Allineamento e similarità di sequenze

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1 Allineamento e similarità di sequenze

2 Allineamento di Sequenze L allineamento tra due o più sequenza può aiutare a trovare regioni simili per le quali si può supporre svolgano la stessa funzione; La similarità tra due o più sequenza può essere definita in base a una funzione distanza: Tanto più simili sono le sequenze, tanto meno distanti sono; Esistono diversi algoritmi di allineamento ciascuno dei quali definisce una funzione distanza; Dato un allineamento possiamo assegnare uno Score che indica il grado di similarità delle due sequenze.

3 Confrontare sequenze Il confronto fra sequenze, nucleotidiche o aminoacidiche, è uno dei compiti fondamentali della bioinformatica. Perché è possibile confrontare sequenze? Perché generalmente in natura le strutture molecolari non vengono create ex-novo ma per modificazione di modelli preesistenti. Obiettivi del confronto: Filogenesi molecolare Evoluzione dei singoli genomi Caratterizzazione di proteine con funzione sconosciuta

4 Confrontare sequenze (2) Filogenesi molecolare La filogenesi molecolare, attraverso il paragone tra sequenze nucleotidiche o aminoacidiche, consente di costruire alberi filogenetici che illustrino le distanze ed i rapporti evolutivi tra le molecole analizzate. A differenza della filogenesi classica, che prende in considerazione le caratteristiche morfologiche dei vari organismi per delinearne l evoluzione, la filogenesi molecolare non consente lo studio evolutivo degli organismi ma permette di identificarne le relazioni evolutive molecolari. Caratterizzazione di proteine con funzione ignota Il confronto di una proteina a funzione ignota con una famiglia di proteine a funzione nota può permettere di formulare ipotesi sulla funzione della prima.

5 Similarità e omologia Tra due o più sequenze può esserci un certo grado di similarità. Tale similarità può essere misurata in modi diversi, anche a seconda del tipo di sequenze in esame (Nucleotidiche o aminoacidiche). A volte una similarità tra sequenze implica una similarità strutturale e, conseguentemente, una similarità funzionale. L omologia tra sequenze indica invece una comune origine evolutiva tra di esse. Due sequenze si dicono omologhe quando discendono entrambe da una sequenza ancestrale comune. Due o più sequenze simili tra loro possono quindi essere omologhe o meno.

6 OMOLOGIA= indica che due entità (es. 2 sequenze) hanno una stessa origine filogenetica, cioè derivano da un antenato comune. È un carattere QUALITATIVO. SIMILITUDINE (analogia)= indica che due entità (es. 2 sequenze), in relazione ad un certo criterio comparativo, hanno un certo grado di somiglianza. È un carattere QUANTITATIVO.

7 SIMILARITA : é un dato che prescinde da eventuali ipotesi sulla causa della similarità stessa. Ad esempio: l ala di un uccello e l ala di un pipistrello si sono evolute indipendentemente e di conseguenza non sono omologhe. La similarita osservata tra due sequenze PUO indicare che esse siano omologhe, cioe evolutivamente correlate La similarita tra sequenze si osserva, l omologia tra sequenze si puo ipotizzare in base alla similarita osservata.

8 Omologia e Analogia, Ortologia e Paralogia OMOLOGIA (ANTENATO COMUNE) ORTOLOGIA Elementi omologhi derivanti da un Processo di speciazione PARALOGIA Elementi omologhi derivanti da un Processo di duplicazione genica per esempio, la catena β dell emoglobina e un paralogo della catena α dell emoglobina e della mioglobina, dal momento che ambedue si sono evolute dallo stesso gene ancestrale attraverso ripetuti eventi di duplicazione genica.

9 Allineamento di sequenze Per poter procedere al confronto tra sequenze nucleotidiche o tra sequenze proteiche è necessario che queste sequenze vengano allineate. Questo è un esempio di allineamento multiplo di 5 brevi sequenze aminoacidiche.

