SCHEDA DI PROGETTO (MODELLO A) 4. Tipo di progetto Bando Affidamento diretto Sportello 1 2 x

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1 SCHEDA DI PROGETTO (MODELLO A) 1. Tematica/ Filiera Micotossine/ Cereali 2. Titolo Micotossine principali ed emergenti nei cereali 3. Acronimo MICOPRINCEM 4. Tipo di progetto Bando Affidamento diretto Sportello 1 2 x 3 5. Durata (mesi) Importo ( ) Costo totale Costo congruo 4 Finanziamento richiesto Finanziamento 5 concesso 7. Coordinatore di progetto Nome e Cognome Qualifica Istituzione di appartenenza Maria Grazia D Egidio Dirigente di ricerca CRA- Indirizzo Via Cassia Roma Tel/fax , mariagrazia.degidio@entecra.it

2 8. Istituzione proponente Denominazione: Consiglio per la Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura Indirizzo: via Nazionale 82, Roma Tel.: , Fax:, Enti pubblici: IBAN0 ABI CAB BIC N. di conto di contabilità speciale aperto presso la Tesoreria centrale e provinciale dello Stato ai sensi della legge , N. 720 di "Istituzione del sistema di Tesoreria unica per Enti ed Organismi pubblici". Enti privati: IBAN ABI CAB BIC Parole chiave 10. Descrizione del progetto Cereali, micotossine, micotossine emergenti, prevenzione, produzione, stoccaggio Sintesi del progetto 6 (abstract max. 1/2pag) Il progetto intende affrontare la problematica delle micotossine nei cereali, rivolgendo particolare attenzione alle micotossine emergenti, di interesse a causa della loro tossicità per uomo e animali. Lo studio consentirà di arrivare alla definizione di metodi validati con cui monitorare la presenza di tali composti sulla produzione cerealicola nazionale ed acquisire così informazioni attendibili sulla loro reale diffusione nei cereali. in Italia. Lo studio permetterà di disporre di dati per considerazioni attinenti la valutazione del rischio e la gestione dello stesso da parte degli organi preposti su questo gruppo di micotossine attualmente all attenzione della Commissione Europea. La problematica delle micotossine emergenti sarà affrontato, oltre che da un punto di vista analitico, con indagini fitopatologiche volte all individuazione delle specie fungine collegate che consentiranno di avere un quadro completo della incidenza di tutte le specie presenti e della loro distribuzione geografica in annate successive. Il progetto inoltre proseguirà nel monitoraggio per le principali micotossine già considerate a livello normativo negli areali agroclimatici nazionali di maggiore interesse per i diversi cereali, con particolare attenzione alle aree indicate a rischio, al fine di mantenere sotto costante controllo la produzione nazionale e al tempo stesso di indagare, a campione, la situazione a livello di importazione per evitare contaminazione del prodotto interno. Il problema delle micotossine nelle produzioni cerealicole nazionali sarà affrontato nel suo complesso, considerando anche le strategie più utili, per ciascun cereale, alla prevenzione ed al contenimento dello sviluppo dei composti tossici sia mediante sistemi agrotecnici in grado di diminuire i fattori di rischio sia mediante sistemi utili a livello di stoccaggio, fase della filiera particolarmente delicata che influenza significativamente la qualità igienico-sanitaria delle produzioni di cereali. I risultati ottenuti dai diversi approcci consentiranno di avere indicazioni valide per la definizione linee guida per gli operatori sia a livello sia di produzione che di stoccaggio Inquadramento del progetto negli obiettivi della programmazione del settore (max 1 pagina) La contaminazione da micotossine negli alimenti e mangimi è ormai riconosciuta, sia in ambito scientifico che legislativo, come prioritaria in termini di sicurezza alimentare a livello internazionale, a causa dell elevata diffusione e tossicità delle micotossine, del numero crescente di derrate alimentari riconosciuto passibile di contaminazione, dell impatto sanitario, economico, commerciale. La possibile contaminazione da micotossine rappresenta un noto fattore di rischio per la sicurezza d uso dei cereali e loro derivati di filiera in quanto le micotossine, appartenenti a classi di molecole diverse, hanno come denominatore comune i forti effetti negativi sulla salute dell uomo e degli animali e la persistenza lungo le catene alimentari.

3 Nell ultima decade si è assistito ad un significativo incremento, a livello mondiale (Goswami e Kistler, 2004), della presenza di patogeni fungini produttori di micotossine nelle coltivazioni cerealicole, con conseguente frequente contaminazione delle partite commerciali. Obiettivo primario nel settore dei cereali destinati sia all alimentazione umana, che alla zootecnia è quindi il controllo e la riduzione di questo fattore di rischio. Ridurre al minimo la contaminazione da micotossine è assolutamente necessario perché danneggia la salute dei consumatori e degli animali allevati, perché deprime fino ad annullarlo il valore economico del prodotto, perché ne limita l impiego e la commerciabilità. La prevenzione risulta essere ancora la migliore strategia, purché sia applicata su tutta la filiera, a partire dal campo e fino alle fasi di trasformazione in prodotti finiti. Un approccio possibile per il controllo del problema legato alla contaminazione da micotossine nei cereali è un monitoraggio costante. Le micotossine sono caratterizzate da una elevata stabilità che rende insufficienti, ai fini della decontaminazione e/o detossificazione, i normali processi impiegati nelle industrie alimentari come, ad esempio, i trattamenti fisici (calore) chimici (raffinazione) e biologici (fermentazione). Inoltre le micotossine una volta prodotte, permangono sul substrato anche dopo la morte del fungo tossigeno, pertanto l analisi e l identificazione delle specie fungine presenti non permette da sola di quantificare il rischio. Tra le principali malattie dei cereali, la fusariosi della spiga (FHB - Fusarium Head Blight) riveste un importanza notevole ai fini igienico-sanitari, essa ha un eziologia complessa in cui sono coinvolte diverse specie fungine appartenenti al genere Fusarium. La diffusione dei diversi generi-razze fungine e la sintesi di micotossine sono fondamentalmente influenzate dai determinanti climatici ed agro-ambientali delle macroaree di coltivazione ed in special modo dalle temperature e dall umidità; la problematica fusariosi della spiga, e conseguentemente possibile presenza di micotossine va pertanto seguita lungo tutte le fasi della filiera cerealicola in quanto risulta strettamente dipendente dall andamento climatico dell annata e dall ambiente di coltivazione., dalle tecniche colturali, dalle condizioni adottate nelle fasi di stoccaggio..il Regolamento CE 1126/2007 ha fissato i livelli massimi ammissibili per le Fusarium-tossine e più specificatamente il deossinivalenolo (DON) in cereali e prodotti derivati, lo zearalenone nei cereali e le fumonisine nel mais e prodotti derivati. A seguito di tale normativa, è particolarmente sentita la necessità da parte degli operatori del settore cerealicolo di migliorare nelle diverse filiere la qualificazione delle partite in funzione della destinazione d uso. Il consumo di cereali è alla base dell alimentazione dell uomo e degli animali. Gran parte del territorio agricolo italiano è destinato ai cereali, che occupano una superficie di circa 4 milioni di ettari. Il frumento duro rappresenta la coltura principale del Meridione in particolare, dove spesso viene coltivato in aree agricole nelle quali non sussistono valide alternative colturali. Dalle regioni meridionali proviene infatti gran parte del frumento duro, che costituisce la materia prima fondamentale per la produzione delle paste alimentari, e per il quale in nostro Paese è il maggiore produttore europeo e mondiale. La coltura del frumento tenero (Triticum aestivum L.), utilizzata prevalentemente per la panificazione, è concentrata soprattutto nel Centro-Nord e copre solo in parte il fabbisogno nazionale. Il nostro Paese si colloca ai primi posti, su scala internazionale, anche per la produzione di mais (Zea mays L.), coltura diffusa nelle aree settentrionali, soprattutto in Veneto e Lombardia, e destinato in larga misura all alimentazione a- nimale. Negli ultimi decenni, tuttavia, la distribuzione tradizionale delle colture cerealicole nell ambito del territorio agricolo nazionale ha visto un cambiamento dovuto soprattutto ad un progressivo spostamento della coltivazione del frumento duro dalle regioni meridionali ed insulari, dove prima era esclusivamente localizzata, verso le regioni dell Italia centro-settentrionale, spesso in sostituzione del frumento tenero. Tale fenomeno ha portato gli agricoltori a dover affrontare nuove problematiche, legate soprattutto alla capacità di adattamento di questo cereale a situazioni climatiche diverse da quelle di origine, per le quali la ricerca legata al miglioramento genetico ha fornito sicuramente un grande contributo soprattutto in relazione agli aspetti agronomici, fitopatologici e qualitativi Stato dell arte generale sull argomento del progetto (max ½ pagina) 7 Le micotossine sono metaboliti secondari a basso peso molecolare prodotti da muffe o funghi filamentosi che colonizzano i cereali in determinate condizioni climatiche e di stress della pianta. Tra i cereali, sicuramente le colture maggiormente a rischio sono il mais ed il frumento che, se coltivati in areali a clima umido e con piovosità frequenti e intense, possono costituire una fonte di rischio sia per gli animali che per la salute pubblica

4 I composti chimici noti con il nome di micotossine sono sostanze ad azione tossica prodotte, in particolari condizioni ambientali, da numerose specie di funghi filamentosi microscopici (Krogh, 1987; Smith, 1998; CAST, 2003).. La rilevanza sanitaria delle micotossine maggiori oggi è ben nota, mentre non è caratterizzato il rischio da micotossine emergenti quali gli alcaloidi dell ergot, la beauvericina, le enniatine, la moniliformina e la fusaproliferina, T2 e HT2, per le quali è necessario acquisire informazioni a livello nazionale più attendibili e circostanziate. Le azioni di controllo si sono finora concentrate su alcune classi di micotossine, in particolare deossinivalenolo (DON) e zearalenone (ZEA), fumonisine, aflatossine per le quali esiste già una normativa specifica; Attualmente, si ritiene necessario approfondire l aspetto relativo ai livelli di contaminazione delle nuove fusario-tossine i.e.t2 e H-T2, per le quali a breve si definirà il limite di legge. Problematica nuova è anche quella delle cosiddette masked mycotoxins, un gruppo di Fusarium tossine coniugate nelle quali la tossina è generalmente legata ad un composto più polare come il glucosio. Tali micotossine stanno acquisendo sempre più importanza in quanto sfuggono alla rilevazione durante l analisi routinaria; pur tuttavia la loro eventuale presenza è in grado di esercitare una azione tossica per rilascio del loro precursore tossico a seguito di idrolisi. Attualmente non esistono metodi di analisi validati per le singole micotossine emergenti, né per gruppi di micotossine associate, conseguentemente non sono disponibili dati a livello nazionale sulla possibile contaminazioae delle produzione cerealicola. L acquisizione di dati sperimentali che descrivano in modo rappresentativo la condizione del comparto cerealicolo è sicuramente il primo passo fondamentale per programmare qualsiasi azione preventiva o correttiva Obiettivi generali e specifici (intermedi e finali - max ½ pagina) Fornire un quadro complessivo del livello di contaminazione da micotossine nel mais e nei frumenti, anche in riferimento alle micotossine emergenti, attraverso l acquisizione di informazioni diffuse, comparabili e rappresentative delle diverse condizioni di coltivazione e stoccaggio. Obiettivi specifici sono: Individuazione di piani di campionamento idonei per le diverse realtà operative coinvolte Individuazione e validazione di metodiche analitiche adeguate per l analisi di micotossine emergenti Controllo sulla intera filiera produttiva attraverso l analisi delle micotossine in punti diversi affiancando metodologie robuste ma complesse(hplc) e metodi rapidi di più semplice gestione Ottenere informazioni affidabili sul livello di contaminazione delle principali micotossine emergenti in campioni pro venienti dalle diverse realtà operative (campi sperimentali, aziende, centri di stoccaggio e rappresentativi dei diversi areali agroclimatici italiani) Caratterizzare le specie di Fusaria presenti nei campioni contaminati provenienti dalle diverse aree geografiche Monitorare la presenza delle principali micotossine nelle produzioni nazionali di frumenti (DON)e di mais (fumonisine). Individuare la relazione e i fattori eco fisiologici che legano lo sviluppo dei funghi tossigeni all agrotecnica e all ambiente Definire strategie utili alla prevenzione e al contenimento della contaminazione a livello agrotecnico Definire strategie utili alla prevenzione e al contenimento della contaminazione a livello di conservazione e stoccaggio Validare modelli predittivi utili per indirizzare le scelte produttive e di filiera Monitorare la presenza di micotossine nei cereali d importazione al fine di evitare contaminazione delle partite nazionali sane - Mettere a punto un sistema dinamico di controllo del processo produttivo attraverso l individuazione e l analisi dei punti critici nella filiera; Disporre di elementi utili per l analisi del rischio e la predisposizione di linee guida a livello di produzione e di conservzione della granella Enti partecipanti al progetto 8 Consiglio per la Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura (CRA), Istituto Superiore di Sanità (ISS), Università di Torino, Università. Cattolica del S. Cuore di Piacenza(USC), Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Università di Padova Unità Operative UO1. CRA- Unità di ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali, Roma UO2. CRA- Unità di ricerca per la Maiscoltura, Bergamo UO3. CRA SCV-Unità di ricerca per la Selezione dei cereali e la valorizzazione delle varietà vegetali, S.Angelo Lod. UO4. CRA-GPG-Centro di ricerca per la Genomica e la Post-genomica, Fiorenzuola d Arda UO5. CRA-PAV- Centro di ricerca per la patologia Vegetale, Roma UO6. CRA-ING- Unità di ricerca per l Ingegneria Agraria, Roma

5 UO7 ISS- MIC- Laboratorio Micotossine e OGM, Roma UO8 CNR-ISPA- Istituto per le Produzioni Alimentari, Bari UO9 UNITO- AGRISELVITER associato a UNIPD UO10 UCS, Istituto di Entomologia e Patologia Vegetale, Piacenza Imprese Collaborazioni esterne 10.5 Piano di attività (max 10 pagine) 9 - Il progetto è organizzato in 5 WP, dei quali WP1 ewp2 con indirizzo più di ricerca, WP3 e WP4 di natura più direttamente applicativa ed infine il WP5 che sulla base dell analisi del rischio arriverà alla definizione e implementazione di linee guida utili alla prevenzione ed al contenimento dello sviluppo di micotossine W P n Titolo WP Attività e metodi Risultati UO Indicatori di verifica 0 coordinamento 0.1 Organizzazione di un comitato di gestione del progetto costituito dai responsabili delle diverse UUOO 0.2 Creazione di un database di raccolta dei dati prodotti dalle varie UU.OO del progetto 0.3 Organizzazione di incontri scientifici 0.4 Organizzazione di incontri divulgativi 1 Definizione e validazione di metodiche analitiche utili per la determinazione di micotossine nei cereali 1.1 Definizione e validazione di piani di campionamento per le micotossine Verifiche periodiche delle attività delle UUOO Gestione dei dati prodotti I dati che il progetto genererà, saranno raccolti in un opportuno data base e saranno trattati statisticamente. Organizzazione di incontri scientifici e tecnici in itinere e a conclusione del progetto a livello scientifico sia su base nazionale che territoriale Organizzazione di incontri tecnici a livello territoriale Preparazione di opuscoli divulgativi su supporto cartaceo e informatico L UO definirà piani di campionamento ad hoc specifici per le diverse realtà produttive che saranno oggetto dello studio. A tale proposito saranno prodotte e distribuite a tutte le UU.OO. coinvolte, procedure operative standard (POS) per il prelievo dei campioni. Nei diversi siti di campionamento oggetto dello studio (raccolto, centro di stoccaggio, nave o altro), differenziate a seconda della dimensione del lotto e delle attrezzature disponibili presso i siti di Accertare la rispondenza agli obiettiv prefissati Disponibilità di dati a livello istituzionale oltre che dei partecipanti al progetto Individuazione di correlazioni significative fra la presenza di micotossine e gli altri elementi che ne influenzano la presenza. Divulgazione capillare dei risultati ottenuti al modo scientifico Divulgazione capillare dei risultati ottenuti alla filiera cerealicola Produzione di Procedure Operative Standard (POS) sulla le modalità da seguire per l esecuzione di campionamenti ad hoc nelle diverse realtà operative Tutte le UUOO CRA, ISS con tutte le UUOO Tutte le UUOO Tutte le UUOO ISS Banche dati CD, fascicoli

6 campionamento. 1.2 Definizione delle metodiche analitiche per la determinazione di micotossine emergenti nei cereali Confronto di due piani di campionamento, seguendo la procedura stabilita dal regolamento 401/2006 e quella descritta nella norma ISO Messa a punto di metodi per la determinazione delle micotossine emergenti e delle micotossine mascherate Definizione di un piano di campionamento alternativo ad hoc da proporre alla filiera del settore cerealicolo che per la comparazione effettuata si sia distinto per vantaggi in termini di fattibilità, affidabilità e costi associati Produzione di protocolli di metodi di analisi per l analisi di micotossine emergenti, incluse le micotossine mascherate prevedendo, ove possibile, metodiche multimicotossina. ISS ISS ISPA Validazione di metodiche analitiche cromatografiche per la determinazione delle micotossine emergenti e delle micotossine mascherate Produzione di protocolli di metodi di analisi validati ISS 1.3 Studio di metodi rapidi e/o innovativi di indagine per l'accertamento delle micotossine e delle fitopatie fungine Valutazione comparativa di test rapidi multitossina disponibili commercialmente o presso le UUOO per la determinazione delle micotossine emergenti e validazione della prestazione con i metodi di conferma validati in Studio della rispondenza tra metodi Su campioni di frumento duro saranno utilizzati : Metodo di riferimento.il test immunoenzimatico ELISA (limite di sensibilità di 18,5 ppb e un recupero compreso fra l 85 % e il 110 %) sarà utilizzatoper determinare la contaminazione da DON. Analisi spettroscopica. Gli spettri in trasmissione saranno registrati, operando su granella (con il sistema di Sample Trasport di cui è provvisto lo strumento), con analizzatore NIT (Infratec 1241 Grain A- nalyzers - FOSS) che opera nel range nm ad intervalli di 2 nm, dotato anche di accessori per l analisi di prodotti a granulometria fine e rivelatore a silicio. Gli spettri in riflettanza saranno registrati, operando su campioni macinato con analizzatore NIR (NIR- Systems FOSS) che opera nel range nm ad intervalli di 2 nm, dotato di un modulo di trasporto del campione e rivelatore a SiO 2 nel range da 400 a 1098 nm e uno a PbS tra nm Validazione di metodi rapidi per la determinazione delle principali micotossine emergenti in termini di affidabilità, velocità ed economicità Fornire uno strumento analitico, che, attraverso una determinazione accurata e rapida, permetterà di valutare anche le caratteristiche igienico-sanitarie sulla granella conferita per lo stoccaggio e sullo sfarinato integrale ISS ISPA

7 Per l acquisizione degli spetti sarà utilizzato il software WinISI Project manager v Su campioni di mais si procederà a: i) Infezione con funghi micotossici mediate inoculo artificiale ii) applicazione di tecniche non distruttive basate su tecnologia NIR per misurare il grado di infezione da funghi; iii) rispondenza di tecniche NIR con analisi di laboratorio( HPLC e ELISA) per misurare il contenuto in micotossine Individuazione di metodi rapidi utili per screening di materiale resistente all attacco fungino; Analisi d immagine. A) acquisizioni di immagini digitali cromatiche (RGB) ad alta densità ottica e cromatica, attraverso sistemi da banco e portatili ad alta risoluzione. B) Applicazione di tecniche di analisi d immagine per l identificazione automatica delle cariossidi contaminate sulla base di variabili colorimetriche e variabili di forma. Sarà valutata anche l applicabilità a livello di foglia Validazione di metodi rapidi immunocromatografici per l analisi di ocratossina A nel frumento e per l analisi multi-micotossina in cereali (deossinivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT-2) in frumento e deossinivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT- 2, fumonisina B1 e B2 in mais) Disponibilità di metodi da utilizzare anche in campo o nelle linee di processo La procedura di validazione si articolerà nelle seguenti fasi. 1) Determinazione dei valori di recupero e di precisione della procedura di estrazione ai livelli target. 2) Determinazione della percentuale di falsi positivi/falsi negativi. 3) Analisi di campioni di frumento e mais naturalmente contaminati e confronto dei risultati ottenuti con un metodo cromatografico di riferimento (LC-MS/MS). ING ISPA 2 Strategie utili alla prevenzione ed al contenimento dello sviluppo di micotossine 2.1 Individuazione di sistemi agrotecnici utili alla prevenzione ed al contenimento dello Validazione di un metodo rapido (ELISA) per la determinazione di tossine T-2 e HT-2 in frumento e mais. 2.1.Messa a confronto di differenti agrotecniche (convenzionale, biologico, semina su sodo, concimazione, densità di La procedura di validazione prevederà l analisi di campioni naturalmente contaminati e confronto dei risultati ottenuti con un metodo cromatografico di riferimento (HPLC-FD o LC- MS/MS). 2.1.Messa a punto di tecniche colturali adatte al contenimento dei patogeni micotossigeni durante il ISPA UNITO SCV Pubblicazioni, schede e reports sui risultati

8 sviluppo di micotossine in frumenti e mais 2.2 Individuazione di sistemi innovativi di conservazione, stoccaggio e prime lavorazioni utili alla prevenzione ed al contenimento dello sviluppo di micotossine o o semina), per valutarne l influenza sulle caratteristiche produttive e igienico sanitarie Saranno saggiate varietà suscettibili e resistenti alla fusariosi per il DON ed eventualmente T2 e HT L attività che prevede il coinvolgimento di due o tre centri di stoccaggio modello, identificati tra quelli che partecipano alla Rete per lo stoccaggio differenziato, in differenti aree geografiche a rischio per i frumenti includerà: a) Silos tradizionali Monitoraggio e controllo della qualità igienico-sanitaria (analisi delle micotossine con metodiche rapide) nella struttura di stoccaggio su campioni prelevati con opportune modalità di campionamento al momento dello stoccaggio e durante la conservazione per periodi inferiori a due mesi (valutazione delle variazioni di umidità e temperatura e monitoraggio delle micotossine) per periodi superiori a 2 mesi nelle diverse modalità (tradizionale, refrigerazione forzata e atmosfera controllata) b) Silos orizzontali in polietilene. Monitoraggio e controllo della qualità igienico-sanitaria (analisi delle micotossine con metodiche rapide) nella struttura di stoccaggio su campioni prelevati con opportune modalità di campionamento al momento dello stoccaggio e durante la conservazione ad intervalli di 45 giorni valutando anche in diversi punti del silosbag e a diversi livelli della massa di granella eventuali variazioni di umidità e temperatura. 2.3 Modelli predittivi 2.3.L attività prevederà: a)scelta di 2 ceppi di ciascuno dei funghi maggiormente responsabili della produzione delle micotossine (nivalenolo, T2 e HT2 aflatossine; nell ambito della collezione disponibile presso l UO. ciclo colturale - Individuazione di nuovi strumenti agronomici per la prevenzione e il contenimento dello sviluppo delle micotossine dei cereali - Individuazione di nuove strategie colturali, intese come applicazione razionale degli strumenti agronomici per la prevenzione e il contenimento dello sviluppo delle micotossine dei cereali 2.2.Innovazione del sistema di stoccaggio e conservazione dei cereali per prevenire lo sviluppo di micotossine. La ricerca persegue la finalità di valutare gli effetti delle condizioni di stoccaggio sulla qualità igienico-sanitaria dei frumenti. Le indicazioni che potranno essere disponibili saranno utilizzate dal settore interessato per migliorare la fase di conservazione della granella con vantaggi per il consumatore intermedio e finale. Sviluppo di modelli revisionali per le micotossine emergenti UCS ottenuti dalla ricerca Analisi delle contaminazioni e loro confronto con serie storiche. Monitoraggio a stadi definiti dello stato della coltura e della corretta attuazione delle pratiche colturali. Analisi rapide dei risultati. L attività prevede valutazioni periodiche dello stato igienicosanitario della granella conservata nelle strutture di stoccaggio identificate in base agli o- biettivi della ricerca

9 3 Valutazione dell'incidenza delle principali micotossine utile per la costruzione di un sistema nazionale di valutazione del rischio 3.1 Valutazione dell'incidenza delle principali micotossine nei cereali, a livello di produzione nazionale, con particolare attenzione alle aree riconosciute a rischio 3.2 Valutazione dell'incidenza delle principali micotossine in cereali di importazione 3.3 Valutazione dell'incidenza di micotossine emergenti in frumento, mais e orzo nei diversi areali agroclimatici italiani b)studio delle diverse fasi del processo di infezione dei funghi in diverse condizioni di temperatura e umidità/acqua libera. Le prove saranno svolte in vitro, su substrato artificiale, e successivamente su spighe/granella. I dati ottenuti saranno utilizzati per la produzione di algoritmi per i modelli previsionali. c) I dati sulle micotossine ottenuti dalle diverse UUOO integrati con le informazioni relative ai parametri agroclimatici, consentiranno di verificare la rispondenza dei modelli predittivi sviluppati sulla insorgenza di situazioni fitopatologiche favorevoli allo sviluppo di Fusarium-tossici L attività prevede un monitoraggio delle principali micotossine presenti in frumenti e orzo (DON) e mais (fumonisine) utilizzando le reti di confronto varietale e prove on farm. Saranno inoltre reperiti campioni aziendali (convenzionale e biologico), allo scopo di fornire una panoramica dello stato fitosanitario delle produzioni nazionali Raccolta dati ai fini della caratterizzazione delle aree a rischio di contaminazione. 3.2.L attività prevede un monitoraggio delle principali micotossine presenti in frumento e orzo (DON) e mais (fumonisine) in partite di cereali importati. Saranno considerati i principali siti portuali attraverso i quali frumenti e mais arrivano in Italia. In collaborazione con i servizi fitosanitari nazionali il prelievo dei campioni sarà effettuato seguendo i piani di campionamento appositamente predisposti da ISS. 3.3.Monitoraggio tossine T-2 e HT-2 in frumento, mais e orzo con test ELISA e verifica in HPLC 3.1.Valutazione del contenuto in DON in frumento tenero, duro e orzo e in fumonisine nel mais Determinazione dei genotipi con minore resistenza allo sviluppo di micotossine Individuazione delle aree a rischio micotossine 3.2.Acquisizione di informazioni sulla contaminazione di micotossine. Adozione di misure di sicurezza per livelli di contaminazione elevati. Salvaguardia del prodotto nazionale sano Acquisire informazione sull incidenza di contaminazione SCV GPG SCV GPG SCV GPG ISPA Lista genotipi a minore rischio di contaminazione da micotossine Mappa del rischio di micotossine in frumento e mais Pubblicazioni dei risultati ottenuti

10 3.4 Valutazione della contaminazione delle principali micotossine nelle fasi di stoccaggio e di prima trasformazione La ricerca si propone di valutare in tempi diversi la qualità e lo stato igienico sanitario del prodotto sottoposto a conservazione, correlandolo al profilo termo-igrometrico a- dottato. Allo scopo, verranno utilizzate sia metodiche analitiche rapide (NIT, NIR) che test immunoenzimatici, per accertare la presenza delle principali micotossine: DON in frumenti e orzo, fumonisine in mais. L attività sarà estesa, per quanto possbile anche alle mcicotossine emergenti, in particolare T2 e HT Determinazione della qualità della granella in relazione a tempi e modalità di conservazione SCV Produzione di schede qualitative per lotti di frumento a diverse modalità di conservazione Valutazione del processo di pulitura a livello dei siti di conservazione e stoccaggio sulla contaminazione da DON e fumonisine Approfondimenti sui sistemi utili per l abbattimanto della contaminazione da micotossine Individuazione e reperimento di campioni di granella di orzo provenienti da stoccaggio tradizionale e in silos-bag. a differente livello di contaminazione da T2, HT-2; analisi mediante test ELISA seguendo lo sviluppo di DON, T2 e HT2 anche nella fase di maltazione in un sistema controllato per micro-malting Verifica del destino delle micotossine durante il processo di maltazione. GPG 4 Analisi della diffusione nelle aree a rischio dell incidenza delle principali specie fungine potenzialmente micotossigene. Verifica della correlazione tra presenza del fungo sulla pianta e contaminazione da micotossine 4.1 Attività a livello di pianta Monitorare la presenza di attacchi di fusariosi della spiga in campo per ottenere informazioni primarie circa la presenza, diffusione e incidenza della malattia nelle località a rischio. Ciò consentirà di conoscere meglio le dinamiche di attacco e proliferazione dei funghi a- genti causali di tale malattia, alcuni dei quali produttori di micotossine. Su campioni se- 4.1.Le indagini fitopatologiche e le corrispondenti analisi di laboratorio, consentiranno di avere un quadro completo, a livello nazionale, delle aree più a rischio di infezione. Identificazione delle specie/ceppi di Fusarium più diffusi in Italia e verifica dell loro potenziale rischio micotossigeno, UNIPD ING

11 lezionati si procederà anche all acquisizione di immagini ed analisi spettrale Effettuare campionamenti di materiale infetto in fase di emergenza (nel caso vengano rilevati sintomi riconducibili ad attacchi di mal del piede) e in fase di maturazione latteocerosa (se presente una sintomatologia riconducibile a fusariosi della spiga) al fine di i- dentificare precocemente le specie di Fusarium presenti. confrontando i dati rilevati in campo con le valutazioni dell incidenza delle principali micotossine. Individuazione di genotipi con maggior grado di tolleranza agli attacchi fungini Analizzare la relazione tra severità dei sintomi rilevati e concentrazione di DON (o altre micotossine emergenti) nelle cariossidi alla raccolta. 4.2 Attività a livello di seme Analizzare, in collegamento con il WP2, sistemi di prevenzione che prevedano l associa zione tra pratiche agronomiche e scelta varietale Analisi convenzionali Saranno eseguite analisi fitopatologiche convenzionali mediante il metodo della camera umida refrigerata su campioni provenienti dalle principali aree cerealicole italiane. Le principali specie fitopatogene verranno individuate su base morfologica mediante l osservazione diretta allo stereomicroscopio e microscopio ottico o in seguito a trasferimento su substrati nutritivi agarizzati. Particolare riguardo sarà rivolto allo studio della incidenza e distribuzione geografica di Fusarium langsethiae, specie produttrice di T2/HT2. Su campioni selezionati si procederà anche all acquisizione di immagini per analisi spettrali. Le analisi fitopatologiche condotte con metodi convenzionali consentiranno di avere un quadro completo della incidenza di tutte le specie fungine presenti e della loro distribuzione geografica in annate successive. Conoscenza di specie fungine considerate come secondarie, in quanto non direttamente coinvolte nella sindrome della fusariosi della spiga e correlazione con la presenza di micotossine, quali le enniatine, prodotte da specie di Fusarium (es: F. avenaceum) micotossigene finora poco studiate PAV ING Isolati di specie micotossigene riscontrati nel corso delle analisi saranno utilizzati per implementare la collezione esistente presso l UO;. in particolare sarà allestita una collezione di isolati di F. langsethiae quanto più ampia e diversificata, rappresentativa dei diversi areali produttivi del frumento. Tali isolati saranno caratterizzati per i principali parametri morfologici (aspetto delle colonie, forma e dimensione dei conidi) e fisiologici Disporribilità di un ampia collezione di isolati fungini micotossigeni come base per lo studio della biologia, epidemiologia e variabiltià genetica di specie micotossigene, in particolare F. langsethiae, specie poco nota ma di notevole interesse per la sua elevata capacità micotossigenica. PAV

12 (velocità di crescita, optimum di temperatura, produzione di micotossine in coltura artificiale) Analisi biomolecolari Sugli stessi campioni oggetto di analisi fitosanitarie, sarà quantificata la biomassa fungina delle principali specie micotossigene presenti all interno delle cariossidi con la PCR RealTime mediante l utilizzo di primer specifici. Sui campioni di cariossidi macinate, mediante utilizzo di un kit commerciale, sarà estratto il DNA per le successive amplificazioni. Il contenuto totale e la qualità del DNA ottenuto verrà valutata mediante fluorimetria. La quantità del DNA di specie fungine DON produttrici e di F. langsethiae sarà valutata mediante RealTime con la tecnica SybrGreen.I; valori di incidenza registrati con metodi convenzionali e molecolari saranno correlati tra loro e con la presenza delle principali micotossine presenti su cariossidi di cereali, quali i tricoteceni (DON, T2/HT2), valutata con tecniche immunoenzimatiche da altre UU.OO del progetto La quantificazione con metodiche biomolecolari costituisce un importante progresso nell ambito della diagnostica fitopatologica del seme. L elevata specificità dei primer utilizzati, la ripetibilità, la rapidità del metodo consentono di poter lavorare un elevato numero di campioni alla volta. Possibilità di effettuare screening varietali PAV Analisi delle principali specie fungine produttrici di tossine T-2 e HT-2 in Italia Analisi chimiche delle tossine T-2 e HT-2 in colture di Fusarium isolate da frumento naturalmente contaminato. Caratterizzazione fungine specie PAV ISPA 5 Controllo del processo produttivo attraverso l analisi dei punti critici nella filiera e la definizione di linee guida utili alla prevenzione ed al contenimento dello sviluppo di micotossine 5.1 Analisi e confronto di processi produttivi differenti in corso presso centri di stoccaggio e valuta-zione della loro efficacia. 5.2.Redazione di linee guida per specie (frumento tenero, frumento duro, mais) e per filiera (alimentare, zootecnica, speciale) 5.1.Messa a punto un sistema dinamico di controllo del processo produttivo attraverso l individuazione e l analisi dei punti critici nella filiera; 5.2.Definizione e implementazione di linee guida utili alla prevenzione ed al contenimento dello sviluppo di micotossine UNITO UUOO varie Analisi a scala di centro di stoccaggio e lotto delle contaminazioni. Confronto con serie storiche. Redazione di linee guida inserendo le nuove evidenze tecniche Ricadute e benefici del progetto 10 Complessivamente la ricerca si pone l obiettivo di attivare e mettere a disposizione un azione di monitoraggio diretta specificamente alla ricerca di micotossine non ancora normate (T2, HT-2), senza trascurare però quelle più diffuse lungo le filiere frumento, orzo e mais, focalizzandosi sulle fasi di raccolta e stoccaggio. La

13 caratterizzazione delle specie fungine eventualmente presenti può inoltre fornire informazioni per studi epidemiologici. L individuazione di strumenti agrotecnici e di strategie di produzione potrà fornire indicazioni utili per garantire alle produzioni cerealicole nazionali il rispetto dei limiti di commercializzazione con - Aumento della competitività della cerealicoltura nazionale - Aumento della redditività agli agricoltori e ai primi soggetti delle filiere - Apertura per produzioni di alto valore aggiunto (alimentari di pregio, baby food, cibi per celiaci, filiere biologiche) - Contributo alla crescita dei contratti integrati di filiera Ostacoli prevedibili ed azioni correttive Andamento meteorologico anomalo e compromissione della coltura cui si potrà far fronte con replica delle prove agronomiche in più luoghi e anni. Le competenze già acquisite dalle UUOO partecipanti in molti dei settori di indagine proposti, possono comunque costituire una buona garanzia di successo del progetto. I risultati verificabili al termine di ogni anno di progetto saranno uno strumento utile per la continuazione dell indagine in accordo a quanto predisposto nel piano iniziale. Qualora insorgessero difficoltà nella applicazione delle conoscenze e/o metodiche proposte, si apporteranno le dovute modifiche con decisione collegiale dei partecipanti al progetto, al fine di poter fornire i risultati attesi nei tempi indicati Diagramma tipo Gantt con articolazione temporale dei WP e delle attività previste 11 Attività I anno II anno III anno WP 0 WP 0.1 WP 0.2 WP 0.3 WP 0.4 WP WP WP WP WP WP WP WP WP WP WP 2.1 WP 2.2 WP 2.3 WP 3.1 WP 3.2 WP 3.3 WP WP WP WP 4.1 WP 4.2

14 WP inserire diagramma (es. tipo PERT) per la descrizione dei ruoli e delle modalità di interazione degli enti partecipanti di cui al punto Elenco degli strumenti tecnico-scientifici (attrezzature) funzionali alla ricerca proposta già in dotazione degli enti partecipanti (max. ½ pag) Descrizione Uso Unità operativa Seminatrici Semina prove parcellari, SCV, Mietitrebbia parcellare Operazioni di raccolta delle parcelle,, UNITO, SCV sperimentali e ottenimento campioni di granella Spandiconcime parcellare Gestione agronomica dei campi UNITO sperimentali Mulino da laboratorio Macinazione campioni per analisi, SCV,, ISS, ISPA, Sistema semiautomatico per test ELISA Analisi rapida micotossine UNI TO, UCS,, Spettrofotometro NIR Acquisizione spettri, SCV, Analizzatore NIT Analizzatore veloce, SAL Essiccatoio Essiccazione campioni Refrigeratori +4 C, -20 C e - Conservazione materiali, GPG, SCV, ISPA ISS 80 C Sistema automatico micromalting Preparazione di campioni di malto GPG Celle elettroforetiche orizzontali Frazionamento DNA GPG, PAV HPLC Sistema cromatografico per,, GPG SCV? analisi micotossine HPLC-FL/UV Sistema cromatografico per ISS UPLC/ MS-MS analisi micotossine LC-MS Analisi delle principali micotossine UNITO, ISPA Bilance di precisione Misure sperimentali Tutte le UUOO Microscopio, stereomicroscopio Analisi visive UCS, PAV,, ING, UCS spettrometro di immagini ING videocamere CCD e fotocamera ING digitale Scanner alta risoluzione ING 12. Elenco di strumenti tecnico-scientifici (attrezzature) che si intende acquistare con il presente finanziamento 12 Descrizione Motivazione Unità operativa acquirente

15 Nota generale Per la compilazione utilizzare carattere Times New Roman, non inferiore a 11, considerando che a tali criteri si riferisce la lunghezza massima delle parti testuali da compilare, ove indicato. Modello A (scheda di progetto) Riquadri Specificare denominazione e data di emanazione 2 Indicare estremi della richiesta di affidamento diretto 3 Indicare data della richiesta del progetto esecutivo 4 Riservato all ufficio 5 Riservato all ufficio Riquadri La sintesi può essere utilizzata dall ufficio per scopi informativi sulle attività finanziate 7 indicare anche il contributo innovativo allo stato dell arte derivante dal progetto 8 Elenco, descrizione e ruolo delle Unità Operative (U.O.), delle eventuali imprese partecipanti e collaborazioni esterne, queste ultime coinvolte nel progetto mediante consulenze o convenzioni, i cui eventuali costi/finanziamento sono da indicare alle voci C1 e C2 del Mod. B riquadro 4 9 l articolazione in WP deve comunque prevedere: - un WP coordinamento : esplicitare le modalità di coordinamento, che include le modalità di monitoraggio interno del progetto e la verifica dei risultati, ostacoli prevedibili ed azioni correttive - i WP riportanti la descrizione delle attività del progetto (WP n): per ogni WP devono essere indicati anche il ruolo delle UO coinvolte, incluse eventuali collaborazioni esterne, i risultati attesi e la tempistica delle azioni in esso previste; -un WP piano di sfruttamento dei risultati e ricadute che includa: pubblicazioni scientifiche tecniche e divulgative, la previsione di convegni e di preparazione di materiali didattici, corsi di formazione, eventuali brevetti ed ogni altra attività ritenuta utile alla divulgazione delle informazioni acquisite 10 descrivere l incremento di conoscenze derivante dal progetto e le ricadute dei risultati conseguibili nel settore di riferimento del progetto 11 Dal momento che è prevista una valutazione intermedia e finale (scientifica e finanziaria) in tutto l arco di vita del progetto, di norma non superiore a tre anni, la descrizione delle attività e dell impiego delle risorse umane e finanziarie deve essere espressa in relazione alle due fasi di vita del progetto (I e II periodo) con indicazione dei risultati intermedi (I periodo) e finali (II periodo) previsti. 12 Indicare le attrezzature che si intende acquistare; in caso di economie sarà consentito acquistare, previa autorizzazione, quelle riportate nell elenco, giudicate congrue ma non rientrati nel finanziamento; l importo totale deve essere riportato alla voce D) attrezzature del Mod. B riquadro 4.