CONFRONTO TRA DUE SAGGI IMMUNOENZIMATICI PER LA DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M 1 NEL LATTE

Transcript

1 CONFRONTO TRA DUE SAGGI IMMUNOENZIMATICI PER LA DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M 1 NEL LATTE COMPARISON BETWEEN TWO IMMUNOENZIMATIC TESTS FOR DETERMINATION OF AFLATOXIN M 1 CONCENTRATION IN MILK Serraino A., Zironi E., Gazzotti T., Sticca P., Pagliuca G. Tel , Fax serraino@vet.unibo.it Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria Università di Bologna RIASSUNTO La contaminazione da aflatossine nel mais e nel latte è stato un problema emergente nell autunno del 3 in Italia. Per la valutazione delle contaminazioni da AFM 1 nel latte possono essere utilizzate metodiche di screening (ELISA) e di conferma (HPLC). Nel lavoro sono state messe a confronto le performances di due differenti kit ELISA in campioni artificialmente contaminati a concentrazioni di AFM 1 da ppt a 8 ppt. I risultati evidenziano una notevole discrepanza tra i due test utilizzati, sia in termini di linearità della risposta che in termini di accuratezza e precisione. SUMMARY Aflatoxin contamination of corn and milk was an emerging problem in Italy in autumn 3. Screening (ELISA) and confirmation (HPLC) methods for assessment of AFM 1 contamination in milk can be used. In this work performances of two different commercial ELISA kits were compared, in samples spiked at concentration from ppt to 8 ppt. Results show a remarkable discrepancy between the two tests both for linearity of the response and for accuracy and precision. INTRODUZIONE Le micotossine sono metaboliti secondari dell attività di diversi generi di funghi; tra le micotossine risulta di particolare interesse il gruppo delle aflatossine, composti ad elevata tossicità prodotti dalle specie fungine Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. Le aflatossine che possono essere rinvenute più frequentemente nei vegetali sono la B 1, B 2, G 1 e G 2 (Capuano e coll., 1999). Poco dopo la prima scoperta di queste micotossine, Allcroft e Carnagan (1963) suggerirono che residui di aflatossine potessero essere presenti nel latte e in altri prodotti di origine animale; successivamente fu individuata la presenza di un fattore tossico nel latte di vacche che poche ore prima avevano ingerito mangimi contaminati da aflatossina B 1 (Van Egmond, 1989). Il fattore tossico, denominato aflatossina M 1, è un derivato dalla metabolizzazione epatica dell aflatossina B 1. Una problematica che soventemente riguarda le coltivazioni di mais in Italia è la presenza di miceti tossigeni; da questo punto di vista le contaminazioni considerate più importanti sono quelle dovute alla crescita di miceti appartenenti al genere Fusarium. Le aflatossine non sono ritenute una problematica principale in Europa in quanto sono considerate tipiche delle regioni tropicali. Tuttavia nei climi caldi dei paesi del sud dell Europa in alcune annate si possono creare le condizioni per una diffusa contaminazione del mais (Pietri e Piva, ).