10 Allineamento di Sequenze GLOBALE: Si cerca la corrispondenza ottimale tra tutti gli amminoacidi (nucleotidi) di entrambe le sequenze. LOCALE: Si cerca di individuare regioni locali di similarità. Globale Globale LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG Locale Locale LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK.. TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG

11 Allineamento Pairwise (a coppie) Matrici Dot Plot Si crea una matrice in cui vengono confrontati tutti i possibili appaiamenti di ogni carattere delle due sequenze da allineare. Si riempie la matrice, annerendo le caselle che hanno nella corrispondente riga e colonna la stessa lettera. Il programma DOTLET ( date due sequenze in input permette di disegnare facilmente la relativa matrice Dot Plot.

12 Allineamento Pairwise m a r g a r e t d a y h q f f Matrici Dot Plot margaretqaklerdayhqff Duplicazione Inversione Similarità

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14 Allineamento Pairwise Matrici Dot Plot FILTRAGGIO Window Size E chiaro che il numero di punti della matrice è influenzato dalla natura della sequenza; Se confrontiamo due sequenze di nucleotidi (o proteine) costituite da 1 residui, assumendo che ciascun nucleotide (o aminoacido) occorra con la stessa probabilità, il numero totale di punti della matrice sarà mediamente pari a 25 (5 nel caso di aminoacidi) su 1 celle totali; Quando confrontiamo sequenze nucleotidiche il rumore di fondo sara più elevato; Possiamo confrontare finestre costituite da w residui contigui; In tal caso metteremo un dot nella cella (i,j) solo nel caso in cui le stringhe (ai, ai +1,..., aw ) (b j, b j +1,..., bw ) risultino identiche per s residui su w.

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17 Allineamento di stringhe Cominciamo con l affrontare il problema più generale dell allineamento di una coppia di stringhe. Date due stringhe acbcdb e cadbd, in che modo possiamo stabilire quanto sono simili? La similarità scaturisce dall allineamento ottimale delle due stringhe. Ecco un possibile allineamento: a - c c a d b b c - d d b - Il carattere speciale - rappresenta l inserimento di uno spazio, che sta a significare una cancellazione nella sequenza o, equivalentemente, un inserzione nell altra sequenza (Mutazioni/Operazioni di INDEL).

18 Similarità e distanza a - c c a c d b b c - d d b - Possiamo valutare il grado di correlazione tra stringhe calcolandone la similarità o la distanza. Due stringhe che presentano alta similarità sono poco distanti, due stringhe che presentano bassa similarità sono molto distanti.

19 Distanza di editing E possibile calcolare la distanza tra due stringhe utilizzando, per esempio, la distanza di editing. La distanza di editing è definita come il minimo numero di operazioni da eseguire (inserimenti, cancellazioni, sostituzioni) per trasformare una stringa in un altra. a a g c c c t t t g - a a In questo caso per trasformare la prima stringa nella seconda dobbiamo inserire una g, sostituire una c con una t e cancellare una g. La distanza di editing tra le due stringhe è dunque 3.

20 La scoring function: similarità a a c c a c d b b c - d d b - In generale è possibile valutare il grado di similarità o la distanza tra due stringhe, assegnando un punteggio (score) all allineamento utilizzando un opportuna scoring function. Per esempio, se assegniamo un punteggio di +2 per ogni match esatto e un punteggio di -1 per ogni mismatch o indel, la similarità tra le due sequenze secondo l allineamento considerato sarà: S= ( 1)=4

21 La scoring function: distanza a a c c a c d b b c - d d b - Se assegniamo uno score pari a nel caso di matches, pari ad 1 in caso di sostituzione di caratteri e pari a 2 in caso di allineamento con uno spazio, la distanza tra le due stringhe precedenti secondo l allineamento considerato è: d= =7

22 La scoring function Più formalmente: Se x e y sono singoli caratteri o spazi, allora con il simbolo denotiamo lo score dell allineamento di σ ( x,y) è la scoring function. x con y; Ovviamente possiamo costruire σ delle scoring function ad hoc per ogni problema; se, ad esempio, volessimo costruire una scoring function per il confronto di aminoacidi, faremmo in modo da tenere presenti le similarità chimico-fisiche e le differenze tra gli aminoacidi stessi.

23 Pairwise alignment Sia S una sequenza. Con il simbolo S denotiamo la lunghezza di S e con S[i] indichiamo l i-esimo carattere di S. Se ad es. S = acbcdb, avremo S =6 e S[3]=b. Siano S e T due sequenze. Un allineamento A associa ad S e T le sequenze S e T, che possono contenere simboli di spazio -, in modo che S = T Rimuovendo gli spazi da S e T otteniamo S e T.

24 Ricerca miglior allineamento Lunghezza: s1=6 s2=6 Numero confronti s1+s2-1 = 11 ILVVIV VLVVII ILVVIV VLVVII ILVVIV VLVVII Caratteri confrontati s1s2 = 36 1 ILVVIV VLVVII ILVVIV VLVVII 1 ILVVIV VLVVII ILVVIV VLVVII 1 ILVVIV VLVVII 2 ILVVIV VLVVII 4 2 ILVVIV 2 VLVVII ILVVIV 1 VLVVII

25 Ordine di un Algoritmo 34

26 Pairwise alignment (2) Lo score dell allineamento sequenze è dato da: di una coppia di l σ ( S' [ i ],T' [ i ]) i=1 Dove l = S = T. L allineamento ottimale di S e T è quello che massimizza la similarità tra le sequenze o che minimizza la loro distanza. Nel seguito utilizzeremo il termine score per indicare il grado di similarità tra sequenze.

27 Allineamento di proteine: Matrici di sostituzione Nella valutazione di un allineamento di sequenze ci chiediamo se tale allineamento è casuale o biologicamente significativo, ed in questo caso ci chiediamo quanto è biologicamente significativo. Abbiamo visto che la scoring function associa un valore numerico ad ogni coppia di caratteri. Le matrici di sostituzione associano un valore numerico ad ogni possibile coppia di aminoacidi, tenendo conto delle similarità chimiche tra di essi. Tali matrici possono quindi essere utilizzate come scoring function per l allineamento di proteine.

28 Le matrici di punteggio Matrice identità Matrice transizione trasversione Matrice BLAST A T C G A T A 1 T 1 C G C G A T A T C G C G A T C G

29 Similarità tra aminoacidi Gli aminoacidi possono essere classificati in base alle loro proprietà chimico-fisiche. Nel confronto di proteine occorre tenere conto di queste proprietà.

30 Matrici PAM Le matrici PAM (Point Accepted Mutations) furono sviluppate alla fine degli anni 7 esaminando le mutazioni all interno di superfamiglie di sequenze aminoacidiche strettamente correlate tra loro. Si notò che le sostituzioni che occorrevano tra sequenze strettamente correlate non erano casuali. Si concluse che alcune sostituzioni di aminoacidi occorrono più facilmente di altre, probabilmente a causa del fatto che tali sostituzioni non alterano significativamente la struttura e la funzione di una proteina. Ciò significa che proteine omologhe non devono necessariamente avere gli stessi aminoacidi in ogni posizione.

31 Unità e matrici PAM Usiamo le unità PAM per misurare la distanza tra sequenze aminoacidiche. Due sequenze S1 ed S2 distano 1 unità PAM se S1 può essere trasformata in S2 con una media di 1 mutazione puntuale ogni 1 aminoacidi. In una sequenza la stessa posizione può mutare più volte e tornare quindi al carattere originario; dunque due sequenze che distano 1 PAM possono differire di meno dell 1%.

32 Le matrici PAM Esistono diversi tipi di matrici PAM. Ognuna di esse è utilizzata per confrontare due sequenze che distano un certo numero di unità PAM l una dall altra. Ad es. la PAM12 può essere utilizzata per confrontare sequenze che distano 12 unità PAM. La entry (i,j) della matrice PAM12 contiene lo score assegnato alla coppia di aminoacidi (Ai,Aj); tale score è proporzionale alla frequenza con cui ci si aspetta che Ai sostituisca Aj in due sequenze che distano 12 unità PAM.

33 Tutte le matrici della serie sono derivate per moltiplicazione della matrice unitaria (PAM1): PAM1 X PAM1 = PAM3 = 3 sostituzioni su 1 siti (~ 75% identità) PAM12 = 12 sostituzioni su 1 siti (~ 4% identità) PAM25 = 25 sostituzioni su 1 siti (~ 2% identità) Nb alcune sostituzioni riportano al dato originale! PAM2

34 PAM % identità 1% 99% 75% 6% 11 5% 2 25% 25 2% se due sequenze sono filogeneticamente distanti è opportuno usare matrici PAM con indici più alti, e viceversa

35 Matrice PAM 12 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V

36 Matrici BLOSUM (Henikoff e Henikoff 1992) Derivano, usando lo stesso metodo usato per quelle PAM, dalla banca dati BLOCKS contenente gli allineamenti delle regioni più conservate di famiglie di proteine. Per ogni tipo di matrice BLOSUM si eliminano tutte le sequenze che hanno una percentuale di identità superiore ad una soglia. BLOSUM62 = derivata da un allineamento in cui le sequenze che abbiano più del 62% di amminoacidi identici vengono considerate come una sola sequenza

37 I valori nelle matrici di sostituzione determinano il punteggio di un allineamento Score allineamento: 15 Seq1 Seq2 V D S - C Y V E S L C Y Score Blosum6 2 Punteggiototale= somiglianze penalità gap

38 Needelman-wunsch all globale

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46 Schemi di peso per i gap Linear score f(g)= -gd con d gap-open penalty e g lunghezza del gap Un peso dei gap dipendente dalla sola lunghezza comporta che due gap isolati diano lo stesso costo di due consecutivi Affine score f(g)= -d (g-1)e con d gap-open penalty, e gap-extension penalty e g lunghezza del gap Modello di transizione da una sequenza all altra biologicamente più significativo, dal momento che inserzioni e cancellazioni di più di un residuo non sono eventi poco comuni tra sequenze proteiche omologhe 55

47 Significato strutturale ALFAELICAUNO-----ALFAELICADUE ALFAELICAUNOLOOOPALFAELICADUE Loop Alfa elica Alfa elica

48 Allineamento globale vs locale L allineamento di due o più sequenze può essere globale o locale Globale: l intera sequenza viene allineata Locale: solo frammenti della sequenza vengono allineati 57

49 Allineamento locale: esempio LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKA LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKA 58

50 Allineamento locale E meglio avere molte coincidenze sparse o averne meno, ma concentrate? Allineamento locale Date S e T trovare due sottostringhe v e w di S e T rispettivamente la cui similarità (allineamento ottimo) sia massima su tutte le coppie di sottostringhe di S e T. 59

51 Significato Biologico Allineamento globale Allineamento locale

52 Ordine di un Algoritmo 61

53 Confronto di sequenza query e l'intera banca dati FASTA per allineamenti globali BLAST- per allineamenti locali

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57 FASTA Sistema di ricerca in banca dati di sequenze simili ad una di nostro interesse

58 FASTA: usa le lookup tables Tabelle formate dalle differenze in posizione di singoli aminoacidi

59 Procedura simile alla costruzione di dot-plot ma meno richiestiva sul calcolo Lookup: O (n+m) Matrice: O (nm)

60 Matrice di parole A G W W R A A W A A R G W A G A G W W R A G W A A

61 Matrice di parole 13 Coppie di parole identiche di lunghezza 2 A G W W R A A W A A R G W A G A G W W R A G W A A Parola 2

62 Matrice di parole 13 Coppie di parole identiche di lunghezza 2 A G W W R A A W A A R G W A G A G W W R A G W A A Parola 2

