazione immunologica Pozzetti sensibilizzati con anticorpo anti-ferritina REAGENTI Bianco Standard Campione Standard - 20 µl - Campione µl Reagente B (Tracciante Enzimatico) - 00 µl 00 µl - Coprire le strips con la pellicola adesiva - Incubare 60 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) o 30 minuti a 37 (± ) C Lavaggio - Togliere la pellicola adesiva e aspirare la miscela di reazione da tutti i pozzetti - Lavare 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita, aspirando con cura ogni traccia della soluzione Reazione colorimetrica Reagente D+E (Cromogeno-Substrato) miscelati : 200 µl 200 µl 200 µl - Coprire le strips con la pellicola adesiva - Incubare 0 minuti a temperatura ambiente (20-25 C), al riparo dalla luce Reagente F (Soluzione bloccante) 50 µl 50 µl 50 µl Leggere l assorbanza di ciascun pozzetto contro bianco a 450 e nm CALCOLO DEI RISULTATI. Per ogni standard e campione calcolare la media delle assorbanze misurate. 2. Riportare su carta semilog o log-log l assorbanza di ciascuno standard (asse delle ordinate Y) in funzione della rispettiva concentrazione in ng/ml (asse delle ascisse X). 3. Tracciare la migliore curva di calibrazione e, utilizzando l assorbanza media di ciascun campione, leggere sulla curva il valore di concentrazione incognita di ferritina. Note:. E consigliabile leggere la piastra alle seguenti tre lunghezze d onda: 405, 450 e 630 nm. Eseguire i seguenti calcoli: Sottrarre la DO a 630 nm dal valore di DO a 450 nm e dal valore di DO a 405 nm. Calcolare il rapporto K = DO 450 nm/do 405 nm su uno standard o campione con valore DO a 450 nm compreso tra.3 e.9. Per i campioni che forniscono un valore di DO a 450 nm superiore alla capacità di lettura lineare dello strumento disponibile, utilizzare il seguente calcolo per ricavare DO equivalente: DO 450 nm equivalente = K x DO 405 nm. Normalizzare tutti i valori in DO 450 nm. Per i lettori più diffusi, K è compreso tra 3.3 e Qualora si utilizzino sistemi automatici per la misura e l elaborazione dei dati si consiglia l impiego di programmi del tipo four parameter logistics o cubic spline. 3. I campioni fuori del range di misura devono essere diluiti opportunamente con lo Standard 0 e ridosati, moltiplicando il nuovo risultato per il fattore di diluizione impiegato. Esempio di calcolo Es. di curva di calibrazione, non utilizzare per il calcolo dei risultati. Standard (ng/ml) DO 450 nm DO 405 nm S0 (0 ng/ml) S (5 ng/ml) S2 (20 ng/ml) S3 (00 ng/ml) S4 (300 ng/ml) S5 (600 ng/ml) CRITERI DI ACCETTABILITA Perché una prova sia ritenuta valida, devono essere verificati i seguenti criteri di accettabilità:. Il pozzetto di azzeramento (bianco) deve fornire una DO 450 nm inferiore a Valori superiori sono indice di contaminazione del cromogeno/substrato. In tal caso ripetere la prova controllando accuratamente il reattivo. 2. Dopo sottrazione del fondo, il valore medio della DO 450 nm dello Standard 0 ng/ml deve risultare inferiore a Valori superiori sono indice di una scorretta operazione di lavaggio. In tal caso controllare l efficienza del sistema di lavaggio. 3. La DO 450 nm del punto Standard 5 ng/ml deve essere maggiore della DO 450 nm dello Standard 0 ng/ml. 4. Il valore della DO 450 nm dello Standard 600 ng/ml deve risultare superiore a