2 L estate del 3 è stata caratterizzata da elevate temperature. Durante giugno, luglio e agosto sono stati raggiunti i C e ciò probabilmente ha creato le condizioni per la proliferazione delle specie del genere Aspergillus, infatti nell autunno del 3 si è verificato un aumento della contaminazione da aflatossine nei prodotti destinati all alimentazione degli animali, ed in particolare nel mais. Tale aumento ha generato il conseguente aumento della concentrazione di aflatossina M1 nel latte, creando una situazione di emergenza tale da indurre il Ministero della Salute italiano ad adottare specifici provvedimenti. Il Ministero tra l altro evidenziato la necessità di chiarire le metodiche analitiche da utilizzare identificando i kit ELISA di tipo quantitativo o semiquantitativo come idonei ai fini dello screening e del monitoraggio e per consentire la valutazione del rischio e una sua efficace gestione; al contrario i test ELISA sembrano essere ritenuti non idonei in presenza di campionamenti che abbiano comportato il sequestro di una partita, richiedendo la conferma con la metodica HPLC. L incertezza delle determinazioni, infine, può porre problematiche nei rapporti cliente fornitore qualora i test evidenzino il superamento dei limiti fissati e determinino penalizzazioni di carattere commerciale. Lo scopo del presente lavoro è stato quello di confrontare le risposte di due saggi immunoenzimatici per la determinazione di aflatossina M 1 sottoponendo all'analisi latte contaminato a vari livelli e verificando la correttezza delle soluzioni impiegate mediante cromatografia ad alta prestazione munita di detector fluorimetrico (HPLC-FL). MATERIALI E METODI Soluzione madre dello standard di aflatossina M 1 3mL di standard di aflatossina M 1 ( ng/ml in acetonitrile; R-Biopharm Rhone Ltd) sono stati prelevati e portati esattamente al volume di 15 ml con acetonitrile in matraccio tarato, ottenendo così una soluzione madre della concentrazione di 1 ng/15 ml ( ppb) da utilizzare per la fortificazione dei campioni di latte. Fortificazione dei campioni di latte Per la preparazione di campioni fortificati è stato impiegato latte crudo in cui si è verificata l'assenza di contaminazione da aflatossina M 1. Dopo una accurata miscelazione dell'intera massa, sono state preparate 8 aliquote e poste in matracci da ml ciascuno, preventivamente sterilizzati in autoclave. Il latte è stato quindi contaminato con quantità note della soluzione madre, al fine di ottenere 8 campioni alle seguenti concentrazioni: ppt, ppt, ppt, ppt, ppt, 6 ppt, 7 ppt, 8 ppt.

3 Determinazione immunoenzimatica I campioni di latte fortificati alle otto concentrazioni precedentemente riportate sono stati analizzati mediante saggio immunoenzimatico. Lo svolgimento delle prove è stato condotto per due tornate a distanza di due settimana l una dall altra, entrambe seguendo precisamente le istruzioni di ciascun Kit, ripetendo il test per ciascuna concentrazione cinque volte nella prima tornata e tre volte nella seconda tornata. Per il confronto sono stati utilizzati i saggi di due differenti ditte (Kit A e Kit B). Le letture spettrofotometriche sono state realizzate utilizzando spettrofotometro per micropiastre Multiscan EX Labsytem misurando l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 4 nm. RISULTATI Verifica delle soluzioni impiegate Le soluzioni standard di alfatossina M 1 nel range riferito al latte di a 8 ppt analizzate in HPLC-FL, costruendo una retta di taratura standard sulle 8 concentrazioni iniettate almeno tre volte ciascuna, hanno dimostrato una buona linearità (R 2 =,9957) dimostrando la corretta esecuzione delle operazioni di diluizione. Determinazione ELISA In Fig. 1 e Fig. 2 sono riportati i grafici dei rapporti tra livello di fortificazione e risposta sperimentale delle due prove condotte su ciascun kit con l'indicazione dei singoli valori ottenuti in modo da meglio visualizzare la variabilità della risposta. Kit A Tecna prova prova 1 1 Kit A prova Tecna prova Fig.1. Risposta delle singole misure al variare della concentrazione del kit A

4 Kit B prova 1 Kit B prova 2 R-Biopharm prova 1 R-Biopharm prova Fig.2. Risposta delle singole misure al variare della concentrazione del kit B In Tabella 1 vengono riportati per ciascun kit le medie dei recuperi effettuate nelle 8 prove ai differenti livelli di fortificazione ed il relativo coefficiente di variazione. Per maggior chiarezza sono stati riportati anche i valori medi delle singole misure e la relativa deviazione standard. Tabella 1 Confronto tra i valori di accuratezza e precisione dei due kit impiegati Fortificazione (ppt) Kit Ditta A Kit Ditta B Recupero % (CV) Misura Recupero % (CV) Misura 84,6 (6,3) 8,5 ±,5 54,9 (22,5) 5,5 ± 1,2 91,9 (11,8) 18,4 ± 2,2 57,5 (19,6) 11,5 ± 2,3 8,5 (,1) 32,6 ± 3,3 67,3 (18,6),2 ± 3,8 5,2 (6,3) 42,1 ± 2,7 73,9 (14,) 29,6 ± 4,1 112,3 (4,5) 56,1 ± 2,5 75, (18,4) 37,5 ± 6,9 6 2,4 (2,9) 61,4 ± 1,8 75,7 (7,9) 45,4 ± 3,6 7 9,6 (2,3) 76,7 ± 1,8 67,3 (17,) 47,1 ± 8, 8 4,7 (5,1) 83,7 ± 4,3 64,8 (11,2) 51,8 ± 5,8

5 9 8 R 2 =, R 2 =,9777 Kit B Kit A Lineare (Kit A) Lineare (Kit B) Fig. 3 Confronto lineare tra i risultati ottenuti con le metodiche in esame 9 8 R 2 =, R 2 =,9915 Kit B Kit A Poli. (Kit A) Poli. (Kit B) Fig. 4 Estrapolazione polinomiale dei risultati ottenuti con le metodiche in esame DISCUSSIONE

6 Dai dati riassuntivi riportati in Tabella 1 dal confronto tra i livelli di fortificazione e la media delle risposte sperimentali riportate in Figura 3, si nota che le migliori prestazioni si ottengono con il saggio immunoenzimatico A: il valore medio di recupero, nel range di concentrazioni considerato, è del 2,4 %, con un coefficiente di variazione medio del 6,2%. I dati inoltre mostrano una ottima linearità (R 2 =,9941) e, confrontando i risultati ottenuti nelle due giornate diverse, una buona ripetibilità (vedi Fig. 1). Il kit B ha mostrato un recupero medio del 67,1 % con un coefficiente di variazione medio del 16,2. Questo determina il comportamento descritto nelle Figure 2 e 3, in cui si nota la costante sottostima del dato e la notevole variabilità nella misura. I dati inoltre sono poco lineari e sembra possano essere meglio descritti da una curva (vedi Fig. 4). Il confronto mediante l'utilizzo di matrici contaminate a livello noto ha messo quindi in evidenza una notevole discrepanza tra i due saggi utilizzati. Tale differenza di prestazione si è evidenziata anche ripetendo l'analisi in giornate differenti utilizzando la stessa piastra. Tali piastre contengono 96 pozzetti e possono essere impiegate, secondo le indicazioni fornite dalle Ditte, anche in giorni successivi. Occorre sottolineare che per questo confronto sono state necessariamente usate matrici fortificate e che l effettuazione del test su matrici naturalmente contaminate potrebbe non fornire i medesimi risultati; occorre inoltre evidenziare che per ciascuna Ditta è stato testata una sola confezione di saggio. Ammettendo anche che queste differenze evidenziate fossero da imputare ad un lotto difettoso rimane il serio rischio di sottostimare la reale contaminazione del latte. Nel nostro caso ipotetico, utilizzando il kit B non sarebbe stato sequestrato e rinviato alla verifica HPLC neanche il campione contaminato a 7 ppb. Alla luce di ciò appare evidente la necessità di costante controllo e verifica delle metodiche impiegate. BIBLIOGRAFIA Allcroft, R. & Carnaghan, R. B. A. (1963). Groundnuts toxicity: an examination for toxin in human food products from animals fed toxic groundnut meal. Vet. Rec., 75, Capuano A., Dugo G., Restani P. (1999) Tossicologia degli alimenti. UTET, Torino. Pietri, A. & Piva, G. () Occurrence and control of mycotoxins in maize grown in Italy. In: Proceedings of the 6 th International Feed Production Conference, Piacenza, November. Van Egmond, H.P. (1989) Aflatoxin M1: Occurrence, toxicity and regulation. In: van Egmond, H.P., ed., Mycotoxins in Dairy Products, London, Elsevier Applied Science, pp