63 FastA Sequenza A > Sequenza A > Sequenza B > Sequenza B > Matrice di punti Matrice di parole di lunghezza 2

64 Unione parole contigue Sequenza A > Sequenza A > Sequenza B > Sequenza B >

65 Calcolo similarità Sequenza A > Sequenza A > Sequenza B > Sequenza B >

66 Inserimento gaps Sequenza A > Sequenza A > Sequenza B > Sequenza B >

67 Calcolo Opt Sequenza A > Sequenza B >

68 FASTA- pipeline

69 Parole con errori Nessuna parola identica di lunghezza 3 LTAGARIDEDWEDISLHDWRTDW TSGCRKDEWWTWDSIHSTQWSD E D W Parole lunghezza 3 E W W Identiche con 1 Errore EDWL EWWA Parole lunghezza 4 Identiche con 2 Errori LTAGARIDEDWEDISLHDWRTDW TSGCRKDEWWTWDSIHSTQWSD 1 Parole lunghe 3 con 1 errore ammesso LTAGARIDEDWEDISLHDWRTDW TSGCRKDEWWTWDSIHSTQWSD 18 Parole lunghe 4 con 2 errori ammessi

70 Ricerca per similarità Una delle operazioni più comuni ed utili su una base di dati biologica è la ricerca di sequenze simili ad una sequenza data in input. Il tool più popolare per questo tipo di ricerche è BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). BLAST esegue confronti fra coppie di sequenze alla ricerca di regioni di similarità, piuttosto che un allineamento globale tra le intere sequenze. BLAST può eseguire migliaia di confronti fra sequenze in pochi minuti e in poco tempo è possibile confrontare una sequenza query con l intero database per ricercare tutte le sequenze simili ad essa.

71 Come funziona BLAST? Ecco i passi dell algoritmo di BLAST: 1- Si estraggono tutte le possibili word di m lettere dalla sequenza query (m=3 per le proteine, m=11 per il DNA). 2 Per ogni word della sequenza da esaminare viene costruita una lista di possibili words che, se confrontate con la sequenza in questione, hanno un punteggio superiore ad un valoresoglia T (compreso fra 11 e 15) calcolato di volta in volta in base alla composizione e alla lunghezza della sequenza in esame.

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73 Come funziona BLAST? (2) 1. Si confronta la lista di words con le sequenze contenute nel database alla ricerca di matches esatti: 1. Quando viene riscontrata una corrispondenza (hit), essa viene estesa a monte e a valle per vedere se è possibile definire un tratto di sequenza in grado di raggiungere un punteggio superiore ad un valore-soglia S.

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77 Come funziona BLAST? (3)

78 NCBI BLAST L implementazione più popolare dell algoritmo BLAST si trova sul sito dell NCBI: Sono disponibili numerosi tipi di BLAST; tra cui vale la pena di citare: BLASTN (Nucleotidi Nucleotidi); BLASTP (Proteine - Proteine); TBLASTN (Translated BLAST Nucleotide); BL2SEQ (Blast 2 sequences).

79 BLASTN: Esempio con BCL2 Selezioniamo nucleotide blast Inseriamo la sequenza (o scegliamo un file da uploadare) Scegliamo database e organismo Scegliamo il programma giusto (blastn)

80 BLASTN: Esempio BCL2 BLAST fornisce in output la distribuzione dei matches trovati, assegnando a colori diversi i diversi scores: ovviamente uno score maggiore indica un match più significativo. Cliccando sulle barre colorate si ottiene l allineamento corrispondente.

81 BLASTN: Esempio BCL2 L allineamento migliore mostra un match del 1%: abbiamo ritrovato lo stesso BCL2 nel database. Abbiamo il link alla sequenza trovata ed alla pagina corrispondente in Gene. Un trattino indica il match dei caratteri delle due sequenze.

82 BLASTN: Esempio BCL2 L assenza del trattino invece indica un mismatch:

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84 Punteggio sequenze random Numero Sequenzec 7 asuali 6 5 Opt = Punteggio OPT

85 Punteggio sequenze random Numero Sequenzec 7 asuali 6 5 Opt = Punteggio OPT

86 Significatività statistica Numero Sequenzec 7 asuali 6 5 Opt = Punteggio OPT

87 Significatività statistica Numero Sequenzec 7 asuali 6 5 E = E value = Numero atteso per caso di sequenze con punteggio > opt Punteggio OPT