5 VALORI ATTESI In base a dati ottenuti dalla Intermedical S.r.l., viene suggerito l intervallo di riferimento sotto riportato. Comunque, si raccomanda che ciascun laboratorio stabilisca i propri intervalli in riferimento alla popolazione in esame. Soggetti n. Media (ng/ml) Range (ng/ml) Maschi adulti Donne in età fertile Donne in postmenopausa CARATTERISTICHE ANALITICHE Precisione a. Variazione nella serie (n = 28) Media DS Campione (ng/ml) (ng/ml) %CV Siero # Siero # Siero # b. Variazione tra le serie (n = 2) Campione Media DS (ng/ml) (ng/ml) %CV Siero # Siero # Siero # Sensibilità La sensibilità del metodo, in termini di limite di determinazione (LOD), è di ng/ml. Specificità Le cross-reazioni del sistema anticorpale utilizzato con iso-ferritina di milza e di cuore umani sono risultate rispettivamente del 90% e del 5%. Effetto hook Campioni con concentrazioni di ferritina comprese tra.000 e ng/ml determinano sempre valori di assorbanza superiore a quella riscontrabile sullo standard a maggior concentrazione del kit. Accuratezza a. Parallelismo ng/ml ng/ml Recupero Campione Diluizione misurati attesi (%) Siero # : : : : Siero # : : : : b. Recupero ng/ml ng/ml ng/ml Recupero Campione aggiunti misurati attesi* (%) Siero # Siero # * nel calcolo del valore atteso si è tenuto conto dell effetto di diluizione :2 prodotto dall aggiunta dei campioni di ferritina a concentrazione nota al campione iniziale. c. Correlazione con altri metodi Il presente metodo per il dosaggio immunoenzimatico della ferritina (y) è stato confrontato con un metodo immunoradiometrico del commercio (x).su una popolazione di 50 campioni con livelli di ferritina compresi tra 2 e 495 ng/ml, sono stati ottenuti i seguenti dati di correlazione lineare: y =.05x ng/ml r =

6 Interferenze La presenza di Fattori reumatoidi (fino a 000 IU/ml), Bilirubina (fino a 40 mg/dl), Emoglobina (fino a 000 mg/dl), Trigliceridi (fino a 900 mg/dl) e Colesterolo (fino a 800 mg/dl) non produce sul dosaggio interferenze significative. PRECAUZIONI D'USO Attenzione il Reagente F è irritante (Xn). Riferirsi alla Scheda di Sicurezza. Gli altri reagenti contengono componenti inattivi, quali i conservanti (Sodio Azide o altri), tensioattivi ecc. La concentrazione totale di questi componenti è inferiore ai limiti riportati dalle direttive CEE 67/548/EEC e 88/379/EEC sulla classificazione, confezionamento ed etichettatura delle sostanze pericolose. Tuttavia i reagenti vanno trattati con cautela. Evitare di inghiottire, evitare il contatto con la pelle, con gli occhi e le membrane mucose. Nell utilizzo dei reagenti di laboratorio si raccomanda di seguire le norme di buona pratica di laboratorio. Gestione rifiuti Attenersi alle norme locali per quanto riguarda lo smaltimento dei reagenti. BIBLIOGRAFIA. Walters G.O., Miller F.W., Wor Wood, M. Serum Ferritin Concentration and Iron Stores in Normal Subjects J. Clin. Path. 26 : (973). 2. Watanabe, N. Niitsu, Y. Ohtsuka, S. Koseki, J. Kohgo, Y. Urushizaki, I. Kato, K. Ishikawa, E. Enzyme Immunoassay for Human Ferritin Clin. Chem., 25/, (979). 3. Van Oost, B.A. Willekens, F.L.A. Van Neerbos, B.R. Van Den Beld, B. Implications of Using Different Tissue Ferritins as Antigens for Ferritin in Serum : Four Radioimmunoassay Kits Compared Clin. Chem. 28/2, (982). 4. Ronald H., Ng. Brown, A.B. Valdes JR Three Commercial Methods for Serum Ferritin Compared and The High Dose Hook Effect Eliminated Clin. Chem. 29/6, 09-3 (983). Prodotto conforme alla direttiva 98/79 CE Rev Delta Chemie Biotechnology SaS Via Nuova Poggioreale, NA TEL/FAX: info@deltachemie.it 6