Come si sceglie l algoritmo di allineamento? hanno pezzi di struttura simili? appartengono alla stessa famiglia? svolgono la stessa funzione?

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1 Come si sceglie l algoritmo di allineamento? Domande: le due proteine hanno domini simili? hanno pezzi di struttura simili? appartengono alla stessa famiglia? svolgono la stessa funzione? hanno un antenato comune?

2 La risposta determina se è opportuno procedere ad un allineamento globale o locale quale algoritmo di allineamento è opportuno utilizzare quale matrice di somiglianza è opportuno utilizzare quali punteggi si attribuiscono a omologie apertura di gaps lunghezza dei gaps,...

3 Descrizione di un generico algoritmo di allineamento Siano date due sequenze, S 1 e S 2, formate rispettivamente da N 1 e N 2 monomeri (amino acidi o basi nucleotidiche) In assenza di gaps (es: Dot plot) # confronti ~ N 1 *N 2 In presenza di gaps arbitrariamente lunghi # confronti ~ Programmazione Dinamica si assegna un punteggio # ragionevole di confronti

4 MVHLTDAEKAbbAVSCLWGKVNSDEVGGEALGRLLVVYPWTQRYFDSFGDLSSASAIMGNAK VKAHGKKVITAFNDGLNHLDSLKGTFASLSELHCDKLHVDPENFRLLGNMIVIVLGHHLG KDFTPAAQAAFQKVVAGVATALAHKYH MALWTRLRPLLALLALWPPPPARAFVNQHLCGSHLbbVEbALYLVbCbbGbbbbbERGFF YTPKARREVEGPQVGALELAGGPGAGGLEGPPQKRGIVEQCCASVCSLYQLENYCN HLTDAEKAbbAVSCLWGKVNSDEVG HLbbVEbALYLVbCbbGbbbbbERG MLPSLALLLLAAWTVRALEVPTDGNAGLLAEPQIAMFCGKLNMHMNVQNGKWESDPSGTK TCIGTKEGILQYCQEVYPELQITNVVEANQPVTIQNWCKRGRKQCKTHTHIVIPYRCLVG EFVSDALLVPDKCKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSEKSTNLHDYGMLLPCGIDKFR GVEFVCCPLAEESDSVDSADAEEDDSDVWWGGADTDYADGGEDKVVEVAEEEEVADVEEE EADDDEDVEDGDEVEEEAEEPYEEATERTTSTATTTTTTTESVEEVVRVPTTAASTPDAV DKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRERMSQVMREWEEAERQAKNLPKADKKAVIQHF QEKVESLEQEAANERQQLVETHMARVEAMLNDRRRLALENYITALQAVPPRPHHVFNMLK KYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRVIYERMNQSLSLLYNVPAVA EEIQDEVDELLQKEQNYSDDVLANMISEPRISYGNDALMPSLTETKTTVELLPVNGEFSL DDLQPWHPFGVDSVPANTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNIKTEEISEVKMDAEF GHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVITLVMLKKKQYTSIHHGV VEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN

5 Assegnazione del punteggio Si determinano: e f 1 2 a a i j frequenza di occorrenza della coppia di amino acidi (o basi) a i a j nelle due sequenze, 1 e 2, (e=esperimento) r f 1 2 a a i j frequenza di occorrenza della coppia di amino acidi (o basi) a i a j in due sequenze, 1 e 2, non-correlate o randomizzate (r) (tenendo conto della frequenza di occorrezza di ognuno dei due elementi della coppia nelle sequenze analizzate) MATRICE di SOSTITUZIONE (odds scores) O a a i j f f e 1 a a i r 1 a a i 2 j 2 j

6 Esempio: 100 uomini 90 hanno bevuto vino durante la scorsa settimana 100 donne 20 hanno bevuto vino durante la scorsa settimana L odds (la quotazione) per un uomo che abbia bevuto vino è 9:1 L odds (la quotazione) per un donna che abbia bevuto vino è 1:4 L odds-ratio è (0.9/0.1)/0.2/0.8)= 36 Anche se gli uomini che hanno bevuto vino sono 90/20=4.5 volte più delle donne Per questo si usa il logaritmo dell odds infatti Log 1/36=- Log36/1= più vicino a 4.5 in valore assoluto

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8 Si attribuisce un punteggio negativo all apertura di un gap W( x) g r x x : lunghezza del gap oppure W( x) g r( x 1) si noti W( x) x W(1) Calcolo del punteggio positivo per una coppia di sequenze si moltiplicano (eventi indipendenti) gli O per ogni coppia di a.a. si sommano i logo per ogni coppia

9 La Matrice di Punteggio determina il tipo di allineamento Punteggio positivo a qualsiasi associazione Piccola penalitá per l apertura di un gap, g Allineamento Globale Penalità per la lunghezza del gap, r Punteggi negativi per i mismatches Penalitá elevata per l apertura di gaps Allineamento Locale Piccola (o nulla) penalità per la lunghezza N.B. Piccoli cambiamenti nel modo di attribuire i punteggi possono trasformare un algoritmo di allineamento globale in uno di allineamento locale e viceversa

10 V E D Q K L S K C N V 10 E 10 N 10 K L 10 T R P K C 10 D 10 N 1 = n = 11 N 2 = m = 10

11 Regole per riempire la matrice di n righe e m colonne: dato un S i,j 1. si individua S max i,j = max (S k>i, l>j ) 2. si aggiunge S max i,j a tutti gli S k,l per i quali k<i e l<j Esempio i (righe) = 10 j (colonne) = 2 S i,j = S 10,2 = 0 S max i,j = max (S k>i, l>j ) = S 11,3 =10

12 V E D Q K L S K C N V 10 E 10 N 10 K L 10 T R P K C 0 10 D 10 N 1 = n = 11 N 2 = m = 10 S 11,3 =10

13 V E D Q K L S K C N V 10 E 10 0 N 0 10 K L 10 0 T 0 R 0 P 0 K C D 10 0 i = 10 j = 2 S max i,j = max (S k>i, l>j )= S 11,3 = 10

14 V E D Q K L S K C N V 20 E N K L T 10 0 R 10 0 P 10 0 K C D 10 0 i = 10 j = 2 S max i,j = max (S k>i, l>j )= S 11,3 = 10

15 V E D Q K L S K C N V E N K L T R P K C 10 D 10 0 i = 9 j = 8 S max i,j = max (S k>i, l>j )= = S 10,11 =10

16 Una volta riempita la matrice la regola per trovare il miglior allineamento è: partendo dall angolo in alto a sinistra si uniscono le celle con i punteggi più alti con la condizione se i,j sono gli indici della cella che precede e k,l quelli della cella che segue allora si deve sempre avere i<k e contemporaneamente j<l

17 V E D Q K L S g g K C N V E g N K L T R P K C D V E D Q K L S K C N V E N K L T R P K C D

18 Matrici di similaritá

19 Matrici di punteggio o Matrici di sostituzione Le matrici PAM di Margaret Dayhoff (1978) PAM : Accepted Point Mutation (pseudoacronimo) Una matrice PAM é una misura della probabilitá che una certa sostituzione sia avvenuta dopo che é trascorso un certo tempo evolutivo dato L ipotesi é quella di divergenza evolutiva: sequenze con un comune progenitore sono tanto piú diverse quanto piú tempo é trascorso da quando si sono differenziate Le matrici sono costruite sotto ipotesi di processo Markoviano: La trasformazione in un sito specifico dall a.a. a all a.a. b non dipende dalla storia precedente dalla posizione lungo la sequenza

20 Definizione di unità PAM Due sequenze S 1 e S 2 sono considerare divergere di un unità PAM se il numero di mutazioni puntuali accettate (escluse le inserzioni e le delezioni) che hanno trasformtno S 1 in S 2 sono in media una ogni 100 aminoacidi. Mutazione accettata = mutazione passata alla progenie ovvero Mutazione accettata = mutazione indifferente o favorevole Si noti che due sequenze che divergono per una unità PAM non differiscono dell 1% perchè una singola posizione può essere sottoposta a più di una mutazione accettata. La differenza tra i due concetti cresce al crescere delle unità PAM.

21 Le sequenze studiate appartengono ad organismi attualmente viventi, ovvero non si conoscono le sequenze ancestrali. Questo problema è risolto supponendo che: a) la probabilità di mutazione è identica nelle due direzioni P( aai aa j ) P( aa j aai ) b) le matrici PAM godono della proprietà di additività. Ovvero date due sequenze S i and S j il cui ancestore sia S ij allora d( SiS j ) d( SiSij) d( S jsij) dove d(i,j) è la distanza PAM tra le sequenze i e j.

22 Preparazione delle matrici di Dayhoff Stima delle sostituzioni (tra coppie di aminoacidi): 1572 cambiamenti in 72 gruppi di sequenze che siano simili almeno all 85% Sostituzioni presenti in proteine strettamente correlate (gruppi) la mutazione non ha modificato la funzione la mutazione è stata accettata dalla selezione naturale accepted point mutation: PAM

23 Esempio di allineamento Immunoglobulina domini della regione C

24 Uno dei 72 allineamenti di gruppi di sequenze strettamente correlate che hanno contribuito alla formazione dei punteggi PAM. (Adapted from Alignment 30. Atlas of Protein Sequence and Structure, Suppl 3, 1978, M.O. Dayhoff, ed. National Biomedical Research Foundation, 1979.)

25 Una matrice di mutazione, M, è costituita dalle probabilità di mutazione di un amino acido per un periodo evolutivo definito. Pr amino acido i amino acido j =M ji La matrice di mutazione PAM1 si riferisce ad un tempo evolutivo in cui in media si siano modificati l 1% degli amino acidi. Matematicamente questo corrisponde ad una matrice tale che 20 i 1 f i (1 M ii ) 0.01 Dove f f i è la frequenza dell ith amino acido nel campione in studio, il vettore ( f1, f2,..., f20) descrive la frequenza «naturale» degli a.a., per cui. 20 i 1 f i 1 Gli elementi diagonali, M ii, rappresentano la probabilità che un dato amino acido non cambi

26 ACGH ABGH DBGH DBGH ABGH ACGH ADIJ ABIJ CBIJ CBIJ ABIJ ADIJ ABIH ABGH ABIH ABIJ ABIJ ABIH ABGH Albero filogenetico ipotetico. Le quattro proteine studiate sono mostrate in alto. Gli antenati supposti sono mostrati nei nodi sotto e i cambiamenti di sequenza lungo i rami. (Adapted from Figure 78. Atlas of Protein Sequence and Structure, Suppl 3, 1978, M.O. Dayhoff, ed. National Biomedical Research Foundation, 1979.)

27 Mutabilità Calcolo della mutabilità relativa Sequenze allineate Amino acidi ADA ADB A B D Sostituzioni osservate Composizione Mutabilità relativa La mutabilità è calcolata normalizzando il numero di sostituzioni osservate al numero di occorrenze di un dato aminoacido. (adapted from Figure 81. Atlas of Protein Sequence and Structure, Suppl 3, 1978, M.O. Dayhoff, ed. National Biomedical Research Foundation, 1979.)

28 Phe Tyr 0.15/0.04 = 3.75 frequenza nel gruppo Tyr Phe 0.20/0.03 = [(Log Log6.7)/2]=7 valore in Tabella # volte a i a j * mutabilitá relativa la somma dei 20 termini è normalizzata a 1

29 Log Odds Matrix per una distanza evolutiva di 250 PAM

30 I piú mutabili I meno mutabili Asn, N, Ser, S, Thr, T, Ala,A Cys,C, Trp, W Punteggio 0 Punteggio 0 Frequenza aspettata Frequenza aspettata es: il passaggio Gly Trp si verifica raramente punteggio = -7 La scelta della PAM dipende dal tempo di divergenza evolutiva ipotizzato 1 PAM ~ 10x10 6 anni = 10 my PAM250 per allineare sequenze con circa il 14-27% di similaritá PAM120 per allineare sequenze con circa il 40% di similaritá PAM80 per allineare sequenze con circa il 50% di similaritá PAM60 per allineare sequenze con circa il 60% di similaritá

31 Matrice delle distanze: costo delle mutazioni La matrice è generata calcolando il numero minimo di cambiamenti da fare nelle basi del codone per trasformare l amino acido nella riga i nell amino acido nella colonna j. Notare che la trasformazione Met Tyr è l unica che richiede che siano modificati tutti e tre i codoni

32 Leu: UUA; UUG; CUU;CUC;CUA;CUG Min ACA; ACG; ACU;ACC;ACA;ACG Thr: ACU;ACC;ACA;ACG

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36 Calmodulina 8 motivi quasi-ripetuti: 148/20 ~ 2x148/36 ~ 4x148/73 ~ 8 M 33 (r) r Sequenza defettiva dell Acido Glutammico, E

37 Calmodulina Tr(M r ) r Intera sequenza amino-acidica

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