Lezione 6. Confronti fra sequenze: distanze, allineamenti

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Guido Bernasconi
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1 Lezione 6 Confronti fra sequenze: distanze, allineamenti

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3 Sostituzioni nucleotidiche La distanza tra due sequenze si definisce come il numero atteso di sostituzioni nucleotidiche per sito. Se il tasso di evoluzione è costante nel tempo la distanza crescerà linearmente con il crescere del tempo di divergenza. AATGAAAGAA ACTGGAGGAA 10 siti; 3 differenze Una semplice misura di distanza è la proporzione dei siti differenti (a volte chiamata distanza p) 10 siti; 3 differenze distanza = 30% = 0.3

4 Sostituzioni nucleotidiche AATGAAAGAA 10 siti; 3 differenze ACTGGAGGAA distanza = 30% = 0.3 Questa proporzione grezza funziona per sequenze che sono molto vicine evolutivamente. Se è passato molto tempo dalla divergenza, p sottostima il numero di sostituzioni che sono realmente avvenute. Un sito variabile può originarsi attraverso più percorsi e perfino un sito uguale in due sequenze può nascondere retro sostituzioni o sostituzioni parallele. Sostituzioni multiple nascondono alcuni cambiamenti, perciò p non è una funzione diretta del tempo evolutivo. La proporzione grezza p può essere usata solo se p < al 5%

5 Distanze fra sequenze Per N siti ed n differenze: grado di divergenza = n/n AATGAAAGAA 10 siti; 3 differenze ACTGGAGGAA divergenza = 0.3 o 30%

7 Distanze fra sequenze Complichiamo lo scenario: correggiamo per multiple hits I modelli di Jukes e Cantor, Kimura, Tamura e Nei etc. possono essere usati oltre che per prevedere l evolversi di una sequenza, anche per valutare la distanza fra due sequenze originatesi da una divergenza

8 non coding sites Modello di Jukes e Cantor (1969) d: numero di sostituzioni per sito dal momento della divergenza p: proporzione osservata di siti differenti tra due sequenze

9 non coding sites Modello di Kimura 2 parametri (1980) d d: numero di sostituzioni per sito dal momento della divergenza (se P e Q sono uguali si torna all equazione di JC)

10 non coding sites Esempio: rrna 12s mtdna Da Yang computational molecular evolution Oxford University Press 2006

11 non coding sites Esempio: JC69 rrna 12s mtdna K2P80 N= ( ) + ( ) = 948 p= ( )/948= 90/948= P = transiz = ( )/948 =84/948=0.088 Q= trasv= ( )/948 = 6/948 = JC69 : d = K2P80: d = La differenza è minima Da Yang computational molecular evolution

12 non coding sites Aumentiamo la divergenza: N= 948 p= 500/948 = P = transiz = 400/948 = Q= trasv= 100/948 = JC69 : d = 0.91 K2P80: d = 1.55 K2P80 JC69 La differenza tra le due stime aumenta all aumentare della divergenza Se c è un alto livello di divergenza e, soprattutto, se ci sono motivi a priori di pensare che il tasso di transizione differisca da quello di trasversione è meglio considerare modelli più complessi di Jukes and Cantor

13 coding sites Calcolare il numero di sostituzioni tra due sequenze codificanti proteine è più complesso perché è necessario distinguere tra sostituzioni sinonime e non sinonime

14 coding sites Seq1 Seq2 Non Sin Ser Thr Glu Met Cys Leu TCA ACT GAG ATG TGT TTA TCG ACA GAG ATA TGT CTA Ser Thr Glu Ile Cys Leu Sin Sin Sin Basta contare? NO: Problemi con il denominatore

15 coding sites Perché non basta contare? sinonimo Non sinonimo 1. La classificazione dei siti cambia nel tempo

16 coding sites Perché non basta contare? Sinonimo Non sinonimo 2. Alcuni siti non sono solo sinonimi o solo non sinonimi, dipende da come mutano

17 coding sites Seq1 Seq2 Non Sin Ser Thr Glu Met Cys Leu TCA ACT GAG ATG TGT TTA TCG ACA GAG ATA TGT CTA Ser Thr Glu Ile Cys Leu Sin Sin Sin Basta contare? NO: Problemi con il numeratore

18 coding sites Problemi col numeratore: Esempio: quando due codoni omologhi differiscono per due o più sostituzioni l ordine delle sostituzioni deve essere conosciuto per classificare il sito come sinonimo o non sinonimo. Esempio: CCC nella sequenza 1 e CAA nella sequenza 2 La classificazione dei siti dipende dall ordine in cui le sostituzioni sono avvenute Percorso I: Percorso II: CCC (Pro) CCA (Pro) CAA (Gln) 1 sinonimo e 1 non sinonimo CCC (Pro) CAC (His) CAA (Gln) 2 non sinonimi

19 coding sites Basta contare? NO: possibili soluzioni Metodi di Miyata & Yasunaga (1980) e Nei & Gojobori (1986) Nei and Gojobori calculate average number of synonymous and nonsynonymous sites allowing particular sites to be a portion in each category (can also weight substitution pathway probabilities).

20 coding sites Basta contare? NO: possibili soluzioni 1. Consideriamo una posizione specifica in un codon. Se i è il numero di possibili cambiamenti sinonimi a quel sito allora lo conteremo come i/3 sinonimo e (3 i)/3 non sinonimo.

21 coding sites Metodi di Miyata & Yasunaga (1980) e Nei & Gojobori (1986) 1. Consideriamo una posizione specifica in un codon. Se i è il numero di possibili cambiamenti sinonimi a quel sito allora lo conteremo come i/3 sinonimo e (3 i)/3 non sinonimo. 2. Contiamo il numero di siti sinonimi e non sinonimi in ogni sequenza e calcoliamo la media tra le due sequenze. Il numero medio si siti sinonimi è N S e quello di non sinonimi è N A. 3. Classifichiamo le differenze in sinonime e non sinonime per due codon con 1 differenza è semplice GTC (Val) GTT (Val) > sinonimo GTC (Val) GCC (Ala) > non sinonimo per più di una differenza: considerare i diversi percorsi

22 coding sites Metodi di Miyata & Yasunaga (1980) e Nei & Gojobori (1986) 3. Classifichiamo le differenze in sinonime e non sinonime per più di una differenza: considerare i diversi percorsi (in che ordine sono avvenute le mutazioni?) Percorso I: CCC (Pro) CCA (Pro) CAA (Gln) 1 sinonimo e 1 non sinonimo Percorso II: CCC (Pro) CAC (His) CAA (Gln) 2 non sinonimi Approccio non pesato: Tutto è equiprobabile Nei and Gojobori Ma=differenze non sin: (1+2)/2 = 1.5 Ms=differenze sinonime: (1+0)/2 = 0.5 Approccio pesato Utilizza criteri che aiutano a decidere quali dei due percorsi sia più probabile Percorso II meno probabile (sin più frequenti di non sin) Ma= differenze non sin: (0.9*1) + (0.1*2) = 1.1 Ms= differenze sinonime: (0.9*1) + (0.1*0) = 0.9

23 coding sites Metodi di Miyata & Yasunaga (1980) e Nei & Gojobori (1986) 3. Classifichiamo le differenze in sinonime e non sinonime 4. Il numero di mutazioni sinonime per sito sinonimo p S = M S / N S Il numero di mutazioni non sinonime per sito non sinonimo p A = M A / N A Ma ricordate il problema delle multiple hits? > Usiamo Jukes e Cantor per correggere

24 coding sites Nei & Gojobori (1986)

25 Allineamenti Dan Graur : Lecture 18 ALIGNMENT OF NUCLEOTIDE & AMINO-ACID SEQUENCES Genes and Genomes: Fundamentals of Molecular Evolution